Name: sustained administration of β-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sustained Administration of Î²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres at JoVE.com

The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deterioration+determines+the+onset+and+rate+of+progression+of+secondary+dietary+failure+in+type+2+diabetes+mellitus:+the+10-year+follow-up+of+the+Belfast+Diet+Study.">Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study.</a> Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).</li><li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass.">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-based+nanoparticles:+an+overview+of+biomedical+applications.">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).</li><li>Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta+cell+lines+and+their+applications+in+diabetes+mellitus+research.">Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research.</a> ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).</li><li>Rui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres:+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits.">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li><li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas.">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization+and+in-vitro+evaluation+of+sustained+release+protein-loaded+nanoparticles+based+on+biodegradable+polymers.">Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers.</a> Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).</li><li>Riley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connective+tissue+growth+factor+modulates+adult+beta-cell+maturity+and+proliferation+to+promote+beta-cell+regeneration+in+mice.">Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice.</a> Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).</li><li>Mosser, R. E., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+small+scale+screening+of+candidate+beta+cell+proliferative+factors+using+intact+islets.">An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets.</a> Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).</li><li>Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+interactions+regulate+beta-cell+proliferation+in+islet-like+structures.">E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures.</a> Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).</li><li>Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+regulation+of+islet+beta+cell+mass+in+mice:+the+role+of+E-cadherin.">Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin.</a> Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).</li><li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation.">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+culture+and+preservation+strategies:+advances,+challenges,+and+future+outlook.">Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+Responsive+Polymers+for+Biomedical+Applications.">Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications.</a> Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).</li><li>Makadia, H. K., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+Lactic-co-Glycolic+Acid+(PLGA)+as+Biodegradable+Controlled+Drug+Delivery+Carrier.">Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.</a> Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).</li><li>Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+loaded+with+insulin-phospholipid+complex+for+oral+delivery:+preparation,+in+vitro+characterization+and+in+vivo+evaluation.">Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation.</a> J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).