Name: sustained administration of β-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
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The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Tutte le procedure sono state approvate e eseguite in conformità con il Comitato cura e l&#39;uso Vanderbilt Istituzionale Animal. 1. Etichettatura COI con Fluoroforo (opzionale) <ol><li> Scegliere un colorante fluorescente che reagisce con un&#39;ammina primaria libera (ad esempio, su una proteina), come esteri o derivati succinimidyl fluoresceina, per visualizzare microsfere carico. Sciogliere 8x eccesso molare (rispetto alla moli di COI) di fluoroforo in 200 ml di dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Risospendere 50 mg di COI fino ad un volume finale di 800 microlitri in una soluzione veicolo (concentrazione finale di 62,5 ng / ml). La soluzione di veicolo varierà a seconda della fonte del COI. NOTA: veicolo tipico soluzioni includono tampone fosfato salino (PBS) o DMSO. </li><li> Aggiungere tutta la soluzione fluoroforo / DMSO dal punto 1.1 e risospendere il COI. Vortex notte a 4 ° C. In alternativa, agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente(RT) per 4 ore. </li><li> Dopo la reazione di marcatura, rimuovere l&#39;eccesso fluoroforo utilizzando una colonna dissalazione. <ol><li> Scolare buffer di storage da colonna dissalazione e risciacquare con 16 ml di acqua deionizzata. Gettare tutto il flusso attraverso. </li><li> Aggiungere il COI fluorescente alla colonna di dissalazione. Eluire con 1,2 ml di acqua deionizzata e raccogliere il flusso attraverso. </li><li> step eluizione Ripetere altre quattro volte, ogni volta aggiungendo 1,2 ml di acqua deionizzata e di raccolta del flusso attraverso come campione separato. </li><li> Congelare tutto il flusso raccolte attraverso i campioni a -80 ° C e liofilizzare secondo le istruzioni del produttore per 24 ore. </li></ol></li></ol> 2. COI-caricato microsfere Preparazione tramite l&#39;acqua acqua-in-olio-in-emulsione di solventi evaporazione Metodo <ol><li> Aggiungere 1 mg di fluorescente COI a 100 ml di acqua deionizzata per formare la prima fase acquosa (W1). </li><li> Sciogliere 65 mg di poli (aci lattico-co-glicolicod) (50:50 Lactide: Glycolide, peso molecolare 54.000 - 69.000) in 750 ml di diclorometano in una provetta. Ultrasonicate per 10 - 30 sec (a 160 W) per sciogliere completamente il PLGA. Ciò costituisce la fase olio (O). </li><li> Aggiungere tutti fase W1 generato nel passaggio 2.1 alla fase O in maniera goccia a goccia. Emulsionare usando un omogeneizzatore portatile a 20.000 rpm per 30 secondi per formare la fase W1 / O. </li><li> Aggiungere tutti fase / O W1 in maniera goccia a goccia a 15 ml di una soluzione all&#39;1% (PVA) (peso / volume) poli acquosa (vinil alcool) ed emulsionare usando un omogeneizzatore portatile a 20.000 rpm per 30 sec . </li><li> Trasferire tutto dell&#39;emulsione generato nel passaggio da 2.4 a 200 ml pallone a fondo tondo e soggetto ad un 635 millimetri Hg di vuoto usando un evaporatore rotante per 1 ora per rimuovere il solvente e generare la fase acquosa. </li><li> Aliquota 1 ml di fase acquosa generati in fase di 2,5 a quattordici provette da microcentrifuga. La centrifugazione della soluzione acquosa in tubi da microcentrifuga a 7.500xg per 8 min. NOTA: A questo punto, le microsfere sono presenti nella soluzione acquosa rimanente e si concentrano sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta. <ol><li> Lavare le microsfere di un eccesso di PVA con l&#39;aggiunta di 1 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta. Centrifugare a 7500 xg per 8 minuti, e ancora rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta. NOTA: La soluzione acquosa 100 microlitri rimanente contiene microsfere generate. </li></ol></li><li> Congelare la soluzione acquosa microsfera generato nel passaggio 2,7 a -80 ° C. </li><li> microsfere lyophilize utilizzando un liofilizzatore secondo il fornitore dile istruzioni e conservare a -20 ° C. NOTA: Misura efficienza carico del COI