Наши исследования сосредоточены на оценке функционального разнообразия CAR-T-клеток путем инкапсуляции одиночных эффекторных CAR-T-клеток с клетками-мишенями для лучшего понимания их цитотоксического потенциала на уровне отдельных клеток. Современные анализы цитотоксичности ограничены, поскольку они часто проводятся в больших количествах. При этом упускаются из виду различия между отдельными CAR-Т-клетками и не удается идентифицировать отдельные субпопуляции с различной реакцией на мишени.
Наша технология позволяет проводить мультиплексные анализы уничтожения клеток в формате одной клетки с использованием стандартных проточных цитометров и клеточных порядков. Это дает более точные результаты, чем массовые протоколы, так как нет помех от соседних ячеек. Мы надеемся, что этот тип исследований позволит нам и другим ученым лучше изучить более мелкие детали наших CAR и то, как они функционируют на уровне одной клетки.
Для начала разбавьте исходные растворы двух флуоресцентных красителей в соотношении 1:5 000 в PBS Dulbecco. Переложите клетки в отдельные пробирки объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при 300 г в течение пяти минут.
Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы эффекторных клеток в рабочем растворе фиолетового флуоресцентного красителя. Ресуспендируйте гранулы клеток-мишеней в рабочем растворе дальнего красного флуоресцентного красителя. Инкубируйте окрашенные клетки в течение 20 минут в инкубаторе с увлажненным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.
После инкубации центрифугируйте клетки при 300 г в течение пяти минут, чтобы гранулировать их. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 15 миллилитрах полной среды RPMI 1640 для их промывки. Промойте и снова центрифугируйте.
Затем удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы эффекторных клеток в 225 микролитрах полной среды RPMI 1640 и целевые клеточные гранулы в 450 микролитрах той же среды. Добавьте 30 микролитров градиентной среды в эффекторные клеточные суспензии и 60 микролитров в целевые клеточные суспензии. Хорошо перемешайте градиентный средний исходный раствор перед пипетированием.
Затем разбавьте субстрат Granzyme B полной средой RPMI 1640. Пипеткой пипетку в стоковом растворе йодида перидия и разведенным субстратом Гранзима В в эффекторные клеточные суспензии и суспензии клеток-мишеней. Затем пипеткой хорошо перемешать растворы.
Для герметизации ячеек необходимо предварительно нагреть картридж для инкапсуляции и стабилизирующий раствор до комнатной температуры. Добавьте полную среду RPMI 1640 33% стабилизирующего раствора для клеток и 10% градиентную среду. И смешайте их, чтобы приготовить запас наружной среды.
Для каждого образца инкапсуляции смешать 65 микролитров приготовленной суспензии эффекторных клеток с 65 микролитрами приготовленной суспензии целевых клеток в пробирке объемом 1,5 миллилитров. Хорошо суспендируйте клетки с помощью пипетки. Загрузите указанные лунки капсуляционного картриджа реагентами в заданном порядке.
Риз хорошо подвешивает ячейки с помощью пипетки прямо перед загрузкой. Тщательно запечатайте прокладку на картридже. Перенесите картридж в устройство микрофлюидики, затем начните инкапсуляцию в соответствии с руководством пользователя.
После завершения прогона извлеките картридж и соберите капли из лунки D, повторно суспендировав их в перекрывающей среде и перенеся в двухмиллилитровую пробирку с низким связыванием ДНК с крышкой. Хорошо промойте D оставшейся внешней средой из лунки А, чтобы собрать оставшиеся капли. Когда капли осели в пробирках для сбора, подтвердите наличие двух четко различимых фаз в пробирках перед микроскопическим исследованием.
Заполните примерно одну треть наконечника для пипетки объемом 10 микролитров каплями с поверхности слоя капли. Затем заполните оставшиеся примерно две трети наконечника пипетки покрывающим материалом. Немедленно загрузите образец на восьмикамерное предметное стекло.
Исследуйте капли под микроскопом при 4-кратном и 20-кратном увеличении, чтобы подтвердить нагрузку клеток на капли. Для инкубации с помощью иглы шприца 21 калибра осторожно проколотите крышку необходимого количества пробирок с низким связыванием ДНК объемом два миллилитра. Добавьте по одному миллилитру наружной среды в каждую инкубационную пробирку.
Ресуспендируйте капли, образующиеся в перекрывающей среде, и разделите каждую продукцию на три подготовленные инкубационные пробирки. Поместите пробирки в вертикальное положение в инкубатор на два, четыре или шесть часов инкубации после образования капель. После инкубации перенесите небольшое количество капель на предметное стекло микроскопа.
Анализируйте капли с помощью светлопольной и флуоресцентной микроскопии с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа с соответствующей конфигурацией лазера и фильтра. Суспендируйте каждый образец капли в перекрывающей среде. Переложите ресуспендированные образцы в пятимиллилитровые пробирки FAC.
Анализируйте капли с помощью стандартного проточного цитометра. Запись интенсивности сигналов высоты для прямого рассеяния, бокового рассеяния и исследуемых флуорофоров. Промывайте проточный цитометр через отверстие для ввода образца После каждого набора сбора капель с использованием стандартных чистых и промывочных растворов.
CAR-Т-клетки были успешно обогащены до чистоты более 98% у обоих доноров с использованием анти-NGFR магнитных шариков, а их соотношение CD4-CD8 было количественно определено на уровне 0,73 с наблюдаемым наивным фенотипом памяти. В качестве контроля в эксперименте использовались нетрансдуцированные Т-клетки. Флуоресцентная микроскопия после четырех часов инкубации показала секрецию гранзима В в каплях с клетками JeKo-1, инкапсулированными с CAR-Т-клетками, в то время как с нетрансдуцированными Т-клетками секреция не обнаруживалась.
Проточная цитометрия идентифицировала различные популяции капель на основе типов инкапсулированных клеток, подтвердив, что выраженная секреция Granzyme B и цитотоксическая активность имеют место в каплях, содержащих CAR T-клетки и клетки-мишени JeKo-1. Секреция гранзима В и уничтожение клеток-мишеней CAR-Т-клетками демонстрировали зависящее от времени увеличение: более 30% CAR-Т-клеток секретировали Granzyme B через шесть часов, и более 20% CAR-Т-клеток убивали клетки-мишени, о чем свидетельствует положительный результат на йодид пропидия.