</li><li>Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy.">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li><li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues.">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li><li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وعادة ما يعرقل دراسة انتشار β خلايا في الثقافة من قبل العديد من الصعوبات. أولا، تتميز خلد خطوط β-الخلية درجات أعلى من انتشار من ما هو موجود في الذاتية β-الخلايا في الجزر الحية. بالإضافة إلى ذلك، هذه خطوط الخلايا خلد تفتقر إلى بنية طبيعية حاسمة لوظيفة عادية β-الخلية. هاتين الحقيقتين تجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خطوط β خلايا خلدت سيعقد صحيح عند اختباره في الجسم الحي أو في الجزر كلها. لدينا بروتوكول وصفها، والذي يستخدم المعزولة حديثا الجزر الماوس سليمة، وتلتف هذه القضايا كما يتم الحفاظ على العمارة جزيرة وانتشار β-خلية مماثلة لتلك الموجودة في الجسم الحي. واحد قلق كبير عند زراعة الجزر سليمة هو احتمال أن الخلايا داخل نواة جزيرة سيخضع نخر الناجم عن نقص الأكسجة أو لن تتعرض لrhCTGF. لهذا السبب، نهائييضاف تركيز 0.1 ملي EGTA إلى وسائل الإعلام لتخفيف الاتصالات خلية خلية دون تعطيل العمارة جزيرة. نشرنا سابقا أن إضافة EGTA وحدها يمكن أن تزيد من انتشار خلايا بيتا، ويرجع ذلك يفترض أن زيادة فرص وصول المواد الغذائية وmitogens في وسائل الإعلام حتى النخاع جزيرة 12. ويمكن أيضا أن يكون راجعا إلى انخفاض في خلية خلية الاتصال نفسه 13،14 الزيادة في انتشار β خلايا ردا على EGTA. وتستكمل وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول أيضا مع مصل الحصان بدلا من أكثر تقليدية الجنين المصل البقري. يتم هذا الاستبدال بسبب وجود محفز الإلبان المشيمي في المصل البقري الجنين، والتي يمكن أن تحفز تكاثر خلايا بيتا من تلقاء نفسها، ويحتمل أن يعقد التحليل في فحص انتشار الأسلحة النووية. تحديد سمية النسبية للالمجهرية PLGA (مع أو بدون هيئة النزاهة) إلى الخلايا جزيرة يمكن تقييمه من خلال تحليل المناعي أماهrkers من موت الخلايا أو التلف في الحمض النووي، بما في ذلك النفق أو γ-H2AX 15،16. على الرغم من أن إضافة المجهرية PLGA لم تظهر أي آثار ضارة واضحة إلى الجزر المجراة سابقا، يجب أن يكون المستخدمون على بينة من الآثار التي يمكن أن تترتب على المجهرية تحليل الصور. كما هو موضح في الشكل (3) والمذكورة في قسم النتائج، يمكن المجهرية undegraded يكون واضحا كما البقع الداكنة في الصور مناعي، مع مزيد المجهرية التي تظهر عندما يتم استخدام تركيزات متزايدة. وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول وصف وجرى تصميم للعمل مع الجزر الماوس معزولة. على هذا النحو، فإنه من غير الواضح إذا كانت الظروف متطابقة ستعمل مع الجزر تحصد من الكائنات بديلة، مثل الفئران والبشر. والجدير بالذكر أن الجزر تحصد من الكائنات الحية المختلفة في كثير من الأحيان ظروف مختلفة زراعة الأمثل وبدرجات متفاوتة من β خلايا انتشار 17،18. العديد biomالمقيدين تتوفر لإدارة rhCTGF إلى جزر معزولة، بما في ذلك بولي (thioketal يوريتان) وبولي (البروبيلين كبريتيد) 19 محتملة. اخترنا التركيز على PLGA بسبب عدة الصفات البارزة التي تملكها. أولا، PLGA هو كاشف بأسعار معقولة نسبيا والمجهرية يمكن أن تتولد مع المعدات القياسية (الطرد المركزي، الخالط، مجفاد) متوفرة في معظم المؤسسات البحثية. PLGA هو البوليمر الاصطناعية التي لديها سابقة للاستخدام الناجح في الأجهزة المعتمدة ادارة الاغذية والعقاقير نظرا لتوافق مع الحياة، التحلل البيولوجي، وقدرتها على تعديل معدلات الانبعاث مركب 20. PLGA يحط من قبل التحلل المائي في وجود الماء، والإفراج عن البضائع في هذه العملية. التركيب الكيميائي للجزيئات PLGA يمكن أن تكون مصممة بحيث يتم الإفراج عن مركب في الجسم الحي على مدى عدة أسابيع. كما تم استخدام PLGA في التجارب على الحيوانات قبل السريرية والعلاجات السريرية الإنسان محليا إدارة المركبات لمختلف الأجهزة وTISSUوفاق 21،22. ويمكن أيضا البوليمرات مسعور أخرى يمكن استخدامها في توليد المجهرية القابلة للتحلل. ويمكن لهذه البوليمرات يستجيب للمؤثرات بيئية محددة، مثل درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، ووجود أنواع الاكسجين التفاعلية 23،24. وبالتالي، يجب على الباحثين أن ينظر بعناية مادة بيولوجية هو الأنسب لدراستهم. أي باحث الاستفادة PLGA، أو المواد الحيوية الأخرى، لدراسة انتشار خلايا بيتا خارج الحي يجب أن يكون على بينة من الخلافات المحتملة بين آثار النزاهة مغلفة مقارنة unencapsulated هيئة النزاهة. على سبيل المثال، يمكن تسليم rhCTGF عبر PLGA تغيير درجة وتوقيت β خلايا انتشار تحريض مقارنة مع العلاج مع البروتين unencapsulated. الدراسات الجارية في مختبرنا وتدرس حاليا هذه الاختلافات المحتملة. تحليل انتشار β خلايا في الجزر مثقف هو نموذج قوي لتحديد وليتحليل chanistic من mitogens β-الخلية. باستخدام مقايسة الموصوفة هنا نعرض طريقة سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لإدارة لجنة النزاهة في الجزر مثقف معزولة مع وسيلة الافراج عن تسليم طويلة. وينبغي أن يكون هذا الاختبار ينطبق على أي نحو النزاهة من الفائدة، وخيارنا للتركيز على CTGF يستند فقط على قدرة نشرت سابقا لتحفيز تكاثر خلايا بيتا في الجسم الحي وخارج الحي 11. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الفحص صحة فعالية وسلامة استخدام PLGA كوسيلة من وسائل إيصال قبل التقدم إلى نماذج حيث يتم زرع الجزر في الكائنات الحية. وعموما، يوفر بروتوكول وصف طريقة جديدة لإدارة المركبات في الجزر مثقف مع تأثير أوسع على قياس سلامة PLGA إلى الأنسجة استنساخها.

