Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Minnetle onu yardım için Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz ve Karen Levi, M.E., kendi giriş kalıp tasarımı için yazdırma 3D ile Dr Erica Stults (akademik araştırma ve uygulama bilim adamı, TEFE bilgi teknolojisi Hizmetleri) kabul, Kathy Suqui ve Jennifer Mann kalıp tasarımları test onların yardım için ve filme ile yaptığı yardım için Michael O'Keefe.  Bu eser tarafından NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 desteklenmiştir (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) ve NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).
<div></div>

1. 3D baskılı kalıp hazırlama
<ol><li>Bir CAD çizimi istenilen boyutta kalıp hazırlamak.</li>
	<li>CAD dosya yüksek çözünürlüklü bir 3D yazıcıya gönderin. Uygun plastik baskı malzeme, parlak yüzey ile seçin.</li>
	<li>Yazdırma işleminden sonra kalıp deterjan ve su ile iyice yıkayın.</li>
</ol>2. döküm PDMS negatifleri
<ol><li>PDMS temel istenilen miktarda bir denge üzerinde ölçmek. İçin bir kalıp ile 60 mm çapında ve 2 mm de mesajlar, 25 g kullanın.</li>
	<li>1:10 (w/w) kür aracısı ekleme oranı PDMS tabanına.</li>
	<li>İki bileşen iyice kombine kadar karistirin. Yetersiz karıştırma PDMS, "yapışkan" bir yüzey kaynaklanan eksik kür olarak neden olabilir.</li>
	<li>Laboratuvar bant PDMS temel katmanının üstünde basılı kuyu oluşumu etkinleştirmek için 3D baskı kalıpları sınırlarındaki bir parça yer.</li>
	<li>PDMS karışımı kalıba dökün ve kalıp de-gaz için tüm kabarcıklar serbest kadar vakum bir odaya yerleştirin.</li>
	<li>Kaldırmak için PDMS 50 ° c için 2-4 h veya yeterli katılaşmış kadar tedavi.</li>
	<li>Laboratuvar bandı çıkarın ve dikkatle PDMS negatif ayıklayın.</li>
	<li>O kalıp tam tedavi emin olmak için (sonra 3D baskılı kalıp kaldırılması) ek bir 1 h için 60 ° C'de PDMS kuluçkaya.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntı kaldırmak için PDMS deterjan ve su ile iyice yıkayın. Yetersiz yıkama zavallı halka oluşumunda PDMS negatif ilk kullanan için neden olabilir.</li>
</ol>3. özel Wells imalatı
<ol><li>Özel wells hücreleri tohum önce 1 gün hazırlayın.</li>
	<li>%2 (w/v) özel çözüm DMEM ve otoklav olun.</li>
	<li>İçine negatif bir autoclaved PDMS damlalıklı 4 mL erimiş özel. O zaman damlalıklı özel doğrudan PDMS yazı olarak negatif. Kabarcıklar inhomogeneities iyi boyutlarda neden gibi herhangi bir hava kabarcıkları damlalıklı bahşiş ile çıkarın.</li>
	<li>Not: kalıpları bantlayın değil; Böylece özel wells düzeye PDMS kaldırılması ve 6-şey kültür tabak içine yerleştirme özel üst yüzeyi düz, olması gerekir. Artık özel tekrar, her ne kadar birden çok kez re-autoclaved ve kullanılmış olabilir.</li>
	<li>Özel soğur sonra (4 mL özel; yaklaşık 10 dakikadır büyük kalıpları artık bu soğutma kez gerekebilir), dikkatle özel wells künt forseps kullanarak PDMS negatifleri ayırmak ve aktarım 6-şey plaka bir kuyunun içine.</li>
	<li>Tam kültür ortamında özel wells daldırın ve gecede kullanmadan bir 37 ° C kuluçka makinesi önce içinde equilibrate.</li>
</ol>4. tohum doku Yüzükler
<ol><li>Kültür sıçan aort düz kas hücreleri21 (RaSMCs) % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1'i içeren DMEM L-glutamine, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 sodyum pyruvate ve % 1 penisilin-streptomisin % 70 izdiham ulaşana kadar. Not: Hücreleri % 5 CO2 ve 37 ° C'de 15 cm doku kültürü plakaları kültürlü.</li>
