Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

ونشكر جميع أعضاء مختبر الذكاء الاصطناعي على تعليقاتهم واقتراحاتهم المفيدة. نود أن نشكر الأستاذ مارك هيب (ماكس معهد بلانك للكيمياء الحيوية) لتزويدنا ناقلات المكوك غفب. وقد تم دعم هذا العمل بمنح مقدمة من مؤسسة العلوم اإلسرائيلية) إيسف رقم 124/14 (، ومؤسسة العلوم الوطنية) بسف # 2013325 (، ومنحة ماري كوري للتكامل الوظيفي) سيغ # 333794 (، والمعهد الوطني لعلم النفس النفسي في إسرائيل) نيبي # b133-14 / 15).

1. إعداد خط الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد حوالي 1،000،000 الماوس نيوروبلاستوما خلايا الحبل الشوكي (نسك-34 الخلايا) التي تم تخزينها في حاوية النيتروجين السائل. استخدام حاضنة المياه 37 درجة مئوية حتى يتم إذابة الخلايا تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المتوسطة الطازجة، الدافئة (دمم المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 1٪ L- الجلوتامين، و 1٪ من المضادات الحيوية من ركلة جزاء القلم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي إذابة الخلايا (SL16R) في 500 x ج لمدة 5 دقائق، وتشكيل خلية بيليه. تجاهل الوسط وإضافة 1 مل من الوسط الجديد لإعادة تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا معلق في قارورة 15 مل وإضافة 5 مل إضافية من المتوسطة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة معقمة مع 5٪ كو 2 عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في موازاة ذلك، وضع 8 كوفرسليبس غير المصقول (غطاء الزجاج: 12 ملم، 0.13-0.17 مم) في طبق ثقافة 60 ملم وتعقيم باستخدام 70٪ من الإيثانول والتعرض إلى 30 دقيقة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يجف. إضافة المتوسطة إلى كل طبق والتخلص من غسل الإيثانول المتبقية.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العازلة التربسين (2.5 غرام من التربسين و 0.2 غرام من إدتا في 1 لتر من محلول الملح المتوازن هانكس) إلى الخلايا بعد أن تصل إلى ما يقرب من 90٪ التقاء (ما يقرب من 6 ملايين خلية في قارورة) للسماح للخلايا الملتصقة للفصل. ملاحظة: خلايا نسك-34 حساسة وتتطلب فقط 15 ثانية من التربسين العازلة الحضانة و 1 دقيقة إضافية من الحضانة خالية من التربسين قبل التفكك باستخدام المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا على أطباق ثقافة 60 ملم تحتوي بالفعل على كوفرسليبس مع 3 مل من المتوسطة، ما يقرب من 350،000 لكل طبق. تركها في الحاضنة لمدة 24 ساعة للسماح مرفق الخلية على كوفرسليبس. </li></ol> 2. خلية ترنسفكأيشن ملاحظة: بعد حوالي 24 ساعة، فإن الخلايا نسك-34 تصل إلى 40٪ التقاء (ما يقرب من 800،000 الخلايا)، وسوف تكون على استعداد لترنسفكأيشن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد النقي دمم المتوسطة (300 ميكرولتر من دمم المتوسطة لكل 60 ملم طبق الثقافة) في حوض ميكروسنتريفوج العقيمةوفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكروغرام من كل البلازميد المطلوبة ل ترنسفكأيشن لكل دمم التي تحتوي على أنبوب ميكروسنتريفوج. ملاحظة: المكوك غفب البلازميد إلزامي في جميع ترانزفكتيونس الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كاشف ترنسفكأيشن لجميع أنابيب ميكروسنتريفوج التي تحتوي على البلازميدات المطلوبة. هنا، إضافة 4 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن التجارية لكل 2 ميكروغرام من الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنابيب ميكروسنتريفوج التي تحتوي على دمم، البلازميدات، وكاشف ترنسفكأيشن واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كل أنبوب ميكروسنتريفوج إلى طبق الثقافة ويقلب الطبق بلطف لتشكيل حل متجانس. وضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة. ملاحظة: منذ المكوك غفب ينبغي التعبير عنها في جميع الخلايا، وكفاءة ترنسفكأيشن المكوك غفب يمكن فحصها جزئيا واختبارها مسبقا باستخدام المجهر الفلورسنت بعد ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها. ويمكن