البنكرياس β-الخلايا هي الوحيدة الخلايا المنتجة للانسولين في الجسم وحاسمة للحفاظ على مستوى السكر في الدم التوازن. بينما الأفراد الأصحاء لديها ما يكفي من الكتلة β خلايا وتعمل على تنظيم مستوى السكر في الدم بشكل صحيح، وتتميز الأفراد مع مرض السكري عن طريق عدم كفاية كتلة β خلايا و / أو وظيفة 1،2. وقد اقترح أن يحفز انتشار β خلايا يمكن أن تزيد في نهاية المطاف كتلة خلايا بيتا واستعادة توازن الجلوكوز في الأشخاص الذين يعانون من مرض السكري 3. ومع ذلك، وتقييم والتحقق من المركبات التكاثري β خلايا المحتملة في الجزر سليمة ضروري قبل علاجات فعالة يمكن تطويرها. زرع الجزر الإنسان المتوفين دماغيا في الأفراد الذين يعانون من مرض السكري يعيد السكر في الدم التوازن لبعض الوقت، ولكن يكبح توافر ونجاح هذا الإجراء التجريبي بسبب النقص في الجزر البشرية المتاحة للزرع وفاة بيتا خلية في الخلف الجزرزرع إيه 4. حتى مع اكتشاف العوامل التي تحفز على تكاثر الخلايا المنتجة للأنسولين، تحديا كبيرا لا يزال موجودا في تقديم هذه العوامل إلى المواقع ذات الصلة في الجسم الحي. استراتيجية واحدة للتسليم المحلي المستدام من β خلايا المركبات التكاثري هي بولي (اللبنيك-ك-الجليكوليك) حامض (PLGA). لديها PLGA تاريخ استخدام في ادارة الاغذية والعقاقير وافق تسليم المنتجات المخدرات بسبب سلامتها عالية، التحلل البيولوجي، وحركية الافراج عن 5 ممتدة. على وجه التحديد، PLGA هو كوبوليمر من lactide وglycolide أن يحط عن طريق التحلل بالماء إما في الجسم الحي أو في الثقافة إلى حمض اللاكتيك وحمض الجليكوليك، والتي تحدث بشكل طبيعي التمثيل الغذائي في الجسم. مجمع المخدرات مغلفة يمكن أن تنطلق في البيئة المحيطة من قبل كل من نشر و / أو آليات الافراج التي تسيطر عليها تدهور. التغليف من هيئة النزاهة يوفر الحماية ضد تدهور الأنزيمية، وتحسين التوافر البيولوجي للكاشف مقارنة unencapsulaتيد هيئة النزاهة 5. نقترح المجهرية PLGA يمكن استخدامها لإدارة المركبات مرشح لجزر سليمة في الثقافة، وفي نهاية المطاف في الجسم الحي. اختبار فعالية PLGA لإدارة mitogens خلايا بيتا في جزر المجراة سابقا من الأهمية بمكان قبل أن يتم استكشاف بروتوكولات الزرع. حاليا، ليس هناك تقنية لقياس انتشار خلايا بيتا في الحيوانات الحية. التجارب لتقييم فعالية مركبات التكاثري المحتملة في الجسم الحي وبالتالي تتطلب إدارة هذه المركبات للعيش الحيوانات، مع تشريح لاحق وتجهيز بنكرياسات لimmunolabeling. هذه البروتوكولات هي مكلفة وشاقة، وتتطلب مجمع على أن تدار بشكل منتظم، دون أي ضمانات بأنهم سوف تصل إلى الجزر. على العكس، هي عدة خطوط خلايا بيتا خلد المتاحة لدراسة الخلايا المنتجة للأنسولين في الثقافة، ولكن هذه خطوط الخلايا تفتقر إلى بنية جزيرة والبيئة ...ر الموجودة في الكائنات الحية 6. تتميز خلد خطوط خلايا بيتا أيضا وجود درجة أعلى بكثير من النسخ من الذاتية β خلايا في الجسم الحي، مما يعقد تحليل المركبات التي تحفز على انتشار الأسلحة النووية. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول يستخدم الجزر سليمة معزولة من فئران بالغة. على عكس خطوط β خلايا، الجزر سليمة تحتفظ العمارة جزيرة طبيعية. وبالمثل، على النقيض من التجارب التي أجريت في الجسم الحي، وإدارة المركبات التكاثري مباشرة إلى الجزر سليمة مثقف يقلل بشكل كبير من كمية من الكواشف ما هو ضروري لقياس بدقة انتشار خلايا بيتا. الدراسة الحالية تستخدم PLGA لإدارة هيئة النزاهة، في هذا المثال، الضامة عامل نمو الأنسجة البشري المؤتلف (rhCTGF). الطريقة الموصوفة هنا يمنح تفوقا كبيرا على إدارة مجمع الخام إلى الجزر مثقف لأنها تسمح لاطلاق سراح المستمر من المركب إلى عشروسائل الإعلام الإلكترونية. والجدير بالذكر أن هذا الاختبار يمكن تعديلها لإدارة مجموعة واسعة من البروتينات والأجسام المضادة التي تهم الجزر سليمة. الآثار على أنواع الخلايا في الغدد الصماء الأخرى، بما في ذلك α خلايا، ويمكن أيضا أن تحلل.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>For labeling COI with fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>For dissolving fluorophore in step 1</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Desalting column used in step 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotics for islet media</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement for pre-assay islet media</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Used in dissociating islets</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>For fixing cells</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>For permeabilizing cells</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blocking reagents for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antibody</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Fast drying mounting media</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>For lyophilization of microspheres</td></tr></tbody></table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

