Name: sustained administration of β-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
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The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Vanderbilt. 1. El etiquetado con fluoróforo COI (Opcional) <ol><li> Elija un colorante fluorescente que reaccionará con una amina primaria libre (por ejemplo, en una proteína), tales como ésteres de succinimidilo o derivados de fluoresceína, para visualizar la carga de las microesferas. Disolver exceso molar 8x (con relación a moles de COI) de fluoróforo en 200 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Resuspender 50 mg de COI hasta un volumen final de 800 l en una solución de vehículo (concentración final de 62,5 ng / l). La solución de vehículo variará dependiendo de la fuente de la COI. NOTA: El vehículo típico soluciones incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) o DMSO. </li><li> Añadir toda la solución de fluoróforo / DMSO del paso 1.1 y resuspender el COI. Vortex durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, vórtice la mezcla de reacción a temperatura ambiente(RT) durante 4 h. </li><li> Después de la reacción de marcaje, eliminar el exceso de fluoróforo utilizando una columna de desalado. <ol><li> Escurrir tampón de almacenamiento de la columna de desalación y enjuague con 16 ml de agua desionizada. Desechar todo el flujo a través. </li><li> Añadir el COI marcado con fluorescencia a la columna de desalado. Eluir con 1,2 ml de agua desionizada y se recoge el flujo a través. </li><li> etapa de elución repetir un adicional de cuatro veces, cada vez añadiendo 1,2 ml de agua desionizada y recoger el flujo a través de como una muestra separada. </li><li> Congelar todo el flujo de recogida a través de las muestras a -80 ° C y liofilizar según las instrucciones del fabricante para las 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. COI-cargada de microesferas Preparación través del agua de agua-en-aceite-en-Emulsión disolvente de evaporación Método <ol><li> Añadir 1 COI mg de marcado con fluorescencia a 100 l de agua desionizada para formar la primera fase de agua (W1). </li><li> Disolver 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactida: glicolida, peso molecular 54.000 - 69.000) en 750 l de diclorometano en un tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate de 10 a 30 seg (a 160 W) para disolver completamente el PLGA. Esto forma la fase de aceite (O). </li><li> Añadir toda la fase W1 generado en la etapa 2.1 a la fase O de una manera gota a gota. Emulsionar usando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar la fase W1 / O. </li><li> Añadir toda la fase de E / S W1 de una manera gota a gota a 15 ml de una 1% (peso / volumen) de poli acuoso (alcohol de vinilo) de solución (PVA) y emulsionar utilizando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 sec . </li><li> Transferir todo de la emulsión generada en la etapa 2.4 a un 200 ml matraz de fondo redondo y sujeto a un 635 mm Hg de vacío usando un evaporador rotatorio durante 1 hora para eliminar el disolvente y generar la fase acuosa. </li><li> Alícuota de 1 ml de la fase acuosa generado en la etapa 2.5 a catorce tubos de microcentrífuga. Centrifugación de la solución acuosa en los tubos de microcentrífuga a 7500g durante 8 min. NOTA: En este paso, las microesferas están presentes en la solución acuosa remanente y se concentran a la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Retire cuidadosamente 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga. <ol><li> Se lavan las microesferas de exceso de PVA por adición de 1 ml de agua desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 xg durante 8 min, y de nuevo retirar con cuidado 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga. NOTA: La solución acuosa de 100 l restante contiene las microesferas generados. </li></ol></li><li> Congelar la solución acuosa de microesferas generada en el paso 2.7 a -80 ° C. </li><li> microesferas liofilizar utilizando un liofilizador de acuerdo con el fabricante delinstrucciones y almacenar a -20 ° C. NOTA: medir la eficiencia de carga de la COI disolviendo completamente microesferas de PLGA y la determinación de la concentración de proteína en relación con una curva estándar de la proteína libre 7. </li><li> Como control negativo, generar un lote de microesferas &quot;en blanco&quot; (en lo