إجراء فحص كامل للبروتينات غير الفلورسنت أعرب باستخدام أناليس إمونوبلوتهو. </li></ol> 3. المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق كوفرسليبس التي تحتوي على خلايا نسك-34 ترانزفكتد إلى حامل ساترة ويغسل بلطف مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لإزالة الخلايا الميتة منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التصحيح خلية مناسبة باستخدام فلتر الفلورسنت الأخضر مع المجهر مقلوب. ملاحظة: وتعرف خلية مناسبة التصحيح على أنها مجال المجهر من عرض يظهر عدد كبير من الخلايا (20-30 خلايا في حقل) والتي يتم تعريف النوى بوضوح في الخلايا. يتم تحديد نوى الخلية داخل التصحيح خلية أولا عن طريق العين ويتم وضع علامة يدويا من قبل برنامج التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من إكسبورتين-1 المانع العازلة ليبتوميسين B (لمب) تحتوي على 10 نانوغرام / مل لمب في برنامج تلفزيوني ل كوفرسليبس من قبل يقطر المخزن المؤقت على كوفرسليبس تحت المجهر. ملاحظة: يتم تعيين هذه النقطة في الوقت كما الفاصلة صفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كثافة الفلورسنت من نوى ملحوظ في 3 فترات s لحوالي 400-500 ق. </li><li&gt; اختبار بين 3 و 5 زلات تغطية لكل مجموعة ترنسفكأيشن في كل تجربة فردية. </li></ol> 4 - التحليل ملاحظة: منذ خلايا مختلفة تعبر مستويات مختلفة من المكوك الفلورسنت غفب، فمن المهم لتطبيع كثافة الفلورسنت النووية من كل خلية إلى كثافة الفلورسنت الأولية الخاصة بها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع كثافة الفلورسنت من نوى ملحوظ من خلال تقسيم 3-s الفاصل الزمني الفلورسنت من كل نواة مع متوسط ​​الفترات الستة الأولى من تلك النواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تطبيع كل نواة، وإنتاج منحنى كثافة الفلورسنت يمثل التغيير في مضان نوى كدالة من الوقت لكل خلية التصحيح. للقيام بذلك، حساب متوسط ​​جميع الخلايا في كل خلية التصحيح (التي تتكون من حوالي 20-30 خلايا في كل التصحيح). ملاحظة: منحنى شدة الفلورسنت نواة يشبه منحنى ميشاليس-منتن التشبع، وهو أفضل لوحظ في زيادة تيلي فترات. ويرجع ذلك إلى انخفاض في كميات عصاري خلوي من المكوك غفب مع الوقت بسبب النقل النووي. هذا الانخفاض إحصائيا يقلل من احتمال المكوك غفب لنقلها إلى النواة، وبالتالي الوصول إلى التشبع في مضان النووية. المنحدر المستمد من المعدل الأولي الخطي للمنحنى يعطي معدل دخول V ماكس في النواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المنحدرات V ماكس من كل خلية التصحيح، المستمدة من ثلاث إلى خمس تجارب مستقلة، وذلك باستخدام برنامج الرسوم البيانية لإنتاج منحدر واحد يمثل كل مجموعة التجريبية. أداء الكمي باستخدام طريقة واحدة تحليل أنوفا الإحصائية. </li></ol> 5. البروتين التحقق من صحة التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق ثقافة 60 ملم تحتوي على الخلايا المتبقية (لم تستخدم في التجربة أعلاه) من كل مجموعة تجريبية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لتخفيف وغسل المتوسطة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع 200-400ميكرولتر من العازلة تحلل تحتوي على برنامج تلفزيوني، 0.5٪ تريتون، والبروتياز مثبط قرص كوكتيل (بي). كشط باستخدام مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا في العازلة تحلل في أنبوب ميكروسنتريفوج والتجانس مع الخالط في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة تحت الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا المتجانسة في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة. جمع طاف، وتحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد، وتخزينها حتى استخدام في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع بين 30 و 70 ميكروغرام من البروتين الكلي (اعتمادا على البروتين) وتحميله في هلام سدز-بادج لاختبار التعبير البروتين باستخدام مقايسة مناعية. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