تطوير المواد الحيوية قد زاد بشكل كبير من إمكانية تسليم المخدرات تستهدف مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة أنواع، بما في ذلك β خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، توفر أيضا جزيئات بيولوجية، الهلاميات المائية، والسقالات فرصة فريدة لإدارة مستدامة وتقديم الأدوية يمكن السيطرة على بيتا خلايا في الثقافة وفي نماذج الأنسجة المزروعة. تسمح هذه التقنيات لدراسة العوامل انتشار مرشح β-الخلية باستخدام الجزر سليمة ونظام ذات الصلة translationally. وعلاوة على ذلك، تحديد فعالية وجدوى من العوامل مرشح لتحفيز انتشار β خلايا في نظام الثقافة أمر بالغ الأهمية قبل المضي قدما إلى نماذج في الجسم الحي. هنا، نحن تصف طريقة للمشاركة في ثقافة الجزر الماوس سليمة مع مجمع للتحلل من الفائدة (هيئة النزاهة) بولي -loaded (حمض اللبنيك-ك-الجليكوليك) (PLGA) المجهرية لغرض تقييم آثار مستمرة في الموقع الافراج سالعوامل مولد للتفتل و على انتشار β-الخلية. توضح هذه التقنية بالتفصيل كيفية توليد المجهرية PLGA التي تحتوي على البضائع المطلوب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. في حين تستخدم تقنية الموضحة عامل المؤتلف الإنسان الضامة نمو الأنسجة (rhCTGF) على سبيل المثال، يمكن بسهولة أن تستخدم مجموعة واسعة من النزاهة. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة تستخدم لوحات 96-جيدا لتقليل كمية من المواد الكيميائية اللازمة لتقييم انتشار خلايا بيتا. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام المواد الحيوية البديلة وغيرها من الخصائص خلية الغدد الصماء مثل بقاء الخلية وحالة التمايز.