sciogliendo completamente microsfere di PLGA e determinare la concentrazione di proteine rispetto ad una curva standard della proteina free 7. </li><li> Come controllo negativo, genera una serie di microsfere &quot;in bianco&quot; (di seguito denominati microsfere di controllo). NOTA: La generazione di microsfere di controllo è identica alla generazione di idrofili microsfere COI caricati, senza aggiunta COI a 800 microlitri della soluzione di veicolo in fase 1.2. particelle di controllo Partita a concentrazione di massa di PLGA rispetto a microsfere PLGA COI-caricati per il saggio mitogeno β-cellule. </li></ol> 3. Preparazione di Islet cultura dei media e media pre-test <ol><li> Preparare 200 ml media per la cultura di isole di topo intatte: RPMI 1640 multimediale integrato con 11 mm di glucosio, il 10% siero di cavallo, 100 U / ml di penicillina G e 100 mg / ml di streptomicina (di seguito indicato come èlasciare terreni di coltura). NOTA 1: A differenza di siero fetale bovino (FBS), siero di cavallo manca lattogeno placentare, un induttore della proliferazione β-cellule, che confonde l&#39;analisi del saggio di proliferazione. NOTA 2: Poiché le microsfere di PLGA non vengono sterilizzati prima dell&#39;uso, l&#39;aggiunta di antibiotici ai terreni di coltura è fondamentale per evitare contaminazione microbiologica. </li><li> Rimuovere 25 ml di terreni di coltura isolotto con una pipetta elettronica e posto in un tubo conico da 50 ml. Supplemento 25 ml di mezzo di coltura isolotto nel tubo conico 50 ml con una concentrazione finale di 0,2 mM EGTA per generare il supporto pre-test. NOTA: L&#39;aggiunta di EGTA allenta leggermente contatti cellula-cellula nelle isole senza alterare l&#39;architettura isolotto. Questo aiuta a garantire la COI può raggiungere le cellule interne del isolotto e aiuta a prevenire la necrosi del isolotto centrale. </li></ol> 4. coltura di Intact isole di topo <ol><li> Isolare isolotti intatti da un ceppo preselezionato, il sesso, age, e il genotipo di topi dopo una digestione collagenasi di routine del 8,9 pancreas. Pool insieme isolotti da come campioni. </li><li> Aliquota 40 isolotti in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti in 200 ml di terreni di coltura isolotto. Visivamente isolotti size-partita per bene (una precisa valutazione di equivalenza isolotto (IEQ) tra i campioni non è necessario). Riempire i pozzi vuoti immediatamente adiacenti ai pozzi con isolotti con 200 ml di acqua sterile per fornire un buffer di evaporazione. Culture isolotti in mezzi notte a 37 ° C in atmosfera di 95% CO aria e 5% 2. </li></ol> 5. risospensione del COI-caricati e Controllo PLGA microsfere <ol><li> Dopo il recupero isolotto overnight, microsfere risospendere aggiungendo supporti pre-test per un&#39;aliquota di liofilizzati microsfere di PLGA COI caricati tale che la concentrazione finale del COI nella provetta è di 10 ng / ml (la quantità di COI presente in una data quantità di le micro generatiatmosfere sono stati determinati in fase 2.9). Sonicare le microsfere COI-caricati risospeso in un bagno di acqua ghiacciata per 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C. </li><li> controllo Risospendere PLGA microsfere aggiungendo lo stesso volume di supporti pre-test per un&#39;uguale massa di controllo liofilizzato microsfere di PLGA. Sonicare i risospesa microsfere di controllo PLGA in un bagno di acqua ghiacciata per 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C. </li><li> Visivamente confermano microsfere sono dispersi pipettando 2 ml di microsfere risospese tra due vetrini. Visualizza microsfere utilizzando un obiettivo 40X su un microscopio a epifluorescenza o campo chiaro. </li><li> Se significativa aggregazione delle microsfere è ancora visibile, ultrasuoni in un bagno di acqua ghiacciata per altri 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C e la visualizzazione di ripetizione di microsfere risospesa. </li></ol> 6. Il trattamento di isolotti con COI-caricati o controllo PLGA microsfere &lt;/ P&gt; <ol><li> Per ciascun pozzetto da