المؤلفين ليس لديهم ما يكشف عنه.

هذا البروتوكول يدل على مقايسة جديدة حساسة وكمية للغاية لتقييم التغيرات الدقيقة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن لمراقبة وقياس النقل نوكلوسيتوبلاسميك واختلال وظيفي في الوقت الحقيقي، وليس فقط العيوب الكبيرة التي تؤدي إلى تغييرات جذرية في توزيع البروتين. هذا الفحص ليس فقط لديه ميزة حساسية، ولكنه يتطلب أيضا إعداد القليل، وغير مكلفة، وهو فحص سهلة جدا ومنخفضة المشاركة. لاختبار كفاءة هذا النظام، استخدمت C9orf72 البروتينات، بولي (غر) وبولي (بيأر) درس، نماذج من ألس و فتد التي كانت تظهر سابقا أن تسبب نقص النقل نوكلوسيتوبلاسميك، 5 ، 7 ، 8 ، 10 ، 12 . باستخدام هذا الفحص، كان من الممكن أن تظهر، في الوقت الحقيقي، بانخفاض قدره حوالي 50٪ فيمعدل الواردات النووية في الخلايا معربا عن دي بي آر بالمقارنة مع الخلايا ترانزفكتد مع ناقلات التحكم. ولذلك، فإن هذا النظام يفتح إمكانية قياس التغيرات الصغيرة بسهولة في النقل النوكلوسيتوبلازمي، والتي يمكن أن تسببها هذه وغيرها من المسوخ ألس أو فتد أو غيرها من الأمراض التي قد توجد عيوب محتملة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. على الرغم من أن بروتوكول وصفها هنا يتعامل مع الخلايا العصبية الحركية مثل الخلايا، فإنه يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الخلايا الأخرى. الأهم من ذلك، باستخدام هذا النظام، فمن الممكن الآن لتحديد كيف العوامل الجزيئية المختلفة أو الأدوية قد تساعد على منع أو إنقاذ (ولو جزئيا) نوكلوسيتوبلاسميك النقل أوجه القصور في ألس، فتد، أو اضطرابات أخرى. أحد القيود المحتملة في استخدام هذا الفحص هو القدرة المحدودة لمراقبة وعلامة نواة الخلية في الخلايا التي لا تملك نواة واضحة أو التي تمتلك واحدة صغيرة جدا. للتغلب على هذا، قد يكون الحل الممكن ببساطة استخدام أكبر ماجيفيك<html> أوجه. ومع ذلك، فإن هذا في نهاية المطاف تقليل كمية الخلايا في كل خلية التصحيح، وبالتالي زيادة كمية التجارب اللازمة للوصول إلى قيمة كبيرة. وهناك اعتبار آخر يتعلق بنسبة غوكب نواة إلى السيتوبلازم المكوك قبل إضافة لمب. قد تكون هذه النسبة مختلفة جدا في أنواع مختلفة من الخلايا، وبالتالي قد تكون صغيرة جدا (قريبة من نسبة 1: 1) لإظهار نواة مرئية. أحد الحلول الممكنة هو استخدام علامة نووية مسبقا. وهذا لن يؤثر على التحليل النهائي، حيث يتم تطبيع كل خلية إلى مضان النووية الأصلي. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن لمعايرة تركيز لمب تستخدم لتثبيط إكسبورتين قبل إجراء هذا الفحص لمراقبة فعالية الزيادة المثلى في مضان النووية. ويقترح نقص النقل نوكلوسيتوبلاسميك للعب دورا رئيسيا في انحطاط الخلايا العصبية الحركية في ألس 5 ،= &quot;كريف&quot;&gt; 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 . إذا كان هذا هو الحال، فإن عيوب النقل نوكلوسيتوبلاسميك مماثلة لتلك التي لوحظت في نموذج C9orf72 من المتوقع أن تلعب دورا في نماذج ألس أخرى. ومع ذلك، بسبب التباين الكبير بين نماذج مختلفة، والنتائج النهائية والمظاهر الجزيئية الناتجة عن اختلال نوكلوسيتوبلاسميك في كل حالة قد يكون دون أن يلاحظها أحد أو اختلاف ظاهريا. وعلى الرغم من البحوث المستفيضة حول نماذج مختلفة من النظام فالس، فإن ربطها بالآليات المشتركة لا يزال يشكل تحديا. وقد يتيح هذا الفحص الآن الفرصة للتغلب على هذا التحدي جزئيا على الأقل.