	<li>Sonra kalıplar equilibrated (Bölüm 3), RaSMCs tohum için hazırlamak.</li>
	<li>Tabak tabak fosfat tamponlu tuz (PBS) başına 5 mL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>3 mL % 0.25 tripsin başına 15 cm Petri kabına ekleyin. Tabakları 37 ° C kuluçka makinesi 2-3 dakika, ya da hücreleri tabağını kaldırdı kadar gider.</li>
	<li>Tripsin tam kültür orta eşit bir hacmi (plaka başına 3 mL) ile nötralize. İyice kümeleri kadar kırmak için hücreleri resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 11: trypan mavi boya ile bir aliquot sulandırmak ve bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 200 x g hücreleri cips de 5 min için toplam hacmi santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>ML başına 10 milyon hücre bir konsantrasyon hücreleri resuspend; Bu 50 µL başına 500.000 hücre sonuçlanır. Not: Farklı hücre tipleri farklı hücre konsantrasyonları gerektirebilir.</li>
	<li>Tüm özel kalıp ortamından Aspire edin. Tüm Orta bireysel kuyulardan kaldırmak için ancak kuyu dipleri delmek değil dikkatli olun.</li>
	<li>Damlalıklı 50 µL süspansiyon her kuyuya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde taze orta özel kalıp dış çevresindeki 2 mL ekleyin. Özel kuyu orta taşma bırakmamaya dikkat et. Tabak gecede kuluçka (yaklaşık 16 h) yerleştirin.</li>
	<li>Gecede kuluçka sonra ortamından kalıpları dışında Aspire edin ve kalıpları ve yüzük tamamen batık 4.5 mL taze orta 6-şey plaka her şey için ekleyin. Değişim orta günlük.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada 3D baskı kullanarak kolayca özelleştirilmiş boyutları ile kendi kendine monte doku yüzük hızlı imalatı için çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bizim yöntem Svoronos ve arkiçinde bildirilen benzer. 6 , nerede 3D baskılı petek ve köpek kemiği şeklinde Mum kalıpları kullanılmıştır PDMS negatifleri oyuncular için. Ancak, kalıpları birkaç benzersiz tasarım özellikleri içerecek şekilde değiştirilmiş. Bir çentik (şekil 4A(1)) her halka etiketli ve ayrı ayrı takip izin vermek için kalıp yönünü sağlar. Merkez delik (şekil 4A(2)) kuyu içine orta Difüzyon artırmaya yardımcı olur. En düşük CAD dosya numaralarını doğrudan kalıp yazdırılır; Bu nedenle, PDMS negatifleri her sürüm numarasıyla etiketlenmiştir ve çapı (şekil 4A3) sonrası. İyi tekneler (Resim 3(2), 45 °) ve orta delik (şekil 3(3), 5 °) üstündeki konik Dış duvarları (şekil 3(1), 5 °), 3D baskı kalıpları PDMS negatifleri kaldırmak kolaylaştırır , ve özel wells PDMS negatifleri kaldırmak daha kolay (şekil 4A(2), A(4)).
Bu sistem çok yönlülük çap ve hücre tipleri, birincil insan düz kas hücreleri (SMCs)18,22, sıçan aort SMCs7 de dahil olmak üzere çeşitli kendi kendine monte halka şeklinde dokuların imalatı tarafından göstermiştir , 23, insan Mezenkimal Kök hücre (hMSCs)13ve SMCs elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs)11 (Tablo 1). Devam eden çalışmalarda, biz ek hücre tipleri endotel hücreleri gibi halkalarından oluşumu değerlendirilmesi ve kıkırdak halkalar trakeal yerine potansiyel uygulamalar için farklı boyutlarda eritme. Tamamen hücre kaynaklı yapıları ek olarak, biz de yüzük dahil çapraz bağlı jelatin mikroküreler13,22ile imal etmek bu sistemi kullandık. Mikroküreler sırasında doku halkalar içinde kendinden montajlı ek mekanik güç sağlamak için eklenebilir veya teslim büyüme faktörleri13,22için yerelleştirilmiş.
