Hello.Today سنعرض لكم بروتوكولا يقوم بإنتاج ملايين الخلايا المتوسطة للذرة ، وتحويلها بكفاءة عالية. تتمثل الخطوات الرئيسية للبروتوكول أولا في هضم وإزالة جدار الخلية النباتية ، وإطلاق البروتوبلاست ، ثم تحويل البروتوبلاست باستخدام PEG. الفرق الكبير بين هذا البروتوكول وغيره هو حجم التحول.
تنتهي معظم البروتوكولات بما بين 1،000 و 10،000 بروتوبلاست محولة. ومع ذلك ، فإن بروتوكولنا يعطي الملايين من بروتوبلاستيدات الذرة المحولة. هنا لدينا شتلات الذرة المزروعة في الظلام لمدة تسعة إلى 11 يوما بعد الإنبات.
قطع الشتلات فوق مستوى التربة مباشرة ووضعها في الماء. حافظ على النباتات في الظلام عندما لا تكون قيد الاستخدام. حدد الأوراق الثانية والثالثة لكل شتلة ، مع الحرص على استبعاد الأوراق ذات المناطق البنية أو التالفة.
حدد 12 إلى 16 ورقة ، واقطع سنتيمترا واحدا من الأطراف. ثم قطع قسم 10 سم من كل ورقة. كومة أقسام الأوراق فوق بعضها البعض مع نهايات القاعدية معا.
ثبت الحزمة معا في الطرف القاعدي باستخدام مشبك الموثق. ضع حزمة الأوراق على قطعة من الورق الأبيض. قطع شرائح الأوراق التي يتراوح عرضها من 0.5 إلى ملليمتر واحد.
من المهم قطع شرائح رقيقة متسقة. بعد قطع جزء من حزمة الأوراق ، انقل الشرائح إلى محلول الإنزيم. لا تدع المادة تجف.
قم بتدوير محلول الإنزيم برفق لتبليل المادة. ضع ورق القصدير فوق الدورق لحجب الضوء. كرر هذه العملية حتى يتم قطع الحزمة بأكملها بالقرب من مشبك الموثق.
بعد القطع ، يجب أن يبدو الحل هكذا. انقل كأس محلول الإنزيم إلى جرة جرس. تسلل الفراغ لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
احتضان على شاكر منضدية عند 40 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ونصف. بعد الحضانة ، أعط الحل دوامة. يجب أن تبدو حليبي ، مما يدل على نجاح عملية الهضم.
احتضان على شاكر الطاولة عند 80 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى. ضع الكأس الزجاجية مع محلول الإنزيم على الثلج. وقف الهضم عن طريق إضافة حجم واحد من MMG الباردة الجليد.
تصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. قسم المحلول إلى حصص لا تزيد عن 10 ملليلتر لكل منهما. تصب في أنابيب زجاجية مستديرة القاع المبردة.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 100 غرام لمدة أربع دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات. قم بالتعليق ، ثم قم بتجميع العينات للغسيل اللاحق.
غسل البروتوبلاستيدات مرتين مع خمسة ملليلتر من MMG. تدور في كل مرة في 100 غرام لمدة ثلاث دقائق. يجب أن تكون الحبيبات جميلة ، لون أخضر أصفر مشرق.
ستتمكن من إعادة تعليق الحبيبات عن طريق تحريك الأنبوب برفق. أعد التعليق في ملليلتر واحد من MMG ، وقم بتخفيف حصة صغيرة من 10 إلى 20x للعد. من المهم إعادة التعليق جيدا قبل aliqouting ، حيث ستستقر البروتوبلاستيدات بسرعة.
تحميل البروتوبلاستيدات المخففة في مقياس الدم. عد البروتوبلاست تحت المجهر الضوئي. لن يحتوي التحضير الجيد على الكثير من الحطام الزائد الذي يطفو بعد الغسيل.
