هنا نبرهن على محتوى عالية مستقبلات الاتجار بالتشجار التي تتوافق مع إعداد الثقافة العصبية الأولية. هذه الطريقة تسميات منفصلة سطح برك مستقبلات قبو inter من الخلايا العصبية الثابتة. تمكين عرض البيانات كنسبة من سطح طبيعي أو كثافة مستقبلات داخلية إلى الكثافة الكلية لتلك المستقبلات.
إن المحتوى العالي وقياس الاتجار بالمستقبلات يوفر وسيلة لقياس التغيرات الكبيرة في ملامح الاتجار بالمستقبلات داخل الشبكة العصبية استجابة لعوامل مختلفة. تستهلك وقتا أقل بكثير والمواد من الطرق البديلة. وقد ارتبطت الاضطرابات والاتجار بالمنظورين باضطرابات عصبية متعددة، وتعتبر أهدافا جذابة للعلاج بالعقاقير.
على سبيل المثال أظهرت الدراسات واحدة من أقدم علامات مرض الزهايمر هو فقدان متشابك وتقلص تجمعات متشابك والمدب. تتطلب هذه التقنية العديد من الخطوات المختلفة من صعوبة متفاوتة. خاصة لأن التعامل مع لوحة 96 بئر والتلاعب في الآبار يمكن أن يكون من الصعب على شخص دون خبرة.
ولأن نتائج التجربة حساسة للغاية للتعامل غير السليم ، فمن المفيد عرض الخطوات المختلفة التي يتم تنفيذها. مدرب للبدء، وتغذية الخلايا العصبية في لوحة 96 جيدا عن طريق إزالة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام الموجودة من قبل من كل بئر. واستبداله بـ 100 ميكروليتر من وسائل الإعلام تم تسخينها مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.
كل ثلاثة إلى أربعة أيام. يوم في المختبر 14، واستخدام متعدد pipet لإزالة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام من كل بئر وتجمع وسائل الإعلام. إضافة اثنين microliters من TTX الأسهم الحل إلى ملليلتر واحد من وسائل الإعلام مكيفة مجمع لخلق حل أربعة ميكرومولار من TTX.
علاج الخلايا العصبية في كل بئر مع 100 ميكرولترات من أربعة محلول TTX micromolar. إذا لم يكن هناك ما يكفي من وسائط الحالة المجمعة إضافة بعض الوسائط المخزنة مسبقاً. احتضان في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.
بعد هذا إزالة TTX القائمة التي تحتوي على وسائل الإعلام وإضافة 200 microliters من وسائل الإعلام العصبية قبل الدافئة، واحتضان لوحة صغيرة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس عشرة دقيقة. أولا إزالة وسائل الإعلام العصبية من لوحة صغيرة. إضافة خمسين ميكرولترات من المضادة gluA1 أو المضادة لحلول الأجسام المضادة gluA2 إلى الآبار المقابلة من لوحة صغيرة.
إضافة خمسين microliters من وسائل الإعلام العصبية للجسم المضاد الثانوية السيطرة فقط الآبار. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشرين دقيقة للسماح للأجسام المضادة ملزمة. بعد هذا إزالة الوسائط الموجودة من الآبار.
غسل لوحة صغيرة ثلاث مرات مع 100 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة وسائط عصبية في كل بئر لإزالة أي أجسام مضادة غير منضمة. ثم إضافة 100 ميكرولتررز 100 micromolar من حل الأسهم DHPG إلى كل بئر. احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق.
المقبل إزالة الحل DHPG وإضافة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام العصبية إلى كل بئر. كرر هذه العملية مرة ثانية. ثم احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
في يوم التجربة إعداد حل من 4٪ شبهformaldehyde و 4٪ سكروز NPBS. إزالة وسائل الإعلام من كل بئر واستبداله مع 100 ميكرولترات من حل شبه شكلي وsucrose. كرر هذه العملية لكل نقطة وقت الإضافة.
احتضان لوحة صغيرة في 4 درجات مئوية لمدة عشرين دقيقة. ثم إزالة المثبت وإضافة 100 ميكرولترات من DPBS إلى كل بئر. إزالة DPBS وإضافة 150 ميكروليتر من العازلة حظر إلى كل بئر.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة تسعين دقيقة. قم بإزالة العازلة العازلة وإضافة 50 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ستين دقيقة مع الحفاظ على لوحة محمية من الضوء.
إزالة حل الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولترات من TBS إلى كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذه العملية، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار إضافة TBS، والاحتضان في درجة حرارة الغرفة أربع مرات إضافية.
بعد ذلك، إزالة TBS من لوحة صغيرة. إضافة 100 ميكرولترات من محلول من 4٪ شبهformaldehyde و 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمسة عشر دقيقة.
إزالة حل paraformaldehyde وإضافة 100 ميكرولترات من TBS في كل بئر، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين إضافية. أولاً إعداد حل TBS تحتوي على 2٪ سابونين ودوامة الحل لفترة وجيزة إلى حل مسحوق السابونين تماما.