trattare con microsfere COI-caricati, preparare supporti dosaggio diluendo il 10 ng / ml di microsfere COI risospesa con mezzi di pre-test per un volume finale di 100 microlitri e una concentrazione finale predeterminata. NOTA: La concentrazione finale ottimale della proteina può variare per ogni COI impiegato per questo dosaggio. Idealmente, un intervallo di concentrazioni finali sono testati. </li><li> Per ogni bene per essere usato come controllo, preparare il controllo dei media dosaggio diluendo il controllo microsfere risospesa PLGA generati al passo 5.2 con lo stesso volume di diluizione utilizzato per diluire le microsfere COI-caricati al punto 6.1. NOTA: Isolotti trattati con mezzi saggio di controllo serviranno come controllo negativo per consentire l&#39;individuazione di eventuali effetti delle microsfere vuote possono avere sui risultati sperimentali. </li><li> Rimuovere con cautela 100 ml di terreni di coltura isolotto da ogni pozzetto con una micropipetta tale che non isolotti sono sloggiati dai pozzi. Delicatamente aggiungere 100 μl di mezzi di analisi o 100 ml di mezzi saggio di controllo in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare isolotti a 37 ° C in atmosfera di 95% CO aria e 5% 2 per tre giorni. </li></ol> 7. Dispersione Isolotti intatte Onto vetrini da microscopio <ol><li> Dopo tre giorni, utilizzare una micropipetta per rimuovere con attenzione e gettare i media saggio da tutti i pozzetti in modo da non rimuovere isolotti. Delicatamente aggiungere 200 ml di PBS a isolotti di lavarle dei mezzi di test. Rimuovere con cautela e scartare PBS con una micropipetta e lavare delicatamente isolotti di nuovo con altri 200 ml di PBS. </li><li> Rimuovere e gettare PBS con una micropipetta e aggiungere 100 ml di 0,025% tripsina, 2 mM EDTA soluzione. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Pipettare isolotti nella soluzione tripsina-EDTA su e giù ogni 2 minuti fino a quando isolotti sono confermati visivamente di essere disperso nelle singole cellule (si noti che alcuni piccoli grumi di cellule possono essere ancora presenti) utilizzando un microscopio ottico. Trasferire l&#39;intero volume di ciascun pozzetto singolamente in microprovette labeled-. </li><li> Aggiungere 400 ml di terreni di coltura isolotto a ciascuna provetta per fermare la dissociazione delle cellule tripsina-mediata. </li><li> campioni di centrifugazione per 5 min a 100 xg a 4 ° C a pellet cellule insulari al fondo dei tubi microcentrifuga. </li><li> Rimuovere delicatamente il surnatante con una micropipetta, e risospendere pellet in 200 terreni di coltura isolotto ml fresca. </li><li> Utilizzando un cito-centrifuga, centrifuga dissociato isolotti a 140 xg per 3 minuti su vetrini da microscopio cariche. </li><li> Air diapositive a secco a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi disegnare una casella intorno agli isolotti dissociate con un pennarello idrofoba. </li><li> Fissare le cellule con 75 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere 4% PFA e lavare delicatamente le cellule in 75 ml di PBS due volte. Dopo il lavaggio, permeabilize cellule con 75 microlitri 0,2% Triton X-100 in PBS per 10 min. Quindi, lavare le cellule con 75 ml di PBS. Attenzione: PFA è noto per essere allergenico, cancerogeno e tossico. </li></ol&gt; 8. immunofluorescenza Etichettatura di dissociato isolotti per l&#39;insulina e la proliferazione cellulare Marker, Ki67 <ol><li> Preparare una camera umida posizionando due asciugamani di carta bagnata sul fondo di una scatola vetrino da microscopio capacità 100 diapositiva. </li><li> Collocare i vetrini piatto verso il basso (cellule verso l&#39;alto) in camera umida. Preparare i campioni per l&#39;etichettatura aspirando il PBS dalla fase di lavaggio precedente utilizzando una micropipetta e l&#39;aggiunta di 75 ml di soluzione bloccante (5% Normal Donkey Serum (NDS) in PBS) per ogni diapositiva per bloccare legame non specifico di anticorpi contro i campioni. Incubare i vetrini in soluzione bloccante per 1 ora a RT. </li><li> Delicatamente aspirato