مجمع المسام النووي (مجلس الشعب) يسيطر على استيراد وتصدير جزيئات كبيرة داخل وخارج نواة الخلية. وعلى النقيض من الجزيئات الصغيرة، التي يمكن أن تدخل النواة دون تنظيم 1 ، يتم التحكم في نقل الجزيئات الكبيرة بقوة من قبل المجلس الوطني. هذه الجزيئات الكبيرة، مثل البروتينات و الحمض النووي الريبي، المرتبطة بعوامل النقل، بما في ذلك الاستيراد والتصدير، ليتم استيرادها وتصديرها من النواة 2 . من أجل استيرادها، يجب أن تحتوي البروتينات على عزر الببتيد الصغير، وتسمى عموما إشارة توطين النووية (نلس)، التي ترتبط باستيراد 2 . هذه تسلسل من الأحماض الأمينية بمثابة علامة ومتنوعة في تكوين 3 ، 4 . يمكن تصدير البروتينات من النواة إلى السيتوبلازم بسبب ارتباطها مع إكسبورتينs، التي تربط تتابع إشارة، تسمى عموما إشارة تصدير نووية (نيس) 2 . كل من المستوردين والتصدير قادرون على نقل حمولتهم بسبب تنظيم راس الصغيرة ذات الصلة البروتين النووي غتباز (ران) 2 . وقد تبين أن ران موجودة في حالات مطابقة مختلفة اعتمادا على ما إذا كانت ملزمة إلى غتب أو الناتج المحلي الإجمالي. عندما تكون ملزمة إلى غتب، يمكن ران ربط المستوردات أو إكسبورتينس. عند ربط رانغب، إيمبورتينز الإفراج عن حمولتها، في حين أن إكسبورتينز يجب ربط رانغتب لتشكيل مجمع مع البضائع التصدير الخاصة بهم. تعتمد الدولة الملزمة النوكليوتيدات ران على موقعها في نواة (رانغب) أو السيتوبلازم (رانغبد). في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عددا من الدراسات وجود صلة بين الانهيارات في مسار نوكلوسيتوبلاسميك وكل من التصلب الجانبي الضموري (ألس) والخرف الجبهي الصدغي (فتد) 5 ، 6 </sup&gt; ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ألس هو المرض العصبي التقدمي والقاتل التي تؤثر على كل من الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية (منس) 13 مما أدى إلى الشلل، وفي نهاية المطاف في الموت، في غضون 2-5 سنوات في المتوسط. وتصنف معظم حالات ألس على أنها متفرقة (سالس)، تفتقر إلى أي ارتباط وراثي ظاهر، ولكن 10٪ موروثة بطريقة مهيمنة (ألس العائلي؛ فالس). في الآونة الأخيرة، تم تحديد التوسعات تكرار هيكسانوكليوتيد (هريس) في الكروموسوم 9 إطار القراءة المفتوحة 72 (C9orf72) الجينات 14 ، 15 كسبب وراثي ألس و فتد. هذه المسوخ تمثل 30-40٪ من الحالات فالس 16 ، ودعت دراسات مختلفةأنها تسبب السمية عن طريق التأثير على نقل نوكلوسيتوبلاسميك 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 . وقد أظهرت هذه الدراسات في الغالب النتائج والمظاهر النهائية لتعليم حقوق الإنسان على النقل نوكلوسيتوبلاسميك، لكنها لا تظهر اضطراب نوكلوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. ونتيجة لذلك، تم تقييم فقط نقص نقل نوكلوسيتوبلاسميك شديد 11 ، 17 ، 18 . يصف هذا البروتوكول الجديد وري فحص حساسة لتقييم وتحديد العجز النقل نوكليوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. معدل استيراد البروتين نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) يمكن أن يكون كميا في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلورسنت. ويتم ذلك باستخدام مثبط إكسبورتين، كما هو موضح سابقا 18 ، مما يسمح للمكوك غفب فقط لدخول النواة. باستخدام المجهري الفلورسنت والبرمجيات قادرة على قياس التغيرات الفلورية في الوقت الحقيقي، فمن الممكن لقياس التغيرات التدريجية في كثافة مضان المكوك غفب، وتقع في النواة. ونتيجة لذلك، يمكن إجراء منحنى التشبع مثل ميكايليس-منتن مثل محور مضان لوقت، وهو ما يمثل كمية من المكوك النووي غفب في أي وقت من الأوقات. باستخدام المعدل الخطي الأولي للمنحنيات، فمن الممكن لتوليد المنحدر، الذي يمثل معدل الدخول إلى النواة قبل التشبع مضان. للتحقق من صحة الفحص، ترجمةد C9orf72 يكرر ثنائي الببتيد، بولي (غر) وبولي (بيأر)، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا لتعطيل النقل نوكلوسيتوبلاسميك، استخدمت 5 ، 7 ، 8 ، 10 ، 12 . باستخدام هذا الفحص، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في معدل الواردات النووية مقارنة مع السيطرة. باستخدام هذا النظام، يمكن فحص التغييرات الدقيقة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد قدرة عوامل مختلفة لإنقاذ عيب النقل نوكلوسيتوبلاسميك.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