البروتوبلاستيدات الجيدة دائرية مع بلاستيدات مرئية. استخدم عدد الخلايا لحساب العدد الإجمالي. نتج عن هذا الإعداد ما يزيد قليلا عن 10 ملايين بروتوبلاست.
نوصي بالتحقق من الجدوى باستخدام صبغة ثنائي أسيتات الفلوريسين. تسفر عزلات البروتوبلاست الناجحة عن قابلية البقاء بين 70 و 90٪ امزج البروتوبلاستيدات مع البلازميد الذي يهمك. يستخدم هذا المثال 1 مليون بروتوبلاست و 15 ميكروغرام من الحمض النووي.
احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. أعد التعليق عن طريق النقر على جانب الأنبوب. أضف محلول PEG للوصول إلى تركيز نهائي قدره 12٪ PEG.
تخلط بلطف عن طريق قلب عدة مرات. البروتوبلاست ومحلول PEG هش، لذلك لا تهز الأنبوب. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
تمييع مع خمسة مجلدات من محلول الحضانة ، وتخلط بلطف عن طريق الانقلاب. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 100 غرام لمدة أربع دقائق. يغسل مرة واحدة مع واحد ملليلتر الحضانة العازلة.
احرص على عدم إزعاج الحبيبات. تدور في 100 غرام لمدة ثلاث دقائق. إعادة التعليق في المخزن المؤقت للحضانة إلى تركيز 500 إلى 1000 خلية لكل ميكرولتر.
احتضان في الظلام بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، تدور لأسفل في 100 غرام لمدة أربع دقائق. تغسل مرتين بمحلول حضانة مبرد.
قم بتدويرها في كل مرة لمدة ثلاث دقائق عند 100 جرام في درجة حرارة الغرفة. تعليق ، ثم تحميل حصصة صغيرة على مقياس الدم للفحص النهائي. أولا ، احسب العدد الإجمالي للبروتوبلاست تحت برايتفيلد.
الآن ، لاحظ جزء البروتوبلاست الذي يتألق تحت الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من النقل. تعبر البروتوبلاست عن مراسل هيئة أجيال السلام لدينا. الآن ، دعنا نحصل على بعض المقاييس حول كفاءة النقل.
في هذا الإعداد ، حصلنا على 10 ملايين بروتوبلاست إجمالا ، قمنا بنقل مليون منها. في اليوم التالي ، استعدنا 335،000. من بين هؤلاء ، كان لدينا معدل تحول بنسبة 30.3٪ ، وهذا يتركنا مع إجمالي حوالي 100،000 بروتوبلاست تعبر عن GFP.
يمكن أن تختلف كفاءة النقل. كما ترون في الرسم البياني ، نرى بشكل روتيني كفاءات تتراوح بين 20 و 50٪ بين الاستعدادات المتكررة. يسمح هذا البروتوكول بجمع وتحويل الملايين من بروتوبلاستات ميزوفيل الذرة.
أحد أفضل أجزاء البروتوكول هو قدرته على التوسع. من خلال قياس مقدار الحجم بالإضافة إلى عدد البروتوبلاستات المستخدمة في التحويل ، يمكنك زيادة تحولك بأكثر من ترتيب الحجم مما أظهرناه اليوم. حتى الآن ، بدأت أكبر تجربة أنبوب واحد لدينا ب 20 مليون بروتوبلاست و 200 ميكروغرام من الحمض النووي ، وانتهت ب 3.1 مليون بروتوبلاست محولة في اليوم التالي.
يعد بروتوكول الإنتاجية العالية هذا مفيدا بشكل خاص عندما تحتاج إلى اختبار العديد من تركيبات البلازميد المختلفة ، لكن المتعاونين استخدموا هذا البروتوكول لأغراض لا تتطلب القدرة على التوسع ، مثل تصميم دوائر الجينات الاصطناعية والذرة. شكرا لمشاهدة الفيديو الخاص بنا. نأمل أن يكون قد ساعد.