soluzione bloccante utilizzando una micropipetta e aggiungere 75 ml di soluzione di anticorpo primario contenente cavia anti-insulina e coniglio anticorpi anti-Ki67, diluito 1 mg / ml a 5% NDS in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. NOTA: gli indicatori alternativi di proliferazione delle cellule proliferanti includono l&#39;antigene nucleare delle cellule (PCNA) e phosphohistone H3 (PH3), </li><li> Aspirare delicatamente soluzione di anticorpo primario con una micropipetta e lavare le cellule con 75 ml di PBS. Aspirare PBS usando una micropipetta e lavare le cellule due volte, ogni volta con 75 ml di PBS. Incubare ciascun campione con l&#39;anticorpo secondario 75 microlitri anti-guinea pig Cy5 e anti-rabbit Cy3 anticorpo secondario diluito a 2 ug / ml in soluzione bloccante per 1 ora a RT. NOTA: non utilizzare anticorpi secondari marcati con lo stesso o spettralmente sovrapposizione fluoroforo che è stato già utilizzato per etichettare le microsfere. </li><li> soluzione di anticorpo secondario Aspirare utilizzando una micropipetta e incubare in 75 ml di 300 nM DAPI in PBS per 3 minuti a RT. Aspirare DAPI utilizzando una micropipetta e sciacquare in acqua deionizzata per 5 min. </li><li> Aspirare delicatamente l&#39;acqua da campioni utilizzando una micropipetta. Spot una goccia (circa 100 ml) di soluzione di montaggio rapida essiccazione contenente antifade reagente su un vetrino di vetro. Invertire il lato del microscopio del campione scivolo verso il basso, onto la soluzione di montaggio. Premere delicatamente il vetrino contro il vetrino con una punta di pipetta per rimuovere le bolle e spazzare via il liquido in eccesso con un panno di pulizia morbido. Lasciare coprioggetto asciugare per una notte a temperatura ambiente. </li></ol> 9. Acquisizione di immagini e analisi <ol><li> Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con una fotocamera collegata per l&#39;acquisizione delle immagini. Per ogni fluoroforo, determinare il momento ottimale di esposizione (in genere 20 msec per DAPI, 40 - 80 msec per l&#39;insulina, e 250 msec per Ki67). Assicurarsi parametri di acquisizione delle immagini sono uguali per tutti i campioni. </li><li> Per ogni campione, contare manualmente 3.000 cellule insulino-positive e di quelle contare quante sono anche Ki67-positivi. contare soltanto cellule insulino-positive che hanno un nucleo ben definito e ben visibile. Calcolare la percentuale di proliferazione cellule beta per ogni campione dividendo il numero di cellule Ki67-positive / insulino-positive per il numero totale di cellule insulino-positive e moltiplicando per 100. </li><li> dopo determining la percentuale di proliferazione cellule beta per ciascun campione, determinare se una differenza statisticamente significativa nella proliferazione delle cellule β-esiste tra controllo e campioni sperimentali, analizzando i risultati con un one-way ANOVA utilizzando il software statistico disponibile in commercio. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Lo studio della proliferazione β-cellule in coltura è tipicamente ostacolato da diverse difficoltà. In primo luogo, le linee β-cellule immortalati sono caratterizzati da elevati livelli di proliferazione di quello che si trova in endogene cellule beta nelle isole dal vivo. Inoltre, queste linee cellulari immortalizzate mancano della normale architettura critica per la normale funzione β-cellule. Questi due fatti rendono difficile determinare se i risultati ottenuti utilizzando immortalati linee β-cellule terrà vero durante il test in vivo o in isolette intere. Il nostro protocollo descritto, che utilizza appena isolate isole di topo intatte, elude questi problemi come l&#39;architettura isolotto è mantenuta e la proliferazione β-cellula è paragonabile a quello trovato in vivo. Una preoccupazione significativo quando la coltura isolotti intatti è la possibilità che le cellule all&#39;interno del nucleo isolotto saranno sottoposti necrosi indotta da ipossia o non saranno esposti a rhCTGF. Per questo motivo, una finaleconcentrazione