Doku yüzük imalatı, cep numarası duruma getirilmesi farklı hücre türleri için gerekli olabilir. En düşük hücre sayıları farklı olabilir boyutu ve türü hücre dayalı. Örneğin, iPSCs türetilmiş hSMCs 600.000 hücreler/yüzük11, tohumlari, hMSCs ve birincil hSMCs 400.000 hücre/yüzük13,22ve aortik SMCs 500.000 hücreler/yüzük18, seribaşı sıçan tohumlari. Yalak boyutları da halka oluşumu ve hücre halka oluşumu24için gerekli en az sayıda etkileyebilir. İnsan hücreleri ve 3D baskı kalıpları ile çalışmaları için 2 mm yalak genişliğini kullanıldı. Özgün polikarbonat kalıpları 3.75 mm, 2 mm hücre yüzük18oluşturmak üzere 750.000 hSMCs gereken bir çukur genişliği vardı. Azaltılmış yalak genişliği ile 46 artışla, halka25başına 400.000 hücre hücreleri halka oluşumu için gerekli azaltmak başardık. Yüzük seribaşı hücre miktarları Tablo 1' de özetlenmiştir.
Bir 3D basılı malzeme seçerken, birçok faktör dikkate alınması gerekir. Çünkü PDMS genellikle 60 ° C'de tedavi, 3D basılı malzeme yeterince yüksek olması gerekir sıcaklık PDMS kür sırasında zarar görmemesi için erime. Bu çalışmada kullanılan malzeme erime sıcaklığı (özel bir malzeme Malzemeleri tablogörmek) mevcut değildir. Ancak, 1 h için 60 ° C'de pişmiş zaman biz malzeme bir koku üretmeye başladı görülmektedir. Böylece, Kavurma sıcaklığı 50 ° c daha düşük ve 3D basılı malzeme zarar vermeden PDMS fırında için kür süresini artırmak karar verdi. Zaman kür olarak ayarlamalar kalıpları formu daha büyük PDMS negatifler için değiştirdiyseniz gerekli olabilir. 3D baskı kalıpları PDMS kaldırılması sonra 60 ° C'de ek bir kuruma süresi son PDMS negatif 3D baskılı kalıp maruz sıcaklık sınırlama yapışkan, kalan üzerinden engeller. Bazı malzemeler PDMS kür inhibe Not, bu yüzden seçilen malzeme PDMS ile uyumlu olduğundan emin olun. Son olarak, kalıp malzeme toksisite de dikkate alınmalıdır. 3D baskılı kalıp hücreleri ile doğrudan temas olmayacak olsa da, bazı kalıntı kalıp üzerinden PDMS kavurma işlemi sırasında negatif transfer mümkündür. Çok ayrıntılı yıkama deterjan ile herhangi bir kalıntı PDMS negatif kaldırmak için yeterli olduğunu ortaya koymuştur. Ancak, biz daha önce yetersiz yıkama birkaç negatif PDMS kullanımları liderliğindeki zavallı halka oluşumu için ilk özel Wells için görülmektedir. Diğer 3D basılı malzemelerden PDMS dökme kullanımı deterjan kalıp artıkları, herhangi bir potansiyel leachates de dahil olmak üzere kaldırmak için yeterli olduğunu doğrulamak için ek bir araştırma gerektirir. Periyodik test de mümkün geçer (hatta 50 ° C) Isıtma zaman içinde kalıp zarar ve artar kalıntı tekrarlanan kullanımdan sonra neden tekrar olarak gerekli olabilir. Bugüne kadar biz tek bir 3D baskılı kalıp başarıyla doku halkaları oluşturmak için kullanılan 30'dan fazla PDMS negatifleri üretmek için kullandık.
Genel olarak, 3D yazdırma polikarbonat işleme daha daha fazla çok yönlülük özel Kalıpları imalatı için sağlar. Takım ile mümkün olduğundan daha yüksek bir çözünürlük sağlar ve kalıp tasarımı araçları kullanılabilir boyutları ile sınırlı değildir. Bu daha fazla özelleştirme için sağlar ve bu sivrilen gibi özellikleri ek işleme ile mümkün olmayabilir. Bu sistem diğer şekilleri de, kendi kendine monte dokularda Yüzükler6,17ek olarak imalatı için uygulanabilir. Yüzük imalat yöntemi kullanarak, hücre tipleri ve boyutları trakeal doku Mühendisliği13, mühendislik kan damarlarının7ve modelleme vasküler hastalıklar11potansiyel uygulamalar için çeşitli doku halkalarından geliştirdik.