الرقم 1 هو تمثيل مرئي للالمجهرية المولدة باستخدام بروتوكول أعلاه. بروتوكول الموصوفة هنا غلة المجهرية تحميل rhCTGF من مختلف الأحجام. وأكبر جزء من المجهرية أن يكون بين 1 و 10 ميكرون في القطر، وعلى الرغم من بعض المجهرية قد يكون أكبر (الشكل 2). إذا رغبت في ذلك، حجم microsphere يمكن ضبطها والأمثل استنادا إلى معايير تلفيق مثل سرعة التجانس والوقت، والتركيز السطحي المستخدمة، وكميات النسبية لكل مرحلة المياه / النفط / الماء (10). وبعد تشتت الجزر سليمة تعامل مع المجهرية PLGA وimmunolabeling لاحقا، فمن الشائع أن نرى مناطق العينة خالية من أي وضع العلامات في بين الخلايا (الشكل 3). في حين أن معظم المجهرية التي لا تزال على حالها بعد فترة العلاج الثقافة هيإزالة خلال خطوات الغسيل، لا تزال بعض بعد نسج الجزر على شرائح المجهر. هذه المجهرية تتسبب في هياكل تشبه ثقب تصور أثناء التصوير. هذه المجهرية المتبقية عادة لا تتداخل مع الكمي لاحق. بعد التصوير، والنسبة المئوية للخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الأنسولين يمكن أن يكون كميا عن طريق العد يدويا العدد الكلي للخلايا المسمى، أو باستخدام تحليل صورة البرنامج. سابقا، لقد أثبتنا أن الضامة عامل نمو الأنسجة البشري المؤتلف (rhCTGF) يمكن أن تحفز انتشار الماوس β خلايا في الجزر سليمة خارج الحي 11. باستخدام بروتوكول المذكور، ولدت لنا المجهرية PLGA التي تحتوي على rhCTGF (rhCTGF-PLGA). علاج الجزر سليمة مع المجهرية rhCTGF-PLGA لمدة 3 أيام أسفرت عن زيادة مماثلة في انتشار β-خلية كما ذكرت سابقا مع البروتين الخام، مما يدل على أن البروتين لم يكن لو<html> حد ذاتها أي وظيفة خلال جيل microsphere (الشكل 4). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig1.jpg" /> الشكل 1: التمثيل المرئي للPLGA الجزئي من خلال دمج صبغة الفلورسنت في بروتوكول التصنيع، المجهرية PLGA يمكن تصور باستخدام مجهر epifluorescent. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig2.jpg" /> الشكل 2: حجم توزيع PLGA الجزئي على الرغم من أن حجم التوزيع قد تختلف، ومعظم المجهرية سيكون أقل من 10 ميكرون في القطر.arget = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig3.jpg" /> وimmunolabeled التصور مناعي من فرقت المتكاثرة خلايا بيتا فرقت الجزر للعلامة انتشار Ki67 (الحمراء)، والانسولين (الأخضر) للاحتفال تنتشر خلايا بيتا: الرقم 3. وصفت نوى مع دابي (الأزرق). السهام تشير الخلايا Ki67 إيجابية / الإيجابي المعتمد على الأنسولين. النجمة (*) تشير المجهرية undegraded. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig4.jpg" /> الشكل 4: الكمي وتحليل β خلايا بروliferation. الجزر تعامل مع كميات مختلفة من المجهرية rhCTGF-PLGA. وقد أحصى عدد الخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الانسولين يدويا من جميع العينات وكنسبة مئوية من إجمالي عدد β-خلايا الأنسولين الإيجابي. X-محور يتوافق مع تركيز النهائي من rhCTGF موجودة في كل معاملة. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام باتجاه واحد يتبع أنوفا من التجارب المقارنة متعددة توكي و. تم تعيين دلالة إحصائية عند P ≤ 0.05. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sustained Administration of Î²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres at JoVE.com

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

إدارة مستدامة للMitogens β-خلية لالفشوت ماوس سليمة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; عن طريق تحلل بولي (حامض اللبنيك في-ك-الجليكوليك) الجزئي

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Video: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Medicine

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

تدعمه سقالة زرع الجزر في سادة الدهون البربخ من الفئران السكري

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

هندسة السطح من جزيرات البنكرياس مع نانوكواتينج ستاربيج هيبارينيزيد

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

والمحتوى العالي<em&gt; في المختبر</em&gt; البنكرياس جزيرة β خلايا النسخ المتماثل منصة ديسكفري

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

إينترابورتال زرع جزيرات البنكرياس في طراز الماوس

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

في المختبر البنكرياس توالد من تفرقوا الجنينية الماوس أسلاف

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

تقليل نزيف الوريد البابي بعد التسريب أثناء زراعة الجزر داخل الكبد في الفئران

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

إدارة مستدامة للMitogens β-خلية لالفشوت ماوس سليمة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video