Nossa pesquisa se concentra em avaliar a diversidade funcional das células T CAR, encapsulando células T CAR efetoras únicas com células-alvo para entender melhor seu potencial citotóxico no nível de célula única. Os ensaios de citotoxicidade atuais são limitados porque geralmente são realizados em massa. Isso ignora as diferenças entre as células T CAR individuais e não identifica subpopulações distintas com respostas variadas aos alvos.
Nossa tecnologia permite ensaios multiplex de eliminação de células em um único formato de célula usando citômetros de fluxo padrão e pedidos de células. Isso fornece resultados mais precisos do que os protocolos em massa, uma vez que não há interferência de células vizinhas. Esperamos que esse tipo de pesquisa permita que nós e outros cientistas examinemos melhor os detalhes mais sutis de nossos CARs e como eles funcionam no nível de uma única célula.
Para começar, dilua as soluções de estoque de dois corantes fluorescentes na proporção de 1:5.000 no PBS de Dulbecco. Transfira as células para tubos separados de 15 mililitros. Centrifugue os tubos a 300g por cinco minutos.
Remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos de células efetoras na solução de trabalho do corante fluorescente violeta. Ressuspenda os grânulos da célula-alvo na solução de trabalho do corante fluorescente vermelho distante. Incube as células coradas por 20 minutos em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado a 37 graus Celsius.
Após a incubação, centrifugue as células a 300g por cinco minutos para pelletá-las. Ressuspenda os pellets de células em 15 mililitros de meio RPMI 1640 completo para lavá-los. Lave e centrifugue novamente.
Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets da célula efetora em 225 microlitros de meio RPMI 1640 completo e os pellets da célula-alvo em 450 microlitros do mesmo meio. Adicione 30 microlitros de um meio gradiente às suspensões de células efetoras e 60 microlitros às suspensões de células-alvo. Misturar bem a solução de reserva de gradiente médio antes de pipetar.
Em seguida, pré-dilua o substrato Granzyme B com meio RPMI 1640 completo. Pipetar a solução-mãe de iodeto de perídio e o substrato diluído de Granzyme B para as suspensões de células efetoras e suspensões de células-alvo. Em seguida, pipete para misturar bem as soluções.
Para encapsular as células, pré-aqueça o cartucho de encapsulamento e a solução estabilizadora à temperatura ambiente. Adicione a solução estabilizadora completa de 33% do meio RPMI 1640 para células e o meio de gradiente de 10%. E misture-os para preparar um caldo de meio externo.
Para cada amostra de encapsulamento, misture 65 microlitros de suspensão de células efetoras preparadas com 65 microlitros de suspensão de células-alvo preparadas em um tubo de 1,5 mililitro. Ressuspenda bem as células com uma pipeta. Carregue os poços indicados do cartucho de encapsulamento com reagentes na ordem dada.
Reese suspende bem as células com uma pipeta antes do carregamento. Sele a junta cuidadosamente no cartucho. Transfira o cartucho para o dispositivo microfluídico e, em seguida, inicie o encapsulamento de acordo com o manual do usuário.
Após a conclusão da execução, remova o cartucho e colha as gotículas do poço D, ressuspendendo-as no meio de sobreposição e transferindo-as para um tubo de baixa ligação de DNA de dois mililitros com tampa. Lave o poço D com o meio externo restante do poço A para coletar as gotículas restantes. Quando as gotículas tiverem sedimentado nos tubos de coleta, confirmar duas fases claramente distintas nos tubos antes do exame microscópico.
Encha aproximadamente um terço de uma ponta de pipeta de 10 microlitros com gotículas da superfície da camada de gotículas. Em seguida, encha os cerca de dois terços restantes da ponta da pipeta com o meio sobreposto. Carregue imediatamente a amostra em uma lâmina de vidro de oito câmaras.
Examine as gotículas microscopicamente com ampliação de 4x e 20x para confirmar o carregamento de gotículas com células. Para incubação, use uma agulha de seringa de calibre 21 para perfurar cuidadosamente a tampa do número necessário de tubos de baixa ligação de DNA de dois mililitros. Adicione um mililitro de meio externo a cada tubo de incubação.
Ressuspenda as gotículas geradas no meio sobreposto e divida cada produção em três tubos de incubação preparados. Coloque os tubos na posição vertical na incubadora por duas, quatro ou seis horas de incubação após a geração de gotículas. Após a incubação, transfira um pequeno número de gotículas para uma lâmina de microscópio.
Analise as gotículas por microscopia de campo claro e fluorescência usando um microscópio de fluorescência padrão com configuração apropriada de laser e filtro. Ressuspenda cada amostra de gotículas no meio sobreposto. Transfira as amostras ressuspensas para tubos FAC de cinco mililitros.
Analise as gotículas com um citômetro de fluxo padrão. Registre sinais de altura de intensidade para dispersão direta, dispersão lateral e fluoróforos examinados. Lave o citômetro de fluxo através da porta de injeção de amostra Após cada conjunto de aquisições de gotículas usando soluções padrão de limpeza e enxágue.
As células T CAR foram enriquecidas com sucesso a uma pureza de mais de 98% para ambos os doadores usando esferas magnéticas anti NGFR e sua relação CD4-CD8 foi quantificada em 0,73 com um fenótipo de memória ingênuo observado. Células T não transduzidas foram usadas como controles no experimento. A microscopia de fluorescência após quatro horas de incubação demonstrou secreção de Granzima B em gotículas com células JeKo-1 coencapsuladas com células T CAR, enquanto nenhuma secreção foi detectada com células T não transduzidas.
A citometria de fluxo identificou populações distintas de gotículas com base nos tipos de células encapsuladas, confirmando que a secreção pronunciada de Granzima B e a atividade citotóxica ocorreram em gotículas contendo células T CAR e células-alvo JeKo-1. A secreção de Granzima B e a morte de células-alvo por células T CAR exibiram um aumento dependente do tempo, com mais de 30% de células T CAR secretando Granzima B após seis horas e mais de 20% das células T CAR matando células-alvo, conforme indicado pela positividade de iodeto de propídio.