Hücresel kendinden montajlı mühendislik doku kan damarları imalatı için yaklaşımlar bir iskele tabanlı yaklaşımlara alternatiftir. Kendi kendine montajı, iskele ücretsiz doku daha fazla hücre yoğunluğu, Gelişmiş matris ifade ve güç ve İskele tabanlı dokular1,2,3' e,4 karşılaştırıldığında geliştirilmiş biyolojik fonksiyonu olabilir . Ancak, belirli boyut ve şekillerde eksojen iskele desteğiyle kullanmanıza gerek kalmadan 3D doku oluşturan bir meydan kalır. Bu işlem zaman alıcı ve emek yoğun5olmasına rağmen bazı yöntemler birlikte kalın yapıları oluşturmak için hücre yaprak katmanları sigorta. Alternatif olarak, hücre yapışkan olmayan kalıplara seribaşı olabilir ve izin pulcuklarının, yüzük ve diğer doku şekiller6,7,8içine toplamak için.
Kendi kendine monte doku yüzük gerektiren daha az sayıda hücre ve kısa kültür süreleri ve daha büyük daha az reaktifler borulu dokular, mühendislik ama hala mekanik test, histolojik olarak incelenmesi veya contractility ve diğer fonksiyonel test7 için kullanılan , 9 , 10 , 11. fabrikasyon hızla ve kolayca test çünkü doku yüzük kültür parametreleri çok sayıda eleme için idealdir ve potansiyel hastalık modelleri11 olarak kullanmak için veya uyuşturucu12eleme için araçlar. Ayrıca, kan damarları veya Trakea7,13gibi daha karmaşık doku yapılarına yüzük erimiş ve yüzük pulcuklarının14,15gibi diğer şekiller daha tamamen sigorta.
Özel yaygın Biyouyumluluk, geçirgenliği ve hücre içi yapışkanlı özellikleri kendi kendine monte doku imalatı için bir kalıp malzemesi olarak kullanılır. Örneğin, Norotte ve ark. özel kalıp kalıp şekli ve gerekli özel ekipman15üzerinde sınırlı denetim etkin extruded çubuklar gelen fabrikasyon. Tan ve ark. aljinat damlacıkları birimleri çeşitli şekiller (Piramit, Meydanı)16özel hidrojel kalıpları imal bina olarak yatırılır. Ancak, aljinat pulcuklarının (300 µm) geniş çaplı özellikleri düşük çözünürlük ile sonuçlandı. Düşük çözünürlüklü hücre toplama tutarlılık olumsuz etkileyebilir düzensiz kalıp yüzeyler neden olabilir. Alternatif olarak, özel polimer negatifleri pürüzsüz özellikleri ve belirli boyutlara6,7,17ile yapışkan olmayan kalıpları oluşturmak için içine çevirebilirsiniz.
Biz daha önce özel Anüler özel hücre tohum kuyulardan çentikli polikarbonat kalıp7,18PDMS negatif rol imalatı için bir sistem bildirdi. Özel PDMS negatif içine dökülür ve7,18ayarlamak için izin. Hücreleri sonra iskele ücretsiz doku yüzük 24 h7,18az nerede onlar kendi kendine monte forma toplanan, özel kuyu seribaşı. PDMS negatif autoclavable vardır, birçok kez yeniden kullanılabilir ve yumuşak ve esnek, katılaşmış özel wells kaldırmak kolaylaştırır. Ne zaman bu sistem başlangıçta Gwyther vd. rapor edildi 7, PDMS negatifleri üzerinden döküm edildi öğütülmüş polikarbonat kalıpları (şekil 1A). Özel döküm sonra hücre tohumlama wells tek tek kesip ve bir 12-şey plaka7,18kuyu yerleştirilir. Öyle ki bir tek özel kalıp 5 yüzük üretir ve bireysel wells kesmek için ihtiyacını ortadan kaldırarak ve PDMS ve özel her halka (şekil 1B) üretmek için gereken miktarını azaltarak 6-şey plaka, kuyuda uygun tasarımı daha yakın zamanda güncellenmiştir. Çukur genişliği tohum küçük bir hücre numaralı seribaşı hücreleri halka oluşumu ulaşmak için gereken sayısını azaltmak için kullanıldı. Bu