Araştırmamız, tek hücre düzeyinde sitotoksik potansiyellerini daha iyi anlamak için tek efektör CAR T hücrelerini hedef hücrelerle kapsülleyerek CAR T hücrelerinin fonksiyonel çeşitliliğini değerlendirmeye odaklanmaktadır. Mevcut sitotoksisite testleri sınırlıdır çünkü bunlar genellikle toplu olarak gerçekleştirilir. Bu, bireysel CAR T hücreleri arasındaki farkları gözden kaçırır ve hedeflere farklı yanıtlar veren farklı alt popülasyonları tanımlayamaz.
Teknolojimiz, standart akış sitometreleri ve hücre sıraları kullanarak tek bir hücre formatında multipleks hücre öldürme testlerini mümkün kılar. Bu, komşu hücrelerden herhangi bir girişim olmadığı için toplu protokollerden daha kesin sonuçlar verir. Bu tür bir araştırmanın, bizim ve diğer bilim adamlarının, CAR'larımızın daha ince ayrıntılarını ve tek hücre düzeyinde nasıl işlev gördüklerini daha iyi incelememize izin vereceğini umuyoruz.
Başlamak için, Dulbecco'nun PBS'sinde iki floresan boyanın stok çözeltilerini 1: 5.000 oranında seyreltin. Hücreleri ayrı 15 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpleri 300 g'da beş dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkarın ve menekşe floresan boyanın çalışma çözeltisindeki efektör hücre peletlerini yeniden süspanse edin. Uzak kırmızı floresan boyanın çalışma çözeltisinde hedef hücre peletlerini yeniden süspanse edin. Lekeli hücreleri 37 santigrat derece nemlendirilmiş karbondioksit inkübatörde 20 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri pelet yapmak için beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Hücre peletlerini yıkamak için 15 mililitre tam RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Tekrar yıkayın ve santrifüjleyin.
Daha sonra süpernatanı çıkarın ve efektör hücre peletlerini 225 mikrolitre tam RPMI 1640 ortamında ve hedef hücre peletlerini aynı ortamın 450 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. Efektör hücre süspansiyonlarına 30 mikrolitre gradyan ortam ve hedef hücre süspansiyonlarına 60 mikrolitre ekleyin. Pipetlemeden önce gradyan orta stok çözeltisini iyice karıştırın.
Ardından, Granzyme B substrat stoğunu tam RPMI 1640 ortamı ile önceden seyreltin. Efektör hücre süspansiyonlarına ve hedef hücre süspansiyonlarına pipet peridyum iyodür stok çözeltisi ve seyreltilmiş Granzim B substratı. Ardından çözeltileri iyice karıştırmak için pipetleyin.
Hücreleri kapsüllemek için, kapsülleme kartuşunu ve stabilize edici solüsyonu oda sıcaklığına önceden ısıtın. Hücreler için tam RPMI 1640 ortamı, %33 dengeleyici çözelti ve %10 gradyan ortamı ekleyin. Ve bir dış ortam stoğu hazırlamak için bunları karıştırın.
Her kapsülleme numunesi için, 1.5 mililitrelik bir tüpte 65 mikrolitre hazırlanmış efektör hücre süspansiyonu ile 65 mikrolitre hazırlanmış hedef hücre süspansiyonunu karıştırın. Hücreleri bir pipetle iyice yeniden süspanse edin. Kapsülleme kartuşunun belirtilen kuyucuklarını verilen sırayla reaktiflerle yükleyin.
Reese, yüklemeden hemen önce hücreleri bir pipetle iyi bir şekilde askıya alır. Contayı dikkatlice kartuşun üzerine kapatın. Kartuşu mikroakışkan cihaza aktarın, ardından kullanım kılavuzuna göre kapsüllemeye başlayın.
Çalışma tamamlandıktan sonra, kartuşu çıkarın ve damlacıkları üst üste binme ortamında yeniden süspanse ederek ve bir kapaklı iki mililitrelik DNA düşük bağlayıcı tüpe aktararak D kuyusundan hasat edin. Kalan damlacıkları toplamak için A kuyusundan kalan dış ortamla D kuyusunu yıkayın. Damlacıklar toplama tüplerinde çökeldiğinde, mikroskobik incelemeden önce tüplerde açıkça farklı iki fazı doğrulayın.
10 mikrolitrelik bir pipet ucunun yaklaşık üçte birini damlacık tabakasının yüzeyinden damlacıklarla doldurun. Ardından, pipet ucunun kalan yaklaşık üçte ikisini kaplama ortamıyla doldurun. Numuneyi hemen sekiz odacıklı bir cam slayta yükleyin.
Hücrelerle damlacık yüklemesini doğrulamak için damlacıkları 4x ve 20x büyütmede mikroskobik olarak inceleyin. Kuluçka için, gerekli sayıda iki mililitre DNA düşük bağlayıcı tüpün kapağını dikkatlice delmek için 21 gauge şırınga iğnesi kullanın. Her inkübasyon tüpüne bir mililitre dış ortam ekleyin.
Üst üste binen ortamda oluşan damlacıkları yeniden süspanse edin ve her üretimi hazırlanmış üç inkübasyon tüpüne bölün. Damlacık oluşumundan sonra tüpleri iki, dört veya altı saatlik inkübasyon için inkübatöre dik olarak yerleştirin. İnkübasyondan sonra, az sayıda damlacığı bir mikroskop lamına aktarın.
Uygun lazer ve filtre konfigürasyonuna sahip standart bir floresan mikroskobu kullanarak parlak alan ve floresan mikroskobu ile damlacıkları analiz edin. Her bir damlacık örneğini kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan numuneleri beş mililitrelik FAC tüplerine aktarın.
Damlacıkları standart bir akış sitometresi ile analiz edin. İleri saçılma, yan saçılma ve incelenen floroforlar için yoğunluk yükseklik sinyallerini kaydedin. Akış sitometresini numune enjeksiyon portundan yıkayın Standart temizleme ve durulama solüsyonları kullanarak her damlacık alımından sonra.
CAR T hücreleri, anti NGFR manyetik boncuklar kullanılarak her iki donör için %98'in üzerinde bir saflığa kadar başarılı bir şekilde zenginleştirildi ve CD4-CD8 oranları, naif benzeri bir hafıza fenotipi gözlenerek 0.73'te ölçüldü. Deneyde transdüksiyon yapılmamış T hücreleri kontrol olarak kullanıldı. Dört saatlik inkübasyondan sonra floresan mikroskobu, CAR T hücreleri ile kokapsüle edilmiş JeKo-1 hücreleri ile damlacıklarda Granzim B sekresyonunu gösterirken, transdüksiyon olmayan T hücreleri ile sekresyon tespit edilmedi.
Akış sitometrisi, kapsüllenmiş hücre tiplerine dayalı olarak farklı damlacık popülasyonlarını tanımladı ve CAR T hücreleri ve JeKo-1 hedef hücreleri içeren damlacıklarda belirgin Granzyme B sekresyonu ve sitotoksik aktivitenin meydana geldiğini doğruladı. CAR T hücreleri tarafından granzim B sekresyonu ve hedef hücre öldürmesi, altı saat sonra Granzim B'yi salgılayan %30'dan fazla CAR T hücresi ve propidyum iyodür pozitifliği ile gösterildiği gibi hedef hücreleri öldüren CAR T hücrelerinin %20'sinden fazlası ile zamana bağlı bir artış sergiledi.