باستخدام مرشح 2 ميكرومتر، تصفية الحل لإزالة أي جزيئات التي يمكن أن تسبب الفلوروس. إضافة 150 ميكرولترات من هذا الحل سابونين 2٪ لكل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس عشرة دقيقة. ثم إزالة الحل saponin، وإضافة 150 ميكرولترات من العازلة حظر إلى كل بئر.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة تسعين دقيقة. بعد هذا إزالة العازلة حظر وإضافة 50 ميكروليترس من حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ستين دقيقة.
ثم إضافة 100 ميكرولترات من TBS إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذه العملية إضافة TBS والتحضان في درجة حرارة الغرفة أربع مرات إضافية. باستخدام الأشعة تحت الحمراء ليزر نظام التصوير صورة 96 جيدا لوحة صغيرة وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
تعيين دقة المسح الضوئي إلى 84 ميكرومتر. جودة المسح الضوئي إلى متوسطة والتركيز إزاحة وفقا لارتفاع قاعدة 96 جيدا لوحة صغيرة المستخدمة. انقر على زر القائمة Image Studio ، تصدير صورة للوسائط الرقمية ، وتصدير الصور بدقة 300 نقطة في البوصة في تنسيق TIFF.
افتح الصورة في ImageJ فيجي. تقسيم قنوات اللون عن طريق النقر على قائمة الصورة ثم اللون، تقسيم القنوات. ثم افتح مدير عائد الاستثمار من تحليل ، والأدوات.
حدد خانة التسميات في مدير عائد الاستثمار، لتصنيف الدوائر بالأرقام. في 6 80، أو قناة حمراء، حدد المنطقة ذات الأهمية عن طريق تحديد أداة الدائرة ورسم دائرة تناسب بشكل دقيق أول بئر. ثم اضغط على Ctrl plus T، وسحب الدائرة إلى البئر التالية.
كرر هذه العملية حتى يتم نقل جميع الآبار. من مدير العائد على الاستثمار انقر فوق قياس. حدد القيم التي تظهر ثم نسخها إلى ورقة انتشار.
انقر بعد ذلك على القناة الخضراء ونقل ROIs المحدد إلى الصورة. من مدير العائد على الاستثمار انقر فوق قياس. حدد القيم التي تظهر ثم نسخها إلى ورقة انتشار.
بعد هذا حساب التغييرات التعبير مستقبلات السطح كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذا الإجراء يتم فحص استمرار القوس في تنظيم الاتجار مستقبلات أمبا باستخدام محتوى عالية الاتجار مستقبلات أمبا ومجرا. يتم التعامل مع الخلايا العصبية مع مانع قناة الصوديوم أيون TTX الذي يمنع إمكانات العمل ويقلل من مستويات القوس.
تليها DHPG الذي يحفز ترجمة قوس وSubiquitination. تم قياس كل من السطح واستيعاب برك من gluA1 وgluA2 التي تحتوي على وحدات فرعية مستقبلات APA في خمس وخمس عشرة دقيقة بعد تبييض DHPG. تظهر الخلايا العصبية ArcKR زيادة الشتوة الداخلية gluA1 عند التعامل مع DHPG، بالمقارنة مع حين نوع الخلايا العصبية.
لا ينظر إلى هذا التأثير عندما يتم التعامل مع الخلايا العصبية TTX فقط. يتم زيادة التعبير السطحي لـ gluA2 الفرعية بشكل كبير في نقاط زمنية قصيرة مقارنة بالخلايا العصبية من النوع الويل. تشير إلى استبدال محتمل لـ Subunit.
يجب التأكد من أن الخلايا غير السائلة ثابتة شبهformaldehyde ينبغي أن تكون مستعدة جديدة في يوم التجربة. يجب إعادة إصلاح الخلايا بعد وضع العلامات لمستقبلات السطح. طرق أخرى مثل المجهر confocal سوف تكون قادرة على توفير القرار خلية واحدة إلى مزيد من وصف تغيير ذات الصلة في بنية الخلايا العصبية وتوطين المستقبلات.
تعطيل الديناميات الزمنية قوس يغير مستقبلات أمبا الاتجار ردا على MgluR بوساطة المحدودة. التوجهات المستقبلية ستكون لقياس مستقبلات أمبا الاتجار استجابة للمحفزات الأخرى. هذا الفحص ربما قابل للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى, العلاجات والمستقبلات, شريطة أن يتم تعديل الإجراء بعناية والتحقق من صحتها بشكل مناسب.
يجب الحرص على ضمان تحسين كثافة الخلايا وأوقات المعالجة وخطوات التثبيت وخطوات permeabilization واختيارات الكاشف بنظامك الذي يهمك. من أجل الانتهاء من النجاح والكفاءة في الفحص من المهم إعداد حل DHPG و 4٪ شبهformaldehyde ، محلول السكروز 4٪ في يوم التجربة. التحكم تعامل بشكل جيد مع vakeel أو TTX مطلوبة للتأكد من أن الآثار التي لوحظت محددة للعلاج.
كما أنه من الأهمية بمكان أن تشمل الآبار المعالجة بالأجسام المضادة الثانوية فقط للتحكم في الفلورس الخلفية التي تنتجها ملزمات غير محددة.