değişikliklere rağmen çözünürlük ve özelleştirme kalıp kullanılabilir standart frezeler boyutları için sınırlı ve micromilling çok pahalı olabilir. Ayrıca, sayısal kontrol (CNC) bilgisayar işleme zaman alıcı olabilir ve zaman ayırmak için ihtiyaç nedeniyle hantal ağır özel donanımları, bilgisayar destekli tasarım (dönüştürmek için ek bilgisayar destekli üretim (CAM) yazılım kullanılan CAD) dosyasına bir programlanabilir araç yolu ve işleme sırasında polikarbonat bölümünün güvenilir fikstür.
Bu da çalışmanın, 3D baskı CNC İşleme alternatif olarak kullanımı inceledi. 3D baskı için iskele malzemeleri imalatı mühendislik özel implantlar ve hücre ve doku pulcuklarının15,19,20doğrudan baskı için yaygın olarak kullanılır. Bir yüksek çözünürlüklü 3D printerlere harcama maddeler kullandık ve özel 3D ile pürüzsüz bir katı bir kalıp yazdırmak için bize etkin malzeme baskı, parlak yüzey kalitesi ( Tablo malzemelerigörmek). Bizim teknik PDMS negatifleri ve özel wells döküm için kullanılan son derece özelleştirilebilir, yüksek çözünürlüklü plastik kalıp imalatı için izin verir. Tasarım yineleme şekil 1' de özetlenmiştir. Kalıp tasarımı daha fazla 3D baskı kalıpları üzerinden her iki PDMS negatifleri ve PDMS negatifleri özel kuyulardan kaldırılmasını kolaylaştırmak için konik Dış duvarları ve merkezi delik kapsayacak şekilde kalıp 3D yazdırılan sürümünde değişiklik yapıldı. Bu konik özellikler işlemleri işleme standardı ile elde edilemez. Kalıp alt kuyu dibinden Uzaklik kalın özel mesaj özel iyi kaldırma sırasında kırılma riskini azaltmak için belgili tanımlık posta aşağıda temel sonuçlanan bu yinelemedeki yükseltilmiştir. Kalıp ve halka üretim yordamı şematik Şekil 2' de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td><td>Provided by T. Wight [ref 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Mühendislik doku klinik olarak doku onarım ve yedek için kullanılmakta olan ve uyuşturucu taraması ve insan hastalık modelleme araçları olarak geliştirilmektedir. Kendi kendine monte doku iskele tabanlı doku Mühendisliği, Gelişmiş matris ifade, güç ve işlevi gibi avantajlar sunuyor. Ancak, 3D doku hücreleri veya destekleyici bir iskele içinde tohum olmadan imalatı için kullanılabilir birkaç yöntem vardır. Daha önce yapışkan olmayan özel kuyu hücreleri tohum tarafından kendi kendine monte doku yüzük imalatı için bir sistem geliştirdi. Bir polydimethylsiloxane (PDMS) negatif önce işlenmiş polikarbonat kalıp içinde atama, ve sonra özel wells tohum halka şeklinde hücre oluşturmak için PDMS içinde negatif genellikle. Ancak, bu yaklaşım çok yönlülük araçları polikarbonat kalıp işleme için kullanılabilir çözünürlük sınırlı. Burada, 3D baskılı plastik işlenmiş polikarbonat alternatif olarak PDMS negatifleri imalatı için kullanılabileceğini göstermektedir. 3D baskılı kalıp ve gözden geçirilmiş kalıp tasarım kullanmak basit, ucuz üretmek ve önemli ölçüde daha az özel ve PDMS de tohum hücre başına gerektirir. Elde edilen özel wells özelleştirilmiş çapı farklı hücre tipleri çeşitli kendi kendine monte doku halkaları oluşturmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Yüzük daha sonra mekanik, işlevsel ve histolojik analizler için veya daha büyük ve karmaşık borulu doku imalatı için kullanılabilir.