النقل نوكليوسيتوبلازميك يشير إلى استيراد وتصدير جزيئات كبيرة من نواة الخلية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عددا من الدراسات وجود صلة بين التصلب الجانبي الضموري (ألس) والإعاقات في مسار نوكلوسيتوبلاسميك. ألس هو مرض تنكس عصبي يؤثر على الخلايا العصبية الحركية مما يؤدي إلى الشلل، وفي نهاية المطاف في الموت، في غضون 2-5 سنوات في المتوسط. معظم حالات ألس متقطعة، تفتقر إلى أي ارتباط وراثي ظاهر، ولكن 10٪ موروثة بطريقة مهيمنة. في الآونة الأخيرة، تم تحديد التوسعات تكرار هيكسانوكليوتيد (هريس) في كروموسوم 9 إطار القراءة المفتوحة 72 (C9orf72) الجينات كسبب وراثي ألس والخرف الصدغي الصدغي (فتد). الأهم من ذلك، وقد اقترحت مجموعات مختلفة مؤخرا أن هذه المسوخ تؤثر على النقل نوكلوسيتوبلاسميك. وقد أظهرت هذه الدراسات في الغالب النتيجة النهائية والمظاهر التي تسببها هرس على النقل نوكلوسيتوبلاسميك، لكنها لا تظهر اختلال النقل النووي فيفي الوقت الحالى. ونتيجة لذلك، يمكن تحديد فقط نقص نقل نوكلوسيتوبلاسميك شديد، ويرجع ذلك أساسا إلى أوفيركسريسيون عالية أو الإدراج البروتين خارجي. يصف هذا البروتوكول مقايسة جديدة وحساسة جدا لتقييم وتحديد الاختلال النقل نوكلوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. معدل استيراد البروتين نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) يمكن أن يكون كميا في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلورسنت. ويتم ذلك باستخدام مثبط إكسبورتين، مما يسمح للمكوك غفب فقط لدخول النواة. للتحقق من الفحص، و C9orf72 ترجمة حقوق الإنسان ترجمة يتردد الببتيد، بولي (غر) وبولي (بيأر)، والتي تم عرضها سابقا لتعطيل النقل نوكلوسيتوبلاسميك، استخدمت. باستخدام الفحص الموصوف، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في معدل الواردات النووية مقارنة مع السيطرة. وباستخدام هذا النظام، يمكن فحص التغيرات الدقيقة في النقل النوكلوسيتوبلازمي وقدرة العوامل المختلفة على إنقاذ (ولو جزئيا) تر نوكليوسيتوبلازمييمكن تحديد عيب أنسبورت.