di 0,1 mM EGTA viene aggiunto al supporto per allentare contatti cellula-cellula senza interrompere architettura isolotto. Abbiamo precedentemente pubblicato che l&#39;aggiunta di EGTA solo può aumentare la proliferazione β-cellule, presumibilmente a causa di un maggiore accesso di nutrienti e mitogeni in media al nucleo isolotto 12. L&#39;incremento della proliferazione β-cellule in risposta a EGTA potrebbe anche essere dovuta alla diminuzione in contatto cellula-cellula stessa 13,14. I mezzi di comunicazione descritte in questo protocollo è inoltre integrato con siero di cavallo al posto del più tradizionale siero fetale bovino. Questa sostituzione viene effettuata per la presenza di lattogeno placentare in siero fetale bovino, che può stimolare la proliferazione β-cellule da solo, potenzialmente complicando analisi nel saggio di proliferazione. Determinazione della tossicità relativa delle microsfere di PLGA (con o senza il COI) verso le cellule insulari può essere valutata mediante immunofluorescenza di markers di morte cellulare o di danni al DNA, tra cui TUNEL o γ-H2AX 15,16. Anche se l&#39;aggiunta di microsfere di PLGA non ha dimostrato alcun effetto negativo evidenti isolotti ex vivo, gli utenti dovrebbero essere consapevoli degli effetti delle microsfere possono avere sulla analisi delle immagini. Come mostrato nella Figura 3 e menzionato nella sezione risultati, microsfere non degradati possono essere evidente come macchie scure presenti immagini di immunofluorescenza, con più microsfere che appaiono quando le concentrazioni crescenti vengono utilizzati. Va notato che il protocollo descritto è stato adattato per funzionare con isole isolate di topo. Come tale, non è chiaro se le condizioni identiche lavoreranno con isolotti raccolte da organismi alternativi, quali ratti e gli esseri umani. In particolare, isolotti raccolte da organismi diversi hanno spesso diverse condizioni ottimali di coltura e diversi gradi di proliferazione delle cellule β-17,18. numerosi BIOMateriali sono potenzialmente disponibili per amministrare rhCTGF di isole isolate, tra cui poli (tiochetale-uretano) e poli (propilene solfuro) 19. Abbiamo scelto di concentrarsi su PLGA a causa di diverse qualità importanti che possiede. In primo luogo, PLGA è un reagente relativamente abbordabile e le microsfere possono essere generati con equipaggiamento standard (centrifuga, omogeneizzatore, liofilizzatore) disponibile presso la maggior parte degli istituti di ricerca. PLGA è un polimero artificiale che ha precedente per uso con successo in dispositivi approvati FDA per la sua biocompatibilità, biodegradabilità, e la sua capacità di modulare tassi di rilascio compound 20. PLGA degrada per idrolisi in presenza di acqua, rilasciando il suo carico nel processo. La composizione chimica delle particelle PLGA può essere adattato in modo tale che un composto è rilasciata in vivo nel periodo di diverse settimane. PLGA è stato utilizzato anche in studi preclinici su animali e terapie cliniche umane per amministrare localmente composti a vari organi e Tissues 21,22. Altri polimeri idrofobi possono anche essere usati nella generazione di microsfere biodegradabili. Questi polimeri possono rispondere a specifici stimoli ambientali, come il pH, la temperatura, e la presenza di specie reattive dell&#39;ossigeno 23,24. Così, i ricercatori dovrebbero considerare attentamente quali biomateriale è più appropriato per i loro studi. Ogni ricercatore utilizzando PLGA, o di altri biomateriali, per studiare la proliferazione delle cellule β-ex vivo dovrebbero essere consapevoli dei potenziali differenze tra gli effetti di incapsulato COI rispetto ai non incapsulata COI. Ad esempio, l&#39;erogazione di rhCTGF con PLGA potrebbe cambiare il grado di temporizzazione e di β-cellule induzione proliferazione rispetto al trattamento con la proteina incapsulata. Gli studi in corso nel nostro laboratorio stanno attualmente esaminando queste differenze di potenziale. L&#39;analisi della proliferazione β-cellule in coltura isolotti è un potente modello di