Bu protokol, çok sayıda kültür çalışmasını araştırmak ve doğrudan hücre iletişimini araştırmak için yeni bir araç sağlamak için kullanılabilir. Bu yeni cihaz, bir kültür modeli oluşturmada önemli ölçüde zaman kazandırır ve belirli bir kaplama gerektiren veya gerektirmeyen farklı hücre tiplerine uygulanabilir. Gerçekten de, 3D baskılı eklerin dört bölmesi, farklı hücre tiplerinin tek katmanlı veya 3D olarak farklı kombinasyonlarla aynı şekilde kültürlenmesine izin verir.
3D baskılı ekler daha dayanıklı, esnek, ölçeklenebilirdir ve immünoloji veya androjenez gibi fizyopatolojilerin çalışmaları için deneysel modeller tasarlamak için kullanılabilir. Başlamak için, kitte sağlanan iki bileşeni, gıda silikonunu ve katalizörü, üreticinin talimatlarına göre %70 etanol ile sterilize edilmiş bir spatula kullanarak 10:1 oranında karıştırın. Karışımın alt kenarında homojen bir şekilde dağılması için ekleri silikon karışımın üzerine cımbızla uygulayın.
Ekleri altı oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin ve hücre kültürü ortamının herhangi bir sızıntısını önlemek için eklerin plaka ile yakın temas halinde olduğundan emin olmak için hafif bir basınç uygulayın. Silikonun katılaşma sürecini bir saat boyunca desteklemek için plakayı 37 santigrat dereceye koyun. Katılaşmadan sonra, plakaları 30 dakika ila bir saat boyunca% 70 etanol banyosuna batırarak eklerle sterilize edin.
Ardından, alkolü pipetleyerek atın ve plakayı bir hücre kültürü kapağında gece boyunca kurumaya bırakın. Dış kök kılıfının ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin keratinositlerini kültürlemek için, ortamı şişelerden atın ve hücreleri ayırmak için beş mililitre tripsin ekleyin. Dış kök kılıfının keratinositlerini içeren şişeyi beş dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye yerleştirin ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini içeren şişeyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
15 mililitrelik steril konik bir tüpte, dış kök kılıfının keratinositlerini içeren tripsin solüsyonunu% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş beş mililitre mezenkimal kök hücre ortamı ile karıştırın ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş beş mililitre endotel hücre ortamı ile karıştırın. Dış kök kılıfının keratinositlerini ve insan dermal mikrovasküler endotel hücresi süspansiyonlarını oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri kendi ortamlarının iki mililitresinde yeniden süspanse edin.
10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre tripan mavisi boya ile karıştırın ve 10 mikrolitre karışımı sayma slaytının haznesine ekleyin. Sayma slaytını hücre sayma sistemine yerleştirin ve hücre sayısını ve canlılığını tespit edin. Hücre süspansiyonunu ilgili ortamda mililitre başına 50.000 hücre konsantrasyonunda hazırladıktan sonra, 800 mikrolitre ila bir mililitre hücre süspansiyonunu tek tek büyük bölmelere ve 100 ila 150 mikrolitreyi bir pipetle ayrı küçük bölmelere dağıtın.
%5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş mezenkimal kök hücre ortamındaki keratinositleri ve endotel hücre ortamındaki insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini, küçük ve diğer büyük bölmelerde %5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş olarak görün. Hücre yapışması ve/veya olgunlaşmasına izin vermek için hücre kültürü plakasını %5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye veya normal koşullar altına yerleştirin. Bir pipet kullanarak eklerin farklı bölmelerinin kültür ortamını boşaltın.
Daha sonra hücreleri büyük bölmelerde bir mililitre 37 santigrat derece ılık PBS ve küçük bölmelerde 200 mikrolitre ile durulayın. Tüm hücre tipleri için uyumlu olacak şekilde seçilen ortak bir ortamdan üç mililitre ekleyin. Ko-kültürleri içeren plakayı 24 ila 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Hücre süspansiyonu sayımı için tripsin kullanarak hücreleri ayırın ve tripan mavisi boyamayı kullanarak canlılığı kontrol edin. Morfolojiyi gözlemledikten sonra, 24 ila 48 saatlik inkübasyondan sonra optik mikroskop altında deney sırasında farklı bölmelerin hücre sayısını sayın. İlk olarak, deneyin sonundaki altı oyuklu plakadan ekleri hafif bir bükülme ile çıkarın ve ardından silikonu çekerek eklerden çıkarın.
Ekleri geleneksel hücre kültürü deterjanları ve temizlik malzemeleriyle yıkayın. Daha sonra ekleri ileride kullanmak üzere bir otoklavda veya bir saat boyunca% 70 etanol banyosuna batırarak sterilize edin. Fenotip ve hücre canlılığı karşılaştırıldı, burada altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarında %90 canlılık gözlendi ve dış kök kılıfının keratinositleri için 3D baskılı eklerde %91 oranında gözlendi.
İnsan dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin canlılığı, altı oyuklu plakanın kuyucuklarında %85 iken, 3D baskılı eklerde %86 idi. 3D baskılı eklerdeki keratinositler ve endotel hücreleri arasındaki dolaylı hücre iletişimi, eklerdeki keratinositlerin varlığında, insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin proliferasyonunun 24 saat sonra 1,5 kat ve 48 saat sonra 3,1 kat arttığını göstermiştir. Bununla birlikte, dış kök kılıfı durum ortamının keratinositinin, insan dermal mikrovasküler endotel hücre proliferasyonunu 24 saat sonra 1,5 kat ve 48 saat sonra 2,1 kat önemli ölçüde artırdığı gösterilmiştir.
Keratinositlerin insan dermal mikrovasküler endotel hücre göçü üzerindeki etkisini belirlemek için 3D baskılı insert ko-kültür modeli test edildi. Kontrol durumunda, endotel hücreleri göç etti ve 24 saat sonra yara alanının yaklaşık% 44'ünü kapladı. Keratinosit varlığında, insan dermal mikrovasküler endotel hücre göçünde önemli bir artış gözlenmiştir, bu da yara alanının sırasıyla üç, 12 ve 24 saat sonra kaplandığını göstermektedir.
Benzer şekilde, HDMEC'lerin göçü, dış kök kılıfı durum ortamının keratinositlerinin varlığında artar. Hücre ortamının bir bölmeden diğerine sızmasını önlemek için, ek parçanın plakaya sızdırmazlığını sağlamak çok önemlidir. Proliferasyon, migrasyon, sedatif oluşum tahlilleri DNA, RNA, protein ve diğer analizler gibi çeşitli uygulamalar yapılabilir.