Bu sistem için basit, hücrenin hücre kendinden montajlı halka şeklinde 3D sağlayan wells tohum özel özelleştirilmiş imalat doku Mühendisliği sağlar. 3D baskı nerede boyutları kullanılabilir aracı boyutları tarafından kısıtlı olan polikarbonat, işleme daha kalıp tasarım daha iyi çözünürlük ve daha fazla esneklik sağlar. 3D yüksek çözünürlüklü bir yazıcıda, duvarları 0.254 mm ince yazdırılabilir ve yalak boyutları yazıcı (15,2 µm çözünürlük bu çalışmalar için) çözünürlüğün sadece sınırlıdır. Bu tekneler daha küçük genişliklerde oluşturmak mümkün değil genellikle, CNC endmills daha az 0,3 mm ticari olarak mevcut değildir. Mikro-freze daha küçük özellikler üretebilir, ekipman gerekli, ancak prohibitively pahalı veya erişilemeyen birçok Biyomedikal Araştırma Laboratuvarları için olabilir. Ayrıca yalak boyutları ve eğrilik frezeler ucu şekli ile sınırlıdır. Ayrıca, özellikleri gibi açılı veya konik duvarlar mümkün olmayan ve küçük özellikler işleme işlemi sırasında bozabilir.
CAD çizimleri, 3D baskı kalıpları ve özelleştirilebilir boyutları PDMS negatif üretmek için kolayca değiştirilebilir. Şekil 3 önceki tasarım yinelemelere göre bizim geçerli 2 mm yazı 3D baskı kalıpları, boyutları açıklar. Ucuz bir işlemdir; 2 mm, 5-ring 3D baskılı kalıp maliyeti 3D yazıcı 44.67 USD ve her bölümü birden fazla PDMS negatif oluşturmak için kullanılabilir. Bugüne kadar biz tek bir 3D baskılı kalıp 30'dan fazla PDMS negatifleri oluşturduk. Her olumsuz PDMS 0,11 USD 25 g g (PDMS negatif 2,75 YTL) ücret gerektirir. Her PDMS negatif deterjan ile autoclaved, temizlenmesi ve kullanım sıklığını bağlı olarak birkaç yıl kadar yeniden kullanılır. İçin özgün tasarım18karşılaştırıldığında, kompakt 3D baskılı kalıp önemli ölçüde daha az PDMS ve özel başına 2 mm doku halka (şekil 1E) kullanır.
Hücreleri numaralı seribaşı dengelenmiş özel Wells toplama formu doku halkalara az 24 h yüzük boyutları özel wells boyutları üzerinde bağlıdır. Burada, kendi kendine monte sıçan düz kas hücre yüzük Wells ile 2, 4 veya 12 mm çap Mesaj (şekil 4) sahte olduğu gösterilmiştir. Yüzük bu çalışmada sadece 3 gün boyunca kültürlü, daha önce hSMC yüzük ilâ 2 hafta22kültürlü ve 3 hafta13için hMSC-kıkırdak halkalar. 3D vitro modelleri doku kantitatif değerlendirmesi için insan dokuların11 ve mekanik mukavemeti13,22işlev ve ayrıca modüler yapı birimleri olarak hizmet olabilir daha önce bildirildiği gibi yüzük işlev görebilir tüp şeklindeki doku yapıları7,13oluşturmak. Tohumlama koşulları hücre ve doku halkalar bu hücre tipleri tasarlanmış işlevsel özniteliklerini Tablo 1' de özetlenmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Şekil 1: polikarbonat kalıp tasarımları. Başlangıçta, 15-şey kalıpları polikarbonat(a)işlenmiş. Sonraki sürümleri daha kompakt tasarım (B), bir tek polikarbonat kalıp ve 6-şey plaka bir kuyu içinde uyacak şekilde tasarlanmış 5 kuyu ile özel. Burada, 3D baskılı plastik işlenmiş Polikarbonat (C) daha fazla özelleştirilebilir alternatif olarak kullanmak için bu tasarımı değiştirildi. (D) ilk fabrikasyon özel wells (solda)18 mevcut kompakt tasarım için (sağda), karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az özel gerektirir ve does değil istemek Wells manuel ayırma tasarım gösterilmiştir. Miktarda PDMS ve her tasarım yineleme için gerekli özel (E) gösterilir. 2 mm çapında Merkezi mesajlar vardır. Kalıp(a)6 cm x 12 cm, (B) 5 cm çapında ve (C) 6 cm çapında olduğunu. Ölçek çubuğu (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Şekil 2: kendi kendine monte doku yüzük imalatı. Bir 3D baskılı kalıp sonra özel wells(a)döküm için kullanılan negatif bir PDMS döküm için kullanılır. Hücreleri sonra nerede daha az 24 h formu doku halkalara (B) toplamak, doğrudan özel kuyu içine numaralı seribaşı. (B) kesik çizgiler iyi anahat göster. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Şekil 3: kesit görünümü 3D baskılı kalıp CAD çizim. Çukur genişliği(a), yalak yüksekliği (B), Merkezi delik (C), toplam çapı (D), dış dudak (E) ve dış duvar yüksekliği (F) için boyutları gösterilir. Dış duvarlar (1), wells (2) ve merkezi delik (3) üst bölümü (1 ve 3, 45 ° 2 için 5 ° açıyla) PDMS negatif kaldırma kolaylığı geliştirmek için konik. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Şekil 4: CAD çizimleri ile ilgili PDMS negatifleri ve kendi kendine monte SMC halkalar ve 2 (A), 4 (B) ile 12 (C) mm çapları sonrası. (A)(1) gösterir yönlendirmesini sağlamak için bir çentik, perfüzyon artırmak için merkezi bir delik gösterir (2), (3) doğrudan PDMS negatifleri izlerini, bir dosya numarası ve (4) gösterir dış duvar, hangi PDMS negatif kaldırma kolaylığı için konik. Ölçek çubukları özel Wells 1 cm. = <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre tipi</td>
			<td>Yüzük seribaşı hücreleri</td>
			<td>Halka Çapı</td>
			<td>Kültür süresi</td>
			<td>Fonksiyonel analiz gerçekleştirilen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıçan SMC</td>
			<td>0.5, 1 veya 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 veya 12 mm</td>
			<td>3 gün</td>
			<td>Geçerli çalışma; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
SMC IPSC türetilmiş 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 gün</td>
			<td>Contractility test, uniaxial çekme testi, histolojik analizi</td>
		</tr>
<tr>
<td>
İnsan SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 veya 14 gün</td>
			<td>Uniaxial çekme testi, histolojik analizi</td>
		</tr>
<tr>
<td>
İnsan MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 gün</td>
			<td>Uniaxial çekme testi, histolojik analizi, yüzük füzyon ve test, farklılaşma kıkırdak doku içine tüp sıkıştırma</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: hücre sayıları yüzük fabrikasyon farklı hücre türleri için gerekli.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Bu iletişim kuralı kendi kendine monte doku yüzük değişken boyutları kullanarak özelleştirilmiş bir 3D Baskılı Plastik kalıp imalatı için bir platform açıklar. PDMS negatifleri 3D baskılı kalıp içinde tedavi; o zaman özel içinde tedavi PDMS negatif atıldı. Hücreleri nerede doku yüzük içine toplamak elde edilen özel kuyu içine numaralı seribaşı.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

fabrication-custom-agarose-wells-for-cell-seeding-tissue-ring-self

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. Bu iletişim kuralı kendi kendine monte doku yüzük değişken boyutları kullanarak özelleştirilmiş bir 3D Baskılı Plastik kalıp imalatı için bir platform açıklar. PDMS negatifleri 3D baskılı kalıp içinde tedavi; o zaman özel içinde tedavi PDMS negatif atıldı. Hücreleri nerede doku yüzük içine toplamak elde edilen özel kuyu içine numaralı seribaşı.

Video: Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Biyomühendislik

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Biyokimya

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

Özel doku kültürü kalıpları lazer kazınmış ustalardan mühendislik

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

FLIM Tabanlı Metabolik ve Hipoksi Analizi için Çok Hücreli Spheroid Oluşumu

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Yazar Spotlight: Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Metabolik ve Oksijenasyon Analizi için Küresel Oluşum Yöntemlerinin Standardizasyonu

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Özel doku kültürü kalıpları lazer kazınmış ustalardan mühendislik

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)