identificazione e meanalisi chanistic di mitogeni β-cellule. Utilizzando il test descritto qui vi mostriamo un metodo relativamente rapido e conveniente per la gestione di un COI a isolate isolotti in coltura con un veicolo di consegna a rilascio prolungato. Questo test dovrebbe essere applicabile a quasi tutte le COI di interesse, e la nostra scelta di concentrarsi su CTGF è puramente basato sulla sua capacità precedentemente pubblicato di stimolare la proliferazione delle cellule β-in vivo e ex vivo 11. Inoltre, questo test può convalidare l&#39;efficacia e la sicurezza di utilizzare PLGA come un metodo di consegna prima di passare a modelli in cui isolotti vengono trapiantate negli organismi viventi. Nel complesso, il protocollo descritto fornisce un nuovo modo per somministrare composti a isolotti coltivate con un ampio impatto sul misurando la sicurezza del PLGA al tessuto transplantable.

Pancreatiche beta-cellule sono le uniche cellule che producono insulina nel corpo e sono fondamentali per mantenere l&#39;omeostasi del glucosio nel sangue. Mentre gli individui sani hanno massa β-cellule sufficienti e la funzione di regolare correttamente il glucosio nel sangue, le persone con diabete sono caratterizzati da massa β-cellule insufficiente e / o la funzione 1,2. E &#39;stato proposto che induce la proliferazione delle cellule β-in ultima analisi può aumentare la massa β-cellulare e ripristinare l&#39;omeostasi del glucosio nei soggetti con diabete 3. Tuttavia, la valutazione e la validazione di potenziali composti proliferative β-cellule in isolotti intatto è necessario, prima di terapie efficaci possono essere sviluppate. Il trapianto di isole umane cadavere in individui con diabete di ripristinare l&#39;omeostasi del glucosio nel sangue per un certo tempo, ma la disponibilità e il successo di questa procedura sperimentale è ostacolato da una carenza di isole umane disponibili per il trapianto e la morte delle cellule beta nelle isole di poppaER trapianto 4. Anche con la scoperta di fattori che inducono la moltiplicazione delle cellule che producono insulina, una sfida importante esiste ancora nella realizzazione di questi fattori per siti rilevanti in vivo. Una strategia per la consegna locale sostenuto di composti proliferative β-cellule è il poli (lattico-co-glicolico) Acido (PLGA). PLGA ha una storia di uso in prodotti approvati dalla FDA di consegna della droga a causa della sua elevata sicurezza, biodegradabilità, e cinetica di rilascio prolungato 5. In particolare, PLGA è un copolimero di lattide e glicolide che degrada per idrolisi con acqua in vivo o in coltura in acido lattico e acido glicolico, che sono naturalmente presenti metaboliti nel corpo. Il composto farmaco incapsulato può essere rilasciato nell&#39;ambiente circostante sia diffusione e / o meccanismi di rilascio di degradazione controllata. Incapsulamento di COI fornisce protezione contro la degradazione enzimatica, migliorando la biodisponibilità del reagente rispetto a unencapsulaTed COI 5. Si consiglia di microsfere di PLGA può essere utilizzato per amministrare composti candidati a isolotti intatti nella cultura, e in ultima analisi in vivo. Testare l&#39;efficacia di PLGA per amministrare mitogeni β-cellule di isolotti ex vivo è fondamentale prima di protocolli di trapianto sono esplorate. Attualmente, non esiste una tecnica per misurare la proliferazione β-cellule di animali vivi. Gli esperimenti per valutare l&#39;efficacia di potenziali composti proliferative in vivo quindi richiedere la somministrazione di questi composti per animali vivi, con successiva dissezione e lavorazione di pancreas per immunomarcatura. Tali protocolli sono costosi e laboriosi e richiedono il composto deve essere somministrato per via sistemica, senza alcuna garanzia che raggiungeranno gli isolotti. Viceversa, diverse linee β-cellulari immortalizzate sono disponibili per lo studio delle cellule che producono insulina in coltura, ma queste linee cellulari mancano l&#39;architettura isolotto e environment trovato negli organismi viventi 