Ce protocole peut être utilisé pour étudier de nombreuses études de culture et fournir un nouvel outil pour étudier la communication cellulaire directe. Ce nouveau dispositif permet de gagner un temps considérable dans l’établissement d’un modèle de culture et est applicable à différents types de cellules nécessitant ou non un enrobage spécifique. En effet, les quatre compartiments des inserts imprimés en 3D, permettent de cultiver différents types de cellules en monocouche, ou en 3D de la même manière avec différentes combinaisons.
Les inserts imprimés en 3D sont plus durables, flexibles, évolutifs et peuvent être utilisés pour concevoir des modèles expérimentaux pour l’étude des physiopathologies, telles que l’immunologie ou l’androgenèse. Pour commencer, mélangez les deux composants, le silicium alimentaire et le catalyseur fournis dans le kit dans un rapport de 10 :1, à l’aide d’une spatule stérilisée à l’éthanol à 70% selon les instructions du fabricant. Appliquez les inserts sur le mélange de silicone à l’aide d’une pince à épiler afin que le mélange soit réparti de manière homogène sur le bord inférieur de l’insert.
Placez les inserts dans les puits d’une plaque à six puits et appliquez une légère pression pour vous assurer que les inserts sont en contact étroit avec la plaque afin d’éviter toute fuite du milieu de culture cellulaire. Placez la plaque à 37 degrés Celsius pour soutenir le processus de solidification du silicium pendant une heure. Après solidification, stérilisez les plaques avec les inserts en les immergeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 30 minutes à une heure.
Ensuite, jetez l’alcool par pipetage et laissez sécher la plaque pendant la nuit dans une hotte de culture cellulaire. Pour cultiver les kératinocytes de la gaine radiculaire externe et des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines, jetez le milieu des flacons et ajoutez cinq millilitres de trypsine pour détacher les cellules. Placez le flacon contenant les kératinocytes de la gaine racinaire externe à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes, et incubez le flacon contenant les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines pendant cinq minutes à température ambiante.
Dans un tube conique stérile de 15 millilitres, mélanger la solution de trypsine contenant les kératinocytes de la gaine radiculaire externe avec cinq millilitres de milieu de cellules souches mésenchymateuses supplémentées en 5 % de FBS et de facteurs de croissance et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines avec cinq millilitres de milieu de cellules endothéliales supplémentées en 5 % de FBS et de facteurs de croissance. Centrifuger les kératinocytes de la gaine racinaire externe et les suspensions de cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de leurs milieux respectifs.
Mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de colorant bleu trypan et ajoutez 10 microlitres du mélange dans la chambre de la lame de comptage. Insérez la lame de comptage dans le système de comptage de cellules et détectez le nombre et la viabilité des cellules. Après avoir préparé la suspension cellulaire à une concentration de 50 000 cellules par millilitre dans le milieu respectif, répartissez 800 microlitres à un millilitre de suspension cellulaire dans les grands compartiments individuels et 100 à 150 microlitres dans les petits compartiments individuels avec une pipette.
Voir les kératinocytes dans le milieu des cellules souches mésenchymateuses supplémentées en 5% FBS et facteurs de croissance et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines dans le milieu des cellules endothéliales, complétées avec 5% FBS et les facteurs de croissance dans les petits et autres grands compartiments. Placez la plaque de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, ou dans les conditions habituelles, pour permettre l’adhésion et/ou la maturation des cellules. Videz les milieux de culture des différents compartiments des inserts à l’aide d’une pipette.
Rincez ensuite les cellules avec un millilitre de PBS chaud à 37 degrés Celsius dans les grands compartiments et 200 microlitres dans les petits compartiments. Ajoutez trois millilitres d’un milieu commun sélectionné pour être compatible avec tous les types de cellules. Placez la plaque contenant les co-cultures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures.
Détachez les cellules à l’aide de trypsine pour le comptage des suspensions cellulaires et vérifiez la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu de trypan. Après avoir observé la morphologie, comptez le nombre de cellules des différents compartiments pendant l’expérience au microscope optique après 24 à 48 heures d’incubation. Tout d’abord, retirez les inserts de la plaque à six puits à la fin de l’expérience en les tournant légèrement, puis retirez le silicium des inserts en le retirant.
Lavez les inserts avec des détergents et des produits de nettoyage conventionnels pour cultures cellulaires. Stérilisez ensuite les inserts pour une utilisation ultérieure dans un autoclave, ou en les immergeant dans un bain à 70% d’éthanol pendant une heure. Le phénotype et la viabilité cellulaire ont été comparés, où une viabilité de 90 % a été observée dans les puits des plaques à six puits, et de 91 % dans les inserts imprimés en 3D pour les kératinocytes de la gaine racinaire externe.
La viabilité des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines était de 85 % dans les puits de la plaque à six puits, tandis que de 86 % dans les inserts imprimés en 3D. Les communications cellulaires indirectes entre les kératinocytes et les cellules endothéliales dans les inserts imprimés en 3D ont démontré qu’en présence de kératinocytes dans les inserts, la prolifération des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines augmentait significativement de 1,5 fois après 24 heures, et de 3,1 fois après 48 heures par rapport au témoin. Cependant, il a été démontré que les kératinocytes du milieu de la gaine radiculaire externe augmentaient significativement la prolifération des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines de 1,5 fois après 24 heures et de 2,1 fois après 48 heures.
Le modèle de co-culture d’inserts imprimé en 3D a été testé pour déterminer l’effet des kératinocytes sur la migration des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines. Dans la condition témoin, les cellules endothéliales ont migré et ont recouvert environ 44 % de la surface de la plaie après 24 heures. En présence de kératinocytes, une augmentation significative de la migration des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines a été observée, ce qui montre que 43 %, 67 % et 99 % de la surface de la plaie étaient couverts après trois, 12 et 24 heures respectivement.
De même, la migration des HDMECs augmente en présence de kératinocytes du milieu d’état de la gaine racinaire externe. Il est crucial d’assurer l’étanchéité de l’insert à la plaque, afin d’éviter la fuite du milieu des cellules d’un compartiment à l’autre. Plusieurs applications pourraient être faites, telles que la prolifération, la migration, les tests de formation sédative de l’ADN, de l’ARN, des protéines et d’autres analyses.
