現在の繊毛分析法は労働集約的で、誤りや偏りが生じやすい。当社のアプローチは、潜在的なエラーを軽減しながら、時間と労力を合理化することを目指しています。この技術が提供する主な利点は、厳格さと再現性と定量画像分析の増加です。
この種のアプローチは、繊毛分析に関連するだけでなく、他のオルガネラや細胞骨格タンパク質を扱う細胞生物学的な質問を含む多くの細胞生物学的質問に広く適用することができます。開始するには、トレーニング データセットを開き、メニューからファイルを選択し、[インポート エクスポート] をクリックして、[ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。トレーニング データセットを含むフォルダを選択すると、ダイアログ ウィンドウの中央にファイルのリストが表示されます。
ドロップダウンメニューの少なくとも1つのオプションを使用して、ファイルの編成を手動で定義します。選択した各オプションの下に対応する数値を入力し、オプションが選択されていない場合は選択しません。[変換] をクリックして ND ドキュメントを開きます。
画像を調整するには、イメージの左下隅にあるキャリブレーションされていないオプションを右クリックします。[ドキュメントの調整] をクリックし、[ピクセル サイズ] をクリックして値を入力し、[大丈夫] をクリックします。ビュー解析コントロールを選択し、バイナリツールバーを開き、開いているすべてのフレーム上の個々の毛様構造を正確にトレースすることで、自動検出またはオブジェクトを描画して、識別する繊毛を手で描きます。
AI のトレーニングには、nis を選択します。ai、 列車セグメントをクリックします。aiは列車セグメントを開きます。
ai ボックスをクリックし、トレーニングに使用するソース チャネルを選択します。AI をトレーニングするための適切な GroundTruth バイナリを選択します。バイナリのサイズと分布に応じて AI をトレーニングするために必要な反復回数を選択し、トレーニング済みの AI ファイルを保存する対象フォルダを選択し、[トレーニング] をクリックしてソフトウェアをトレーニングします。このプロセスには数時間かかります。
サンプルを変換して、前に説明したように繊毛の実験共焦点画像を開きます。TIF ファイルを ND2 ファイルにします。ポップアップメニューで、最初のドロップダウンメニューからマルチポイントを選択し、画像の総数に対応する値を入力します。
2 番目のドロップダウン ボックスで、波長を選択し、値をフォルダー内のチャネルの合計数に変更します。ソフトウェアは自動的にポップアップウィンドウの下、右端に位置する波長選択ウィンドウのロックを解除します。波長選択ウィンドウで、色ドロップダウンメニューを使用して各チャンネルの色を選択します。
各チャネルに名前列の下に別の名前を指定します。すべての情報が更新されたら、[変換] をクリックします。前に説明したように画像を調整します。
実験データセットのピクセル サイズがトレーニング データセットのピクセル サイズと一致していることを確認します。前の手順でトレーニングされた AI を使用して、最初のチャネルで CILIA を識別します。nis を開きます。
メニューから、セグメントを選択します。ai を選択し、ソースチャンネルで AC3 を選択します。次に、ソースチャンネルでMCHR1を選択して、2番目のチャンネルで繊毛を識別します。
ソフトウェアは、ラベル付きの繊毛にバイナリを描画します。次に、誤って識別されたバイナリがないか画像を確認します。誤認されたバイナリを手動で削除するには、バイナリツールバーでオブジェクトの削除を選択します。
繊毛が特定され、セグメント化されたら、一般的な解析 3 つのツールを使用して、長さや強度などの異なる繊毛パラメータを分析します。メニューから画像を選択し、新しいGA3レシピをクリックします。中央に空白が入った新しいウィンドウが開きます。
GA3 は、AI に従って適切にラベル付けされたバイナリを自動的に検出し、対応するノードを含めます。GA3は画像内のチャンネルを自動的に検出し、チャンネルの下にタブを表示します。AI は、フレーム内のすべての繊毛をオブジェクトのようにセグメント化し、フレームのエッジに沿って不完全な繊毛を検出します。
これらを削除するには、バイナリ処理を選択し、オブジェクトを削除し、接触する境界線ノードを空白領域にドラッグして、ノードを適切なバイナリに接続します。繊毛の長さを測定するには、計測オブジェクトのサイズを選択してから、長さを選択します。パラメータを中央にドラッグアンドドロップし、適切なバイナリノードに接続します。
マンダーの係数ノードを空白スペースにドラッグアンドドロップし、適切なバイナリとチャンネルに接続します。データ管理メニューを開いて、測定値と単一テーブルを取得します。基本カテゴリで[ApEn]列を選択し、[今すぐ実行]をクリックして繊毛を測定します。
すべての測定値は、単一の出力テーブルに表示されます。代表的な画像は、訓練を受けたAIがIMCD細胞、一次視床下部培養および海馬培養物の画像において繊毛in vitroを適切に同定したが、サイトキネティック橋のような他の非毛様体構造がないことを示している。繊毛の長さは、IMCD細胞では0.5〜4.5マイクロメートル、視床下部および海馬培養では2〜12マイクロメートルの範囲である。
AIは、私たちのアークアテ核、傍室核およびコルヌアンモニス1つの領域の画像で生体内で標識された繊毛の長さを測定しました。分析によると、インビボの視床下部繊毛は、白と茶色のバーに見られるように、1〜15マイクロメートルの範囲でした。繊毛とコルヌアンモニス領域は、灰色のバーに見られるように、1〜10マイクロメートルの範囲でした。
興味深いことに、毛様体MCHR1の強度は、円弧核のそれよりもパラベンタリ核においてより強かった。AC3に対するMCHR1の強度をプロットし、それらの重なりを測定した。繊毛の大部分は両方のマーカーに陽性であったが、一部の繊毛はAC3またはMCHR1のいずれにも陽性であった。
AC3内のMTHR1の共局在化を定量化するために、マンダーの重なり係数を測定し、アークアテ核よりもパラベンタキュラー核の重なりが有意に増加した。繊毛の長さに沿った強度を測定するために、繊毛極性を基底体マーカーとしてCentrin2-GFPを用いて定義した。これにより、繊毛の基部とARL13B-Mチェリー陽性繊毛の先端を区別することができた。
繊毛の長さに沿ったARL13B強度の変化は、右に見られるように、左に見られる円弧核のシリウムの先端よりもベースでARL13B強度が高かった場所で観察された。この方法でデータを分析する場合、実験データセットの品質と解像度が AI のトレーニングに使用されるデータと一致していることを確認することが重要です。このアプローチの主な有用性は、AIによって繊毛を検出した後、ユーザーは、ソフトウェア内に統合された分析ワークフローをカスタマイズすることによって、どのプロパティが分析されるかについて創造的であることができます。