6. Linee β-cellulari immortalizzate sono anche caratterizzati come aventi un più alto grado di replicazione di endogene beta cellule in vivo, complicando l&#39;analisi di composti che inducono la proliferazione così. In questo studio, si descrive un protocollo che utilizza isolotti intatti isolati da topi adulti. A differenza di linee di β-cellule, isolotti intatti conservano normale architettura isolotto. Allo stesso modo, a differenza di esperimenti condotti in vivo, il funzionamento composti proliferative direttamente isolotti intatti coltura riduce significativamente la quantità di reagenti che è necessario misurare con precisione la proliferazione β-cellule. L&#39;attuale studio utilizza PLGA per amministrare un COI, in questo esempio, fattore ricombinante umano del tessuto connettivo della crescita (rhCTGF). Il metodo qui descritto conferisce un vantaggio significativo rispetto la somministrazione del composto grezzo di isolotti coltivate in quanto consente un rilascio continuo di composto in the media. In particolare, questo dosaggio può essere modificato per gestire un&#39;ampia varietà di proteine ​​e anticorpi di interesse per isolette intatte. Effetti su altri tipi di cellule endocrine, tra cui alfa-cellule, possono anche essere analizzati.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>For labeling COI with fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>For dissolving fluorophore in step 1</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Desalting column used in step 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotics for islet media</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement for pre-assay islet media</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Used in dissociating islets</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>For fixing cells</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>For permeabilizing cells</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blocking reagents for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antibody</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Fast drying mounting media</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>For lyophilization of microspheres</td></tr></tbody></table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

Lo sviluppo di biomateriali ha aumentato significativamente il potenziale per la consegna mirato di farmaci ad una varietà di tipi di cellule e tessuti, incluse le cellule beta del pancreas. Inoltre, biomateriale particelle, idrogel, e ponteggi offrono anche l&#39;opportunità unica di amministrare sostenuta, controllabile somministrazione di farmaci ai beta-cellule in coltura e nei modelli di tessuto trapiantato. Queste tecnologie permettono lo studio dei fattori di proliferazione candidato β-cellule utilizzando isolotti intatti e un sistema di traslazione rilevante. Inoltre, determinare l&#39;efficacia e la fattibilità di fattori candidati per stimolare la proliferazione delle cellule β-in un sistema di coltura è fondamentale prima di andare avanti a modelli in vivo. Qui, si descrive un metodo di co-coltura isole di topo intatte con composti biodegradabili di interesse (COI) poli MOLLA (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) microsfere al fine di valutare gli effetti della sostenuta in situ rilascio ofattori mitogeni F sulla proliferazione β-cellule. Questa tecnica viene descritto in dettaglio come generare microsfere di PLGA contenenti un carico desiderato utilizzando reagenti commercialmente disponibili. Mentre la tecnica descritta utilizza fattore ricombinante umano connettivo crescita tissutale (rhCTGF), come esempio, potrebbe essere facilmente utilizzata un&#39;ampia varietà di COI. Inoltre, questo metodo utilizza piastre a 96 pozzetti per minimizzare la quantità di reagenti necessarie per valutare la proliferazione β-cellule. Questo protocollo può essere facilmente adattato per usare biomateriali differenti e altre caratteristiche cellulari endocrine come la sopravvivenza delle cellule e lo stato di differenziazione.