sucesivo, microesferas de control). NOTA: La generación de microesferas de control es idéntica a la generación de microesferas cargadas-COI hidrófilos, sin adición COI a 800 l de la solución de vehículo en el paso 1.2. partículas de control de ajuste de la concentración de masa de PLGA en relación con microesferas de PLGA cargadas-COI para el ensayo de mitógeno de las células β. </li></ol> 3. Preparación de los islotes Medios de cultivo y medios de comunicación pre-ensayo <ol><li> Preparar 200 ml de medio para el cultivo de islotes de ratón intactas: RPMI 1640 suplementado con glucosa 11 mM, 10% de suero de caballo, 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (en lo sucesivo, esdejar que los medios de cultivo). NOTA 1: A diferencia de suero fetal bovino (FBS), suero de caballo carece de lactógeno placentario, un inductor de la proliferación de células β, que confunde análisis en el ensayo de proliferación. NOTA 2: Como las microesferas de PLGA no se esterilizan antes de su uso, la adición de antibióticos al medio de cultivo es crucial para evitar la contaminación microbiológica. </li><li> Retire 25 ml de medio de cultivo de islotes con una pipeta electrónica y colocar en un tubo cónico de 50 ml. Suplemento los 25 ml de medios de cultivo de los islotes en el tubo cónico de 50 ml con una concentración final de EGTA 0,2 mM para generar los medios de pre-ensayo. NOTA: La adición de EGTA afloja ligeramente contactos célula-célula en los islotes sin alterar la arquitectura de los islotes. Esto ayuda a asegurar la COI puede llegar a las células internas del islote y ayuda a prevenir la necrosis de la isleta central. </li></ol> 4. El cultivo de islotes intactos mouse <ol><li> Aislar islotes intactos de una cepa pre-seleccionado, sexo, age, y el genotipo de los ratones después de una digestión con colagenasa de rutina del 8,9 páncreas. Piscina islotes juntos desde como muestras. </li><li> Alícuota de 40 islotes en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos en 200 l de medio de cultivo de los islotes. islotes de tamaño de los partidos visualmente por pocillo (una evaluación precisa de la equivalencia de los islotes (IEQ) entre las muestras no es necesario). Llenar los pozos vacíos inmediatamente adyacentes a los pozos con islotes con 200 l de agua estéril para amortiguar los problemas de evaporación. Cultura islotes en los medios de comunicación durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2. </li></ol> 5. Re-suspensión de microesferas de control de PLGA cargadas con los países de origen y <ol><li> Después de la recuperación de los islotes durante la noche, las microesferas de volver a suspender mediante la adición de medios de pre-ensayo a una alícuota de liofilizados microesferas de PLGA cargadas con COI de tal manera que la concentración final de COI en el tubo de microcentrífuga es 10 ng / l (la cantidad de COI presente en una cantidad dada de los micros generadosFeres se determinó en el paso 2.9). Sonicar las microesferas cargadas-COI volvió a suspender en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C. </li><li> Resuspender de control de PLGA microesferas añadiendo el mismo volumen de medio pre-ensayo a una masa igual de control liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar las microesferas resuspendidas control de PLGA en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C. </li><li> confirmar visualmente microesferas se dispersan con la pipeta 2 l de microesferas resuspendidas entre dos portaobjetos de vidrio. Visualizar microesferas utilizando un objetivo 40X en un microscopio de epifluorescencia o campo claro. </li><li> Si la agregación significativa de las microesferas es aún visible, se somete a ultrasonidos en un baño de agua con hielo durante otros 10 min a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C y repita la visualización de microesferas resuspendidas. </li></ol> 6. Tratamiento de los islotes con control de PLGA microesferas cargadas con los países de origen o &lt;/ P&gt; <ol><li> Para cada pocillo para ser tratados con microesferas cargadas-COI, preparar medio de ensayo diluyendo el 10 ng / l de las microesferas resuspendidas COI con los medios de pre-ensayo para un volumen final de 100 l y una concentración final predeterminado. NOTA: La concentración final óptima de la proteína variará para cada COI utilizado para este ensayo. Idealmente, una gama