يسمح بروتوكولنا بالتقاط الصلة الجينية بين الآفات الأولية والفوقية من خلال تحديد التعديلات الجزيئية التي تنطوي عليها تطور المرض. يوفر أسلوبنا الفرصة لاستكشاف الصلة الوراثية في العينة السريرية مع حساسية عالية وخصوصية عالية. ويرجع ذلك إلى تكامل التحليل الجزيئي والهدولوجي.
تقييم التغايرية داخل الورمور في مجال أبحاث السرطان له أهمية قصوى في تصميم استراتيجيات فعالة لمكافحة الورم وطريقتنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على العديد من أنواع الأورام الصلبة. بعد إعداد وقياس حجم المكتبات ذات الاهتمام، تمييع كل مكتبة إلى تركيز 100 بيكوموراري في مياه خالية من النوى والجمع بين 10 ميكرولترات من كل مكتبة مخففة لتشغيل واحد في أنبوب واحد. ثم اخلط المكتبات المجمعة عن طريق الأنابيب.
لبدء تشغيل تسلسل، أولاً فتح متصفح تورنت على جهاز كمبيوتر متصل بنظام التسلسل. خطة تشغيل جديد باستخدام القالب العام للتطبيق المحدد وتحت مجموعة التبويب حدد نظام ايون بروتون أو نظام ايون جين ستوديو S5. حدد الشريحة المناسبة من القائمة المنسدلة نوع رقاقة وحدد Ion AmpliSeq 2.0 مكتبة عدة من قائمة المكتبة المنسدلة.
حدد زر Ion Chef لمجموعة النماذج وحدد مجموعة الشيف المناسبة من القائمة المنسدلة لمجموعة طقم القالب. حدد مجموعة التسلسل المناسبة من القائمة المنسدلة مجموعة التسلسل وحدد أيون اكسبريس من قائمة قائمة قائمة الباركود المنسدلة مجموعة. ضمن علامة التبويب البرنامج المساعد ، حدد البرنامج المساعد لتحليل التغطية.
ضمن علامة التبويب الخطة، حدد الجينوم GRCH37HG19 من القائمة المنسدلة مكتبة المراجع. من القائمة المنسدلة للمناطق المستهدفة، حدد اللوحة المناسبة التي سيتم تسلسلها. ثم قم بتعيين عدد الباركود لتسلسله وتعيين اسم الرمز الشريطي واسم العينة لكل مكتبة.
بالنسبة لتخفيف المكتبات المجمعة ، قم بتخفيف مكتبة المخزون بمياه خالية من النوى إلى تركيز 25 بيكوموراري لرقاقة بروتون أيونية وماصة 50 ميكرولترات من كل مكتبة مخففة إلى أسفل أنبوب عينة المكتبة المناسبة. تحميل أنابيب العينة التي تحتوي على المكتبات المخففة المجمعة على نظام إعداد المكتبة وبدء التضخيم التخفي. بالنسبة لتسلسل الجيل التالي، اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لتهيئة الأداة.
عند الانتهاء من التضخيم التخفي، افتح باب أداة Ion Chef، ثم افتح غطاء جهاز الطرد المركزي لتحميل الرقاقة وأزل الرقائقتين من نظام إعداد المكتبة. ضع الرقاقات في حاويات تخزين رقائق منفصلة وحمّل إحدى الرقائق في حجرة الرقاقة في الأداة. ثم أغلق غطاء حجرة الرقاقة وابدأ في التسلسل.
لتحليل الطفرات، افتح البرنامج المساعد لتحليل التغطية واستخدم ناتج تحليل التغطية للتحقق من عمق التغطية والاتساق. استخدام البرنامج المساعد Torrent Variant Caller لتنفيذ استدعاء البديل اختيار الخط الجرثومي أو سير العمل الجسدي حسب الاقتضاء. ثم تحميل المتغيرات المصفاة البديلة تنسيق الملفات واستخدام البرمجيات البديل تأثير التنبؤ في قاعدة البيانات NCBI RefSeq لإضافة تعليقات على المتغيرات.
