فقط وفقط البروتينات ملزمة السيطرة على العمليات البيولوجية المتعددة. هذه الطريقة FLAG-Biotin CLIP-seq، وبالتالي لمحة عالمية عن الترتيب الخاص والزمني للرنا رنا و RBPs في خلايا الثدييات. هذه الطريقة تسمح بالكشف الفعال عن الرنا الرنا البروتينية المباشرة دون SDS-PAGE وإجراءات نقل الغشاء.
بالمقارنة مع التقليدية كليب-seq هو النظائر الحرة وأنها لا تتطلب الأجسام المضادة البروتين محددة. تبدأ من خلال طلاء حوالي 3 ملايين الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في لوحة 10 سم واحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة مع فراغ وعلاج الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.25٪ التربسين EDTA لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
إخماد التربسين مع أربعة ملليلترات من المتوسط MESC الطازجة، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. ثم، الطرد المركزي لهم في 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية وإزالة فائقة. تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة ونقلها مرة أخرى إلى لوحة 10 سنتيمترا لربط عبر.
يشع الخلايا بأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر، ثم نقل الخلايا المترابطة إلى أنبوب 15 ملليلتر. تدور أسفل هذه الخلايا في 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية، ثم إزالة supernatant وlyse الخلايا مع 500 ميكرولترات من العازلة A أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات. نقل الخلايا إلى RNAse خالية من 1.5 ملليلتر أنبوب, واحتضان لهم في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
علاج lysate مع 30 ميكرولترات من DNAse 1 في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، وقف رد الفعل عن طريق إضافة أربعة ميكرولترات من 0.5 EDTA الضرس. تدور أسفل بيليه غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 12، 000 مرات G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، ونقل سوبرنات إلى أنبوب جديد المبردة قبل 1.5 ملليلتر.
نقل الخلية إلى الخرز FLAG بعد توازنها، واحتضان العينة في أربع درجات مئوية أثناء تدوير لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الحضانة، الطرد المركزي الخرز لمدة دقيقتين في 3000 مرات G وإزالة عظمى. إضافة 500 ميكرولترات من العازلة A إلى العينة، ومحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم تدور أسفل الخرز وإزالة ناظر.
كرر الغسيل مع Buffer A ، تليها غسولتان مع المخزن المؤقت المبرد B.To مع ثلاث ببتيد FLAG ، وإعداد حل elution كما هو موضح في مخطوطة النص وتدور أسفل حبات FLAG. إزالة supernatant مع طرف ماصة نهاية ضيقة وإضافة 200 ميكرولترات من ثلاثة X FLAG حل elution لكل عينة. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف.
ثم تدور أسفل الخرز لمدة دقيقتين في 3000 مرة G.Transfer supernate إلى أنبوب جديد وتكرار elution مرتين. حفظ 5٪ من الأراضي الممَلَس لتحليل البقعة الغربية أو تلطيخ الفضة للتحقق من كفاءة علم المناعة FLAG. نقل المزائلين المسحوبة إلى الخرز streptavidin المعدة وتدوير العينات بلطف في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها.
ثم، وجمع الخرز على موقف مغناطيسي وإزالة افرا. اغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من Buffer C مع دوران لطيف لمدة خمس دقائق لكل غسل. المقبل، وغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة D، ومرتين مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK العازلة، وجمع الخرز على المنصة المغناطيسية وإزالة supernatant في بين يغسل.
لإجراء الهضم الجزئي للرنا، أضف 100 ميكرولترات من محلول MNA لكل عينة ودوامة مضنية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع خلاط حراري لمدة 10 دقائق. جمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 ثانية وإزالة supernatant. ثم قم بغسلها بمخزن PNK-EDTA المؤقت، و Buffer C، و PNK buffer وفقاً لتوجيهات المخطوطة.
جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وإزالة العازلة. ثم، إضافة مزيج التفاعل CIP ودوامة الخرز في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة 10 دقائق. سرعان ما يغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK EDTA العازلة، تليها اثنين من يغسل مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK العازلة.
بعد يغسل، إضافة 40 ميكروليتر من ثلاثة مزيج ربط الرابط رئيس إلى الخرز، ودوامة لهم في 16 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. إن الربط الفعال بين الرابط والحلفاء أمر بالغ الأهمية لهذه التجربة. تحقق من أنبوب التفاعل في بعض الأحيان للتأكد من أن هذه لا تتعجل أثناء الربط.
بعد الحضانة، كرر يغسل مع PNK EDTA ومخازن PNK، إضافة 40 ميكرولترات من PNK مختلطة إلى الخرز، ودوامة لهم في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة 10 دقائق. اغسل الخرز بمخازن PNK EDTA وPNK، ثم تابع مع عزل RNA كما هو موضح في مخطوطة النص. بالمقارنة مع العلم بوساطة أو streptavidin بوساطة خطوة واحدة تنقية التقارب، إزالة تنقية جنبا إلى جنب العلم Biotin-1 تقريبا جميع البروتينات النقية الأساسية، وتجنب تلوث التفاعلات غير المباشرة البروتين RNA.
LIN28 وWDR43، تم تنفيذ Fbio CLIP-seq باستخدام خلايا الماوس الجنينية الجذعية. في المجموع، تم استرجاع حوالي 7.7 مليون و 2.2 مليون قراءة فريدة من نوعها لLIN28 و WDR43 على التوالي. مقارنة بين وجهات النظر المسار تظهر أنماط ملزمة مختلفة في RN45 قبل rrna مكان.
المواقع المترابطة على GGA G عزر من قبل let7 ز RNA من قبل LIN28، FBIO كليب-eq أو التي تم تحديدها. وعلاوة على ذلك، تم تحديد زخارف الحمض النووي الريبي المخصب في مواقع الربط، والنسبة المئوية للنيوكليوتيدات المتحولة في أنواع مختلفة من الطفرات. تبين أن LIN28 يفضل ربط إلى النوكليوتيدات الجينية.
حسنا، في الساعة 10:00 مساء، هذا البروتوكول، من المهم أن نؤكد كفاءة المناعة للتأكد من أن البروتين فقط المجمعات تم تنقيتها بنجاح.