de concentraciones finales se prueban. </li><li> Para cada pocillo para ser usado como control, preparar los medios de ensayo de control mediante la dilución de los de control resuspendidos microesferas de PLGA generados en la etapa 5.2 con el mismo volumen de dilución usado para diluir las microesferas cargadas con COI en el paso 6.1. NOTA: Los islotes tratados con medio de ensayo de control servirán como control negativo para permitir la detección de cualquier efecto de las microesferas en blanco pueden tener sobre los resultados experimentales. </li><li> Retire cuidadosamente 100 l de medio de cultivo de los islotes de cada pocillo con una micropipeta de tal manera que no hay islotes se desprenden de los pozos. añadir con cuidado 100 μl de medio de ensayo o 100 l de medio de ensayo de control a cada pocillo. </li><li> Incubar islotes a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2 durante tres días. </li></ol> 7. La dispersión de los islotes intactos Onto portas de microscopio <ol><li> Después de tres días, utilizar una micropipeta para retirar cuidadosamente y deseche medio de ensayo de todos los pozos de modo que no se desprenda islotes. añadir con cuidado 200 l de PBS a los islotes de lavarlas del medio de ensayo. Con cuidado, retirar y desechar PBS con una micropipeta y lavar suavemente islotes de nuevo con un 200 l de PBS adicional. </li><li> Retire y deseche PBS con una micropipeta y añadir 100 l de 0,025% de tripsina, la solución 2 mM de EDTA. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Pipet islotes en la solución de tripsina-EDTA arriba y hacia abajo cada 2 min hasta islotes se confirman visualmente a ser dispersados ​​en células individuales (tenga en cuenta que algunos pequeños grupos de células pueden todavía estar presente) utilizando un microscopio de luz. Transferir la totalidad del volumen de cada pozo individualLy en tubos de microcentrífuga labeled-. </li><li> Añadir 400 l de medio de cultivo de los islotes a cada tubo de microcentrífuga para detener la disociación celular de tripsina mediada. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 100 xg a 4 ° C para sedimentar las células de los islotes a la parte inferior de los tubos de microcentrífuga. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con micropipeta, y el sedimento se vuelve a suspender en 200 medios de cultivo de islotes l fresco. </li><li> Usando una cito-centrífuga, centrífuga disociado islotes a 140 xg durante 3 min en portaobjetos de microscopio cargados. </li><li> Air secar los portaobjetos a TA durante 10 minutos, a continuación, dibuje un cuadro alrededor de los islotes disociadas con un rotulador hidrófobo. </li><li> Fijar las células con 75 l 4% de paraformaldehído (PFA) a TA durante 10 min. Retire el 4% PFA y lavar suavemente las células en 75 l de PBS dos veces. Después del lavado, permeabilizar las células con 75 l 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 10 min. A continuación, lavar las células con 75 l de PBS. Precaución: PFA se sabe que es alergénica cancerígenos y tóxicos. </li></ol&gt; 8. La inmunofluorescencia etiquetado de los islotes disociada de la insulina y el marcador de proliferación celular, Ki67 <ol><li> Preparar una cámara húmeda mediante la colocación de dos toallas de papel húmedo en el fondo de una caja portaobjetos de microscopio capacidad 100 de diapositivas. </li><li> Lugar se desliza hacia abajo planas (células hacia arriba) en la cámara húmeda. Preparar las muestras para el etiquetado mediante la aspiración de la PBS de la etapa de lavado anterior utilizando una micropipeta y la adición de 75 l de solución de bloqueo (5% normal burro suero (NDS) en PBS) a cada diapositiva para bloquear la unión no específica de anticuerpos a las muestras. Incubar los portaobjetos en solución de bloqueo durante 1 hora a RT. </li><li> Suavemente aspirado de solución de bloqueo utilizando una micropipeta y añadir 75 l de solución de anticuerpo primario que contiene de cobaya anti-insulina y anticuerpos de conejo anti-Ki67, se diluyó 1 mg / ml en 5% NDS en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. NOTA: Los marcadores alternativos de proliferación celular incluyen la proliferación de núcleos de células antígeno (PCNA) y phosphohistone H3 (PH3), </li><li> Se aspira suavemente la solución de anticuerpo primario utilizando una micropipeta y enjuagar las células con 75 l de PBS. Aspirar PBS utilizando una micropipeta y enjuagar las células dos veces más, cada vez con 75 l de PBS. Incubar cada muestra con 75 l anti-conejillo de indias Cy5 y anticuerpo secundario anti-conejo Cy3 anticuerpo secundario diluido a 2 g / ml en solución de bloqueo durante 1 hora a RT. NOTA: No utilizar anticuerpos secundarios marcados con el mismo o superposición espectral fluoróforo que ya se utiliza para etiquetar las microesferas. </li><li> solución de anticuerpo secundario Aspirar utilizando una micropipeta y se incuban en 75 l de 300 nM DAPI en PBS durante 3 min a TA. Aspirar DAPI utilizando una micropipeta y enjuague en agua desionizada durante 5 min. </li><li> Se aspira suavemente el agua de las muestras utilizando una micropipeta. Detectar una gota (aproximadamente 100 l) de la solución de montaje de secado rápido que contiene antifade reactivo sobre un cubreobjetos de vidrio. Invertir el lado microscopio muestra de deslizarse hacia abajo, ore a la solución de montaje. Presione suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos con una punta de pipeta para eliminar las burbujas y limpie el exceso de líquido con un tejido suave de limpieza. Permitir cubreobjetos de secar durante la noche a TA. </li></ol> 9. Adquisición de imágenes y análisis <ol><li> Utilizar un microscopio de epifluorescencia con una cámara adjunta para la adquisición de imágenes. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo óptimo de exposición (normalmente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para la insulina, y 250 ms para Ki67). Asegúrese de parámetros de adquisición de imágenes son iguales para todas las muestras. </li><li> Para cada muestra, contar manualmente 3.000 células positivas para insulina y de los que contar cuántas son también Ki67 positivo. Sólo contar las células positivas para insulina que tienen un núcleo bien definido y claramente visible. Calcular el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra dividiendo el número de las células Ki67 positivas / positivas para insulina por el número total de células positivas para insulina y multiplicando por 100. </li><li> después dara determinar el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra, determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en la proliferación de células β entre el control y las muestras experimentales mediante el análisis de los resultados con un ANOVA de una vía utilizando el software estadístico comercialmente disponible. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El estudio de la proliferación de células β en cultivo típicamente se ve obstaculizada por varias dificultades. En primer lugar, las líneas de células inmortalizadas β se caracterizan por grados más altos de proliferación de lo que se encuentra en las células beta en los islotes endógenos en vivo. Además, estas líneas celulares inmortalizadas carecen de la arquitectura normal crítico para la función de las células β normal. Estos dos hechos hacen que sea difícil determinar si los resultados obtenidos usando líneas de células inmortalizadas β será verdad cuando se prueba in vivo o in islotes completos. Nuestro protocolo descrito, que utiliza recién aisladas islotes de ratón intactas, evita estos problemas ya que la arquitectura de los islotes se mantiene y la proliferación de células β es comparable a la encontrada in vivo. Una preocupación importante cuando se cultiva islotes intactos es la posibilidad de que las células dentro del núcleo de islotes serán sometidos a la necrosis inducida por hipoxia o no estarán expuestos a rhCTGF. Por esta razón, una finalse añade concentración de EGTA 0,1 mM a los medios de comunicación para aflojar contactos célula-célula sin interrumpir la arquitectura de los islotes. Hemos publicado previamente que la adición de EGTA solo puede aumentar la proliferación de células β, presumiblemente debido a un mayor acceso de nutrientes y mitógenos en los medios de comunicación con el núcleo de los islotes 12. El aumento de la proliferación de células β en respuesta a EGTA también podría ser debido a la disminución en el contacto célula-célula en sí 13,14. Los medios descritos en este protocolo también se complementa con suero de caballo en lugar del suero más tradicional bovino fetal. Esta sustitución se hace debido a la presencia de lactógeno placentario en suero bovino fetal, que puede estimular la proliferación de células β por sí mismo, complicando potencialmente el análisis en el ensayo de proliferación. Determinación de la toxicidad relativa de las microesferas de PLGA (con o sin el COI) a las células de los islotes se puede evaluar mediante el análisis de inmunofluorescencia de markers de la muerte celular o el daño del ADN, incluyendo TUNEL o γ-H2AX 15,16. Aunque la adición de microesferas de PLGA no ha mostrado ningún efecto perjudicial evidentes a islotes ex vivo, los usuarios deben ser conscientes de los efectos de las microesferas pueden tener en el análisis de imágenes. Como se demuestra en la Figura 3 y se ha mencionado en la sección de resultados, no degradadas microesferas pueden ser evidentes como manchas oscuras dentro de imágenes de inmunofluorescencia, con más microesferas que aparecen cuando se utilizan concentraciones crecientes. Debe tenerse en cuenta que el protocolo descrito ha sido adaptado para trabajar con islotes aislados de ratón. Como tal, no está claro si las condiciones idénticas trabajarán con islotes cosechadas a partir de organismos alternativos, tales como ratas y seres humanos. Notablemente, islotes cosechado de diferentes organismos a menudo tienen diferentes condiciones óptimas de cultivo y diferentes grados de proliferación de las células β 17,18. numerosos biomateriales están potencialmente disponibles para administrar rhCTGF a los islotes aislados, incluyendo poli (tiocetal-uretano) y poli (sulfuro de propileno) 19. Elegimos a centrarse en PLGA debido a varias cualidades notables que posee. En primer lugar, PLGA es un reactivo relativamente asequible y las microesferas se puede generar con el equipo estándar (centrífuga, homogeneizador, liofilizador) disponible en la mayoría de las instituciones de investigación. PLGA es un polímero artificial que tiene precedente para uso con éxito en dispositivos aprobados por la FDA debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad, y su capacidad para modular las velocidades de liberación compuesto 20. PLGA se degrada por hidrólisis en presencia de agua, liberando su carga en el proceso. La composición química de las partículas de PLGA se puede adaptar de tal manera que un compuesto se libera in vivo durante el periodo de varias semanas. PLGA también se ha utilizado en ensayos preclínicos con animales y terapias clínicos en humanos para administrar localmente compuestos a diversos órganos y tissues 21,22. Otros polímeros hidrófobos también se pueden utilizar en la generación de microesferas biodegradables. Estos polímeros pueden responder a estímulos ambientales específicos, tales como el pH, la temperatura, y la presencia de especies reactivas de oxígeno 23,24. Por lo tanto, los investigadores deben considerar cuidadosamente qué biomaterial es el más apropiado para sus estudios. Cualquier investigador que utiliza PLGA, u otros biomateriales, para estudiar la proliferación de células β ex vivo deben ser conscientes de las posibles diferencias entre los efectos de la COI encapsulado en comparación con los países de origen no encapsulado. Por ejemplo, la entrega de rhCTGF través de PLGA podría cambiar el grado de y el momento de la inducción de la proliferación de células β comparación con el tratamiento con la proteína no encapsulado. Los estudios en curso en nuestro laboratorio están examinando estas diferencias de potencial. El análisis de la proliferación de células β en los islotes de cultivo es un modelo de gran alcance para la identificación y mechanistic análisis de mitógenos de células β. Usando el ensayo descrito aquí mostramos un método relativamente rápido y rentable para la administración de un conflicto de interés a los islotes aislados cultivadas con un vehículo de entrega de liberación prolongada. Este ensayo debe ser aplicable a casi cualquier COI de interés, y nuestra elección de centrarse en CTGF está puramente basado en su capacidad publicado previamente para estimular la proliferación de las células β in vivo y ex vivo 11. Además, este ensayo puede validar la eficacia y seguridad del uso de PLGA como un método de entrega antes de avanzar a los modelos en los islotes son trasplantados en los organismos vivos. En general, el protocolo descrito proporciona una nueva forma de administrar compuestos a los islotes cultivados con un impacto más amplio en la medición de la seguridad de PLGA al tejido transplantable.

células ß pancreáticas son las únicas células productoras de insulina en el cuerpo y son críticos para mantener la homeostasis de glucosa en sangre. Mientras que los individuos sanos tienen suficiente masa de células β y la función de regular adecuadamente la glucosa en sangre, las personas con diabetes se caracteriza por la masa de células β insuficiente y / o función 1,2. Se ha propuesto que la inducción de la proliferación de células β última instancia, puede aumentar la masa de células β y restaurar la homeostasis de la glucosa en individuos con diabetes 3. Sin embargo, la evaluación y validación de los posibles compuestos de proliferación de células β en los islotes intactos es necesario antes de terapias eficaces se pueden desarrollar. El trasplante de islotes de cadáveres humanos en los individuos con diabetes restaura la homeostasis de la glucosa en sangre durante un tiempo, pero la disponibilidad y el éxito de este procedimiento experimental se ve obstaculizada por la escasez de islotes humanos disponibles para el trasplante y la muerte de las células beta en los islotes de popatrasplante er 4. Incluso con el descubrimiento de los factores que inducen la multiplicación de las células productoras de insulina, un reto importante todavía existe en la entrega de estos factores a sitios relevantes in vivo. Una estrategia para la entrega local sostenida de compuestos de proliferación de células β es el poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tiene una historia de uso en productos aprobados por la FDA de administración de fármacos debido a su alta seguridad, biodegradabilidad, y la cinética de liberación prolongada 5. Específicamente, PLGA es un copolímero de lactida y glicolida que se degrada por hidrólisis con agua, ya sea in vivo o en cultivo en ácido láctico y ácido glicólico, que son metabolitos de origen natural en el cuerpo. El compuesto fármaco encapsulado puede ser liberado en el medio ambiente circundante tanto por difusión y / o mecanismos de liberación de degradación controlada. La encapsulación de COI proporciona protección contra la degradación enzimática, mejorar la biodisponibilidad del reactivo en comparación con unencapsulaTed COI 5. Sugerimos que microesferas de PLGA se pueden utilizar para administrar compuestos candidatos a islotes intactos en cultivo, y en última instancia en vivo. Prueba de la eficacia de PLGA para administrar los mitógenos de las células β de los islotes ex vivo es crítico antes se exploran los protocolos de trasplante. Actualmente, no existe una técnica para medir la proliferación de células β de animales vivos. Los experimentos para evaluar la eficacia de los compuestos potenciales de proliferación in vivo, por tanto, requiere la administración de estos compuestos a los animales vivos, con la disección posterior y el procesamiento de los páncreas de inmunomarcación. Tales protocolos son caros y laboriosos y requieren que el compuesto se administra por vía sistémica, sin ninguna garantía de que van a llegar a los islotes. Por el contrario, varias líneas de células inmortalizadas β están disponibles para el estudio de las células productoras de insulina en la cultura, pero estas líneas celulares carecen de la arquitectura de los islotes y ambient encuentra en los organismos que viven 6. Líneas de células inmortalizadas β también se caracterizan por tener un grado mucho más alto de replicación de las células beta endógenas in vivo, por lo tanto el análisis de compuestos que inducen la proliferación de complicación. En este estudio, se describe un protocolo que utiliza islotes intactos aisladas de ratones adultos. A diferencia de las líneas de células β, islotes intactos conservan la arquitectura normal de los islotes. Asimismo, en contraste con los experimentos llevados a cabo in vivo, la administración de compuestos proliferativos directamente a islotes intactos cultivadas reduce significativamente la cantidad de reactivos que es necesario medir con precisión la proliferación de células β. El estudio actual utiliza PLGA para administrar un COI, en este ejemplo, el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF). El método descrito aquí confiere una ventaja significativa sobre la administración del compuesto en bruto a los islotes cultivadas ya que permite una liberación continua del compuesto en THmedios electrónicos. En particular, este ensayo puede ser modificado para administrar una amplia variedad de proteínas y anticuerpos de interés a los islotes intactos. Efectos en otros tipos de células endocrinas, incluyendo las células alfa, también pueden analizarse.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>For labeling COI with fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>For dissolving fluorophore in step 1</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Desalting column used in step 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotics for islet media</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement for pre-assay islet media</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Used in dissociating islets</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>For fixing cells</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>For permeabilizing cells</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blocking reagents for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antibody</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Fast drying mounting media</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>For lyophilization of microspheres</td></tr></tbody></table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

El desarrollo de biomateriales ha aumentado significativamente el potencial para la entrega dirigida de fármacos a una variedad de tipos de células y tejidos, incluyendo las células ß pancreáticas. Además, las partículas de biomateriales, hidrogeles, andamios y también proporcionan una oportunidad única para administrar sostenida, la administración de fármacos controlable para ß-células en cultivo y en modelos de tejidos trasplantados. Estas tecnologías permiten el estudio de los factores de proliferación de células β candidato utilizando islotes intactos, así como un sistema de traslación correspondiente. Por otra parte, la determinación de la eficacia y la viabilidad de los factores de candidatos para estimular la proliferación de las células β en un sistema de cultivo es fundamental antes de seguir adelante con los modelos in vivo. Aquí se describe un método para co-cultivo de islotes de ratón intactas con el compuesto biodegradable de interés (CDI) poli RESORTE (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de evaluar los efectos de la liberación sostenida in situ ofactores mitogénicos f sobre la proliferación de las células β. Esta técnica se describe en detalle cómo generar microesferas de PLGA que contienen una carga deseada usando reactivos disponibles comercialmente. Mientras que la técnica descrita utiliza el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF) como un ejemplo, fácilmente se podría utilizar una amplia variedad de COI. Además, este método utiliza placas de 96 pocillos para reducir al mínimo la cantidad de reactivos necesarios para evaluar la proliferación de células β. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar biomateriales alternativos y otras características de las células endocrinas, tales como la supervivencia celular y el estado de diferenciación.

La Figura 1 es una representación visual de las microesferas generadas utilizando el protocolo anterior. El protocolo descrito aquí produce microesferas cargadas con rhCTGF de varios tamaños. La mayor fracción de microesferas estará entre 1 y 10 micras de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes (Figura 2). Si se desea, el tamaño de las microesferas se puede ajustar y optimizado sobre la base de parámetros de fabricación tales como la velocidad de homogeneización y el tiempo, la concentración de agente tensioactivo usado, y los volúmenes relativos de cada fase de agua / aceite / agua 10. Después de la dispersión de islotes intactos tratados con microesferas de PLGA y la posterior immunolabeling, es común ver a regiones de la muestra desprovista de etiquetado en entre las células (Figura 3). Mientras que la mayoría de las microesferas que aún están intactas después del período de tratamiento de cultivo seeliminado durante las etapas de lavado, algunos permanecen después de que los islotes se hacen girar sobre los portaobjetos de microscopio. Estas microesferas hacen que las estructuras de tipo agujero visualizados durante la exploración. Estas microesferas residuales típicamente no interfieren con la posterior cuantificación. Después de formación de imágenes, el porcentaje de células Ki67 positivas / positivas para insulina puede cuantificarse contando manualmente el número total de células marcadas, o el uso de análisis de imágenes de software. Anteriormente, hemos demostrado que conectivo Factor de crecimiento del tejido humano recombinante (rhCTGF) puede estimular la proliferación de células β de ratón en islotes intactos ex vivo 11. Utilizando el protocolo antes mencionado, hemos generado microesferas de PLGA que contienen rhCTGF (rhCTGF-PLGA). El tratamiento de islotes intactos con microesferas de PLGA-rhCTGF durante 3 días resultó en un aumento similar en la proliferación de células β como se informó anteriormente con la proteína cruda, lo que demuestra que la proteína no hizo lo<html> tilice cualquier funcionalidad durante la generación de microesferas (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig1.jpg" /> Figura 1:. Visual Representación de PLGA Las microesferas Mediante la incorporación de un colorante fluorescente en el protocolo de fabricación, las microesferas de PLGA puede ser visualizado usando un microscopio de epifluorescencia. La barra de escala representa 200 micras. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig2.jpg" /> Figura 2:. Distribución de Tamaño de PLGA Las microesferas Aunque la distribución de tamaño puede variar, la mayoría de microesferas será inferior a 10 micras de diámetro.arget = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig3.jpg" /> Figura 3:. Visualización de inmunofluorescencia de Disperso La proliferación de las células ß Dispersos islotes se immunolabeled para el marcador de proliferación Ki67 (rojo) e insulina (verde) para marcar la proliferación de las células ß. Los núcleos están etiquetados con DAPI (azul). Las flechas indican las células Ki67 positivas / positivas para insulina. Asteriscos (*) indican microesferas no degradado. La barra de escala representa 100 micras. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig4.jpg" /> Figura 4: Cuantificación y análisis de células β-Proproliferación. islotes tratados con diferentes cantidades de microesferas de PLGA-rhCTGF. El número de células Ki67 positivas / positivas para insulina se contó manualmente de todas las muestras y se expresó como un porcentaje del número total de células beta positivas para insulina. El eje X corresponde a la concentración final de rhCTGF presente en cada tratamiento. La significación estadística se determinó usando un ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey. La significación estadística se estableció en p ≤ 0,05. Las barras de error representan el error estándar de la media. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54664/54664fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K vistas.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Video: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Investigación

Medicina

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioingeniería

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biología

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse

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