لتقدير الاختلافات رقم نسخة، استخدم أيون مراسل تحميل البرنامج المساعد لتحميل البيانات تسلسل في برنامج مراسل أيون واستخدام شامل السرطان السرطان ورم سير العمل الزوج لتحليل البيانات. تصفية يدويا الطفرات ونسخ عدد الاختلافات على أساس الدرجات التي تم تعيينها من قبل البرنامج والتحقق من الاختلافات بصريا مع عارض الجينوم التكاملية. ثم فحص بصريا المحاذاة لقرأات غير عادية التي قد تولد المكالمات artifactual وفحص التغطية تطبيع لجميع أمبيركونس عبر جين معين ضد التغطية تطبيع خط الأساس للتحقق من الاختلافات رقم نسخة.
لكل حالة، مؤشر المكالمات طفرة من تسلسل الأنسجة الطبيعية أو الدم أو الورم الأولي أو الانبثاث. وضع علامة كخط جرثومي وتجاهل المكالمات الواضحة أيضًا من بيانات تسلسل الحمض النووي للخط الجرثومي. العلم كما clonal أو مؤسس الطفرات التي يتم تقاسمها بين جميع الآفات من مريض معين.
ثم العلم تحت النسيل أو التقدم أو الطفرات التي يتم الكشف عنها في بعض ولكن ليس كل آفات مريض معين. في هذه التجربة التمثيلية، حددت تعدد الآفات من خمس حالات الأورام الزائفة الصلبة التي تستهدف تسلسل الترميز من 409 جينات مرتبطة بالسرطان ما مجموعه 27 طفرات جسدية في ثمانية جينات. تم تعريف الطفرات على أنها مؤسس أو clonal عندما المشتركة بين جميع الآفات من مريض معين والتقدم أو تحت الجلد عندما اكتشفت في بعض ولكن ليس كل من آفات مريض معين.
باستمرار، كان التلطيخ المناعي للنوع من بيتا-catenin و KMD6A متجانس بين الآفات المتنوعة للحالات مع طفرات الجينات المقابلة. تشير التلطيخ المعتدلة لـ KMD6A في العينات المتحولة إلى أن التغيير الجيني من المرجح أن يغير الوظيفة بدلاً من التعبير عن البروتين. يرتبط فقدان وظيفة KMD6A في أورام البنكرياس مع تنظيم ما يصل من مؤشر نقص الأكسجة GLUT-1.
وبناء على ذلك ، كان أكثر من GLUT - 1 أعرب عنها في الحالات التي تحمل KMD6A الطفرات. وأكد الكيمياء المناعية لBAP1 وTP53 أن الطفرات في تلك الجينات كانت دون كلينال. في هذا النمط الإفتراضي من حالة تمثيلية تظهر الموقع، القرب، وحالة عدد النسخ للجينات المعدلة، كشف تحليل اختلاف رقم النسخ باستخدام بيانات التسلسل عن تغيرات في جميع العينات التي تم تحليلها.
وعلى النقيض من الطفرات نقطة، كانت غالبية التعديلات الاختلاف عدد نسخة تحت التخفي. التحقق من صحة وفهرسة الطفرات ونسخة من الاختلاف في عدد واستخدام الورم الطبيعي الحمض النووي مقارنة مهمة لتجنب توليد المكالمات artifactual التي يمكن أن تبطل النتائج. ويمكن أيضا تطبيق هذا الإجراء على دراسات تسلسل الجينوم بأكمله تهدف إلى استجواب الجينوم بأكمله لتحديد الطفرة بين الآفة من أنواع مختلفة من الأورام الصلبة.
في مجال أبحاث السرطان، تعتبر هذه التقنيات أدوات حاسمة لفهم بيولوجيا الأمراض ذات الآثار السريرية الهامة التي تهدف إلى تصميم علاجات مستهدفة شخصية وفعالة.