باستخدام الإجراء المعروض هنا، ترانزفكتد الخلايا العصبية مثل الخلايا نسك-34 الخلايا العصبية مع نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) البروتين. هذا البروتين، الذي يحتوي على نلس وتسلسل إشارة نيس ( الشكل 1 )، ويمكن نقل مكوكية بين النواة والسيتوبلازم. عام غفب يمكن إدخال أو الخروج من النواة في غياب أي علامة إشارة توطين فقط عن طريق نشر وبالتالي يتم توزيعها بالتساوي بين النواة والسيتوبلازم ( الشكل 2A ). في المقابل، يتم العثور على البروتين غفب المكوك في الغالب في السيتوبلازم بسبب نيس و نلس إشارة ق تؤثر على تشتت لها ( الشكل 2B ). وهكذا، إلا أن إضافة مثبط إكسبورتين ليبتوميسين B (لمب)، الذي يمنع تصدير البروتين، ويسمح لتراكم المكوك غفب في النواة، وفي نهاية المطاف لقياس معدل استيراد المكوك غفب ( الشكل 2C ). باستخدام المجهر الفلورسنت وهكذا<html> فتوير لتحديد التغييرات الفلورسنت في الوقت الحقيقي، والتغيرات التدريجية في كثافة مضان النووية المكوك غفب يمكن أن يكون كميا. ونتيجة لذلك، يمكن أن تنتج منحنى التشبع ميكيليس-منتن مثل محور مضان لوقت ( الشكل 3 )، وهو ما يمثل كمية من المكوك النووي غفب في أي وقت من الأوقات. باستخدام المعدل الخطي الأولي للمنحنيات (كما هو موضح من قبل الدائرة في الشكل 3 )، المنحدر، الذي يمثل معدل الدخول إلى النواة قبل التشبع مضان، يمكن أن تتولد. العديد من الدراسات تشير إلى أن بروتينات C9orf72 مختلفة سامة في نماذج ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر و / أو الخلايا المستزرعة 6 ، 11 . تم العثور على دي الببتيد يكرر (دبرس)، بولي (بيأر) وبولي (غر)، التي تنتجها هريس في الجينات C9orf72 تحور، للحث على الإجهاد النوى 8 ،<html> لاس = &quot;كريف&quot;&gt; 19 ، 20 وقد تورطوا في ناقلة ناقلة النوكليتوبلازم، مما يجعلها تبدو ضارة بشكل خاص. للتحقق من فائدة الفحص الموصوف، كانت الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا ترانزفكتد مع هذين البلازميدات دبر، بولي (بيأر) وبولي (غر). منذ بولي (بيأر) وبولي (غر) دبر مترافق إلى غفب كذلك، كان من المهم للتحقق من أن ديبر لم تتأثر ليبتوميسين-B كذلك، الأمر الذي سيؤدي إلى نتيجة إيجابية كاذبة. وقد لوحظ التعبير بولي (بيأر) في النواة تماما كما شوائب. وبالتالي، فإنه لا يمكن إعطاء إشارة استيراد النووي إيجابية كاذبة ( الشكل 4A ). بولي (غر) التعبير، من ناحية أخرى، لوحظ متجانس في السيتوسول وأيضا كما شوائب في النواة ( الشكل 4B ). عندما ترانسفكتينغ نسك-34 الخلايا مع بولي (غر) فقط وإضافة ليبتوميسين-B، لم تلاحظ حركة المكوك من بولي أعرب (غر) ( الشكل 5 ). &quot;jove_content&quot; فو: كيب-together.within-بادج = &quot;1&quot;&gt; من خلال تحليل معدل نقل نوكلوسيتوبلاسميك المكوك غفب، تم العثور على خلايا نسك-34 للمشاركة في التعبير عن بولي (بيأر) أو بولي (غر) ، مما يدل على انخفاض في معدل الواردات النووية من حوالي 50٪ بالمقارنة مع الخلايا ترانزفكتد مع البلازميد فارغة كسيطرة ( الشكل 5 ). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig1.jpg" /> الشكل 1: تخطيطي لل نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) بناء. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig2.jpg" /> الشكل 2: ليبتوميسين B يمنع تصدير المكوك غفب من نوى الخلايا نسك-34. صور ممثل الخلايا نسك-34 إكسريسينغ عام غفب ( A ) أو بروتين المكوك غفب قبل ( B ) و 20 دقيقة بعد إضافة 10 نانوغرام / مل ليبتوميسين B (لمب) ( C ). بعد إضافة لمب، واردات مكوك-غفب في النواة، ولكن يتم منع التصدير إلى السيتوبلازم. وهكذا، المكوك غفب يتراكم في نوى. شريط مقياس = 15 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig3.jpg" /> الشكل 3: مؤامرة ميشاليس-منتن تشبه زيادة في مضان النووية. ممثل ميكايليس-منتن مثل منحنيات تصور زيادة في مضان النووية من مجموعتين، المتضررة وغير المتضررة خلايا النقل نوكلوسيتوبلاسميك، في غضون 25 دقيقة. أول 5 دقائق تظهر فرقا كبيرا في معدل الزيادة، وهو ديمجعدة مع مرور الوقت. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig4.jpg" /> الشكل 4: C9orf72 دي بي آر بولي (بيأر) وبولي (غر) التعبير في الخلايا نسك-34. صور الممثل من الخلايا نسك-34 ترانزفكتد مع C9orf72 دبرس، بولي (غر) ( A ) وبولي (بيأر) ( B ). يتم التعبير عن بولي (غر) في نوى الخلايا ولكن يتم توزيعها أيضا متجانس في السيتوسول. ويعبر بولي (بيأر) أساسا في نوى. شريط مقياس = 30 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig5.jpg" /><br/&gt; الشكل 5: C9orf72 دبرس، بولي (بيأر) وبولي (غر)، تمنع بقوة معدل الواردات النووية في الخلايا نسك-34. وكانت الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا شارك ترانزفكتد مع المكوك غفب، جنبا إلى جنب مع البلازميد فارغة، بولي (بيأر) أو بولي (غر). وقد عرف معدل الواردات النووية بأنه ميل المنحنى الخطي الأولي للمنحنى عند V ماكس . معدل النقل التي تم الحصول عليها مع البلازميد الفارغ كان يعرف بنسبة 100٪. شارك في ترنسفكأيشن مع بولي (بيأر) وبولي (غر) تمنع معدل النقل بنحو 50٪ مقارنة مع السيطرة. تم إجراء تحليل كمي على ثلاث إلى خمس تجارب مستقلة باستخدام طريقة واحدة أنوفا. **** p &lt;0.0001؛ *** p &lt;0.001. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Views.  Ben-Gurion University of the Negev.  يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب. 

Video: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية<em&gt; في المختبر</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biology

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

مقايسة محتوى عالية لرصد امبا مستقبلات الاتجار

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

توسيع مجموعة أدوات التصوير في الجسم الحي للنقل المحوري

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.