La figura 1 è una rappresentazione visiva delle microsfere generate utilizzando il protocollo di cui sopra. Il protocollo qui descritto produce microsfere rhCTGF-caricati di varie dimensioni. La frazione più grande di microsfere sarà compreso tra 1 e 10 micron di diametro, anche se alcune microsfere possono essere più grandi (Figura 2). Se lo si desidera, dimensioni microsfere può essere sintonizzato ed ottimizzato sulla base di parametri di fabbricazione quali velocità omogeneizzazione e tempo, concentrazione di tensioattivo utilizzato, e relativi volumi di ciascuna fase acqua / olio / acqua 10. Dopo la dispersione di isolotti intatti trattati con microsfere di PLGA e successiva immunomarcatura, è comune che le regioni del campione privo di etichettatura tra cellule (Figura 3). Mentre la maggior parte delle microsfere ancora intatte dopo il periodo di trattamento coltura sonorimosso durante le fasi di lavaggio, alcuni rimangono dopo gli isolotti sono filate sui vetrini da microscopio. Queste microsfere causano le strutture del foro-come visualizzati durante l&#39;imaging. Queste microsfere residue in genere non interferiscono con successiva quantificazione. Dopo l&#39;imaging, la percentuale di cellule Ki67-positive / insulina-positivo può essere quantificata contando manualmente il numero totale di cellule marcate, o utilizzando l&#39;analisi dell&#39;immagine software. In precedenza, abbiamo dimostrato che il fattore ricombinante umano del tessuto connettivo della crescita (rhCTGF) in grado di stimolare la proliferazione del mouse β-cellule in isolotti intatti ex vivo 11. Utilizzando il protocollo di cui sopra, abbiamo generato microsfere di PLGA contenenti rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Trattare isolette intatte con microsfere rhCTGF-PLGA per 3 giorni hanno comportato un aumento simile nella proliferazione delle cellule β-come precedentemente riportato con la proteina grezza, a dimostrazione che la proteina non ha lo<html> SE qualsiasi funzionalità durante la generazione di microsfere (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig1.jpg" /> Figura 1:. Visiva Rappresentazione di PLGA Microsfere Incorporando un colorante fluorescente nel protocollo di fabbricazione, microsfere di PLGA può essere osservata con un microscopio epifluorescente. Barra della scala rappresenta 200 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig2.jpg" /> Figura 2:. Dimensione Distribuzione di PLGA Microsfere Sebbene distribuzione delle dimensioni possono variare, la maggior parte delle microsfere sarà inferiore a 10 micron di diametro.Arget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig3.jpg" /> Figura 3:. Visualizzazione immunofluorescente di disperso in proliferazione beta cellule disperse isolotti sono immunolabeled per il marcatore di proliferazione Ki67 (rosso) e insulina (verde) per marcare proliferazione cellule beta. I nuclei sono etichettati con DAPI (blu). Le frecce indicano le cellule Ki67-positivo / insulino-positivo. Asterischi (*) indicano microsfere non alterate. Barra della scala rappresenta 100 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig4.jpg" /> Figura 4: Quantificazione e analisi della β-cellule Proproliferazione. isolotti trattata con diverse quantità di microsfere rhCTGF-PLGA. Il numero di cellule Ki67-positive / insulino-positive è stato contato manualmente da tutti i campioni ed espresso come percentuale del numero totale di cellule beta insulino-positive. Asse X corrisponde alla concentrazione finale di rhCTGF presente in ogni trattamento. La significatività statistica è stata determinata usando un one-way ANOVA seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. La significatività statistica è stata fissata a p ≤ 0,05. Barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Ricerca

Medicina

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioingegneria

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

LEPR

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

A High-contenuti

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi