Name: differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma NIH'den (1R35GM133496-01) Z. Gao'ya verilen bir hibe ile desteklendi. Bölümlemedeki yardımları için Dr. Ryan Hobbs'a teşekkür ederiz. Penn State College of Medicine'ın Genom Bilimleri ve Biyoinformatik, İleri Işık MikroskopiSi Görüntüleme ve Akış Sitometrisi gibi temel tesislerine teşekkür ediyoruz. Ayrıca RNA-seq analizindeki yardımları için Dr. Yuka Imamura'ya teşekkür ederiz.

1. mESC kültürü
<ol><li>10 cm doku kültürü ile işlenmiş bir plakayı% 0.1 jelatin ile kaplayın ve jelatin aspire etmeden önce en az 15-30 dakika ayarlanın.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış mESC ortamında (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) %15 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler ile mESC'leri kültlemeden bir gün önce tohum γ ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin, sodyum piruvat, LIF, PD0325901 (PD) ve Chir99021 (CH)).</li>
	<li>E14 hücrelerini kültlemeden önce γ ışınlanmış MEF'lerin yerleşmesine ve plaka yüzeyine bağlanmasına izin verin.</li>
	<li>E14 ESC'leri 37 °C su banyosunda çözün ve hücreleri ılık mESC ortamına sahip 15 cm konik bir tüpte hızla aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g'da peletin ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL mL mESC ortamda yeniden depola ve hücreleri daha önce tohumlanmış γ ışınlanmış MEF'leri içeren kültür plakasına plakala. Hücre kültürünü% 5 CO2altında 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kültür geçişi için, ortamı epire edin ve plakayı steril 1x PBS ile yıkayın. Plaka yüzeyini kaplayacak ve 37 °C'de 3 dakika kuluçkaya yatıracak kadar % 0,05 trypsin ekleyin.</li>
	<li>Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için trypsin'i mESC orta ve pipetle nötralize edin. Hücreleri 200 x g'da 3 dakika santrifüj edin ve üst yapıyı çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri bir hemositometre veya hücre sayacı ile sayın ve 10 cm'lik bir kültür plakasında yaklaşık5.0 x 10 5 hücre tohum.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL mL mESC ortamında yeniden biriktirin, jelatin kaplı doku kültürü plakasındaki hücreleri plaka edin ve daha önce açıklandığı gibi kültürleri kuluçkaya yatırın. NOT: Hücrelerin kolonilerinde farklılaşmalarını önlemek için her 2 günde bir MESC'lerin geçirilmesi önerilir. Ortadaki fenol kırmızısı sadece bir pH göstergesi olarak işlev görüyor ve hücresel yoğunluğa bağlı olarak, 2 günden daha kısa bir sürede sarımsı (daha asidik) hale gelebilir. Bu nedenle, ortamı her gün değiştirmek gerekebilir. γ ışınlanmış MEF'ler birkaç pasajdan sonra sonunda ölecekler.</li>
</ol>2. EB, NPC ve nöron farklılaşması
<ol><li>Daha önce bahsedilen kültür geçirme protokolünü gerçekleştirin ve hücreleri sayın (adım 1.7–1.10).</li>
	<li>Asılı bırakma yöntemi (gün 0)<ol>
<li>10 cm hücre kültürü plakası için, 20 μL farklılaşma ortamında 5.0 x 102 hücrenin askıyaılacağı kabaca 2.5 x 104 hücre (%15 FBS'li DMEM, esansiyel olmayan amino asitler, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin ve sodyum pirruvat) sayar. Hücreleri içeren kabaca elli 20 μL damlacık, 10 cm'lik bir plaka üzerine kaplanabilir.</li>
		<li>Uygun sayıda hücreyi aliquot ve daha sonra 3 dakika boyunca 200 x g'da hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.</li>
		<li>Hücreleri,20 μL başına 5,0 x 10 2 hücrelik bir hücre yoğunluğu için uygun farklılaşma ortamı hacminde yeniden biriktirin (örneğin, 1 mL farklılaşma ortamında2,5 x 10 4 hücre).</li>
		<li>Bir mikropipette veya tekrarlayıcı pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 20 μL damlacığı doku kültürü plakasının kapağına yerleştirin. Damlacıkların birleşmesini önlemek için birbirine çok yakın olmadığından emin olun. NOT: Damlacıklar, plakanın kendisine değil, kapağın üzerine yerleştirileceği için doku kültürüyle işlenmiş bir bağlantı plakasına veya süspansiyon plakasına kaplanabilir. Daha uygulanabilir ve steril bir yaklaşım için, damlacıkları bir bağlantı doku kültürü plakasına plakalayın ve aşağıda açıklandığı gibi bir süspansiyon plakasına aktarın.</li>
		<li>Plakayı 5-10 mL 1x PBS ile doldurun ve kapağı dikkatlice tabağa geri koyun. Kültürü 37 °C inkübatörde kuluçkaya yatırın. NOT: Damlacıkların kurumasını önlemek için kültür plakasına PBS eklenir.</li>
	</ol></li>
	<li>2. günde,damlacıkları kapaktan toplamak ve 10 mL farklılaşma ortamı ile dolu 10 cm hücre kültürü süspansiyon plakasına yerleştirmek için bir mikropipette kullanın. Kuluçka makinesinde düşük hızda sallanan bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde kültürü kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4. günde, EB'leri toplamak için, hücreleri toplayın, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjün ve süpernatantı çıkarın. NOT: ED'ler, sonraki deneylerin gereksinimlerine göre 1x PBS ile de yıkanabilir.</li>
	<li>Prosedüre devam etmek ve EB farklılaşmasını nöral progenitör hücrelere (NPC' ler) teşvik etmek için, farklılaşma ortamını 5 μM retinoik asit (RA) ile hazırlayın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 100 x g'da 100 x g'da EB'leri peletleyarak eski ortamı çıkarın veya eski ortamı arzulamadan önce ED'lerin yerleşmesine izin verin. Kültür plakasına 5 μM RA içeren farklılaşma ortamının 10 mL'lik kısmını ekleyin.</li>
	<li>6. günde,plakayı eğerek ve yukarıda açıklandığı gibi ortamı pipetleyarak ortamın en az yarısını 5 μM RA içeren taze ortamla değiştirin. NOT: Ortamın en az yarısının 5 ve 7. günlerde taze RA içeren ortamla değiştirilmesi önerilir. Fenol kırmızı göstergesini not alın; sarımsı olursa, tüm ortamı değiştirmek en iyisidir.</li>
	<li>8. günde,hücreleri toplayarak, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj yaparak ve süpernatantı çıkararak NPC'leri hasat edin. NOT: NPC'ler, sonraki deneylerin ihtiyaçlarına göre 1x PBS ile de yıkanabilir. Gerekirse, NPC'ler daha sonraki kültür ve analizler için dondurulabilir ve tekrar çözülebilir. NPC'ler kültürlenecekse, trypsin'e alternatif olarak accutase de kullanılabilir.</li>
	<li>Prosedüre devam etmek ve NPC'leri nöronlara ayırt etmek için, NPC'leri santrifüjleme ile 15 mL konik bir tüpte toplayın, tripsinle ayırın ve 37 ° C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın. Tüm NPC agregalarının ayrışmasını sağlamak ve trypsin'i ortamla nötralize etmek için NPC'leri pipetle.</li>
	<li>Hücreleri 40 μm naylon hücre süzgeçli filtreleyin ve hücreleri N2 ortamında 1,5 x 105/cm2 yoğunluğa kaplamadan önce sayın (DMEM/F12 orta + 3 mg/mL glikoz + 3 mg/mL lipid bakımından zengin sığır sonraki PCR ve batı leke deneyleri için doku kültürüyle işlenmiş bir plaka üzerinde serum albümin (LBSA) + 1:100 N2 takviyesi + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL kalem/strep + 1 mM L-glutamin); veya immünofluoresans deneyleri için bir doku kültürü odasında.</li>
	<li>9. günde,eski ortamı taze bir N2 ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>10. günde,N2 ortamını N2/B27 ortamı (%50 DMEM/F12 ve %50 nöral bazal, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 takviyesi, 1:100 B27 takviyesi, 50 U/mL kalem/strep ve 1 mM L-glutamin) ile değiştirin.</li>
	<li>11-12 gün, nöronları aşağıdaki gibi hasat edin. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın, tripsin ekleyin ve tripini 3 dakika boyunca 200 x g'da orta ve santrifüj ile nötralize etmeden önce 37 °C inkübatördeki kültürü 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>3. MESC'lerin ve farklılaştırılmış hücrelerin karakterizasyonu
<ol><li>Alkali fosfataz (AP) tahlili 
	<ol>
<li>Alkali fosfataz aktivitesini değerlendirmek için bir kit kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Ortamı kültür plakasından çıkarın ve ESC'leri 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Kit ile birlikte verilen sabit çözeltinin 1 mL'lik kısmını (formaldehit ve metanolden oluşur) tabağa ekleyin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Düzeltme çözümündeki aşırı inkübasyon AP etkinliğini tehlikeye atabilir.</li>
		<li>Düzeltme çözümünü çıkarın, ESC'leri 1x PBS ile yıkayın ve plakada bir miktar PBS bırakın. NOT: AP etkinliğini tehlikeye atmayacak şekilde ESC'leri PBS'de nemli tutun.</li>
		<li>A, B ve C substrat çözümlerini 1:1:1 oranında karıştırarak AP çözümünü hazırlayın. Önce A ve B çözeltilerini karıştırın ve C çözeltisini eklemeden önce karışımı oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>1x PBS'yi çıkarın ve daha önce hazırlanan AP çözümünü ekleyin.</li>
		<li>Kültür plakasını alüminyum folyo ile sararak veya karanlık bir odada 3.5 adımını gerçekleştirerek ESC'leri karanlıkta yaklaşık 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Reaksiyonun izlenmesi ve spesifik olmayan lekelerin önlenmesi için çözelti parlak olduğunda reaksiyon çözeltisini çıkarın.</li>
		<li>ESC'leri 1x PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>ESC'leri 1x PBS veya montaj ortamı ile kaplayarak numunenin kurumasını önleyin. NOT: AP ifadesi için kırmızı veya mor bir leke görünecektir. Plaka 4 °C buzdolabında saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>ESC'ler, ESB'ler ve NPC'ler için sırasıyla 1.6–1.7 ve 2.4 adımlarını izleyerek çeşitli aşamalarda hücreleri toplayın.</li>
		<li>RNA, DNA ve protein ekstraksiyon çözeltisi kullanarak RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Ters transkriptaz kiti ile cDNA oluşturun (Malzeme Tablosunabakın) ve üreticinin el kitabını izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sabitleme ve gömme 
	<ol>
<li>Yukarıda açıklandığı gibi EBs ve NPC'leri hasat edin (adım 2.6) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1x PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile sabitlayın.</li>
		<li>PFA'yı çıkarın ve numuneyi 1x PBS ile 5 dakika yıkayın.</li>
		<li>Numuneyi 25\u201228 °C'de 1x PBS, %10-, %20 ve %30 sakkaroz çözeltilerinin seri seyreltilmesine yerleştirin ve burada numune 30 dakikalık inkübasyondan sonra bir sonraki çözüme aktarılır. NOT: Numune, gömme adımına devam etmeden önce% 30 sakkaroz çözeltisinde 4 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Numuneyi (istiflemeden) kriyo-kalıbın ortasına yerleştirmeden önce pipet ucunu sakkaroz çözeltisi ile ıslatın ve fazla sıvıyı pipetlayın. NOT: Filtre kağıdı fazla çözeltiyi çıkarmak için de kullanılabilir. Pipet ucunu sakkaroz çözeltisi ile ıslatmak, EBs ve NPC'lerin ucun duvarlarına yapışmasını önlemek için önemlidir.</li>
		<li>Numuneleri yeniden canlandırmadan kalıba optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisi dikkatlice ekleyin ve fazla kabarcıkları pipetle çıkarın.</li>
		<li>Numuneyi 15 dakika hafifçe çalkalamak için numuneyi bir laboratuvar mikserine düşük hızda yerleştirin. Bu, EBS ve NPC'lerin OCT çözümünde yeniden nünmeleri durumunda en alta yerleşmesine yardımcı olur.</li>
		<li>Kalıbı sıvı nitrojene veya kuru buza yerleştirerek numuneyi hızla dondurun. NOT: Numuneler bir sonraki adıma geçmeden önce -70 °C dondurucuda saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kriyoseksiyon 
	<ol>
<li>Numuneyi cihaza aktarmadan önce kriyostatı -20 ila -18 °C'ye kadar soğumaya ayarlayın.</li>
		<li>Donmuş OCT bloğunu kalıptan ayırın ve tutucunun yüzeyine yerleştirilmiş küçük bir OCT çözeltisi ile tutucuya sabitleyin.</li>
		<li>EBS'ler ve NPC'ler kesitleme sırasında numunenin kaybolmamasını sağlamak için bıçağa en yakın olacak şekilde OCT bloğunu hizalayın.</li>
		<li>Bloğun 10 μm'lik bölümünü dikkatlice bölümleyin ve numuneyi içeren dilimlere çok dikkat edin.</li>
		<li>Numuneyi içeren OCT dilimini doku gömme cam kaydırağın üzerine hızla yerleştirin ve OCT dilimlerinin oda sıcaklığında 1 saat boyunca havayla kurumasını bekleyin. NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -70 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmünofluoresans (IF) 
	<ol>
<li>%10 normal eşek serumunda nöron içeren OCT bölümlerini veya kültür odalarını bloke edin/%0,1 Triton X-100 1x PBS'de oda sıcaklığında 1 saat.</li>
		<li>%5 normal eşek serumunda seyreltilmiş primer antikordaki örnekleri inkübasyona sokun/%0,05 Triton X-100 1x PBS'de bir gecede 4 °C'de.</li>
		<li>Numuneleri 1x PBS/%0,1 Triton X-100 üç kez 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x PBS'de %5 normal eşek serumu/%0,05 Triton X-100'de seyreltilmiş ikincil antikorla kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 1x PBS/%0,1 Triton X-100 üç kez 5 dakika boyunca yıkayın, ardından numuneleri 1 μg/mL DAPI'da kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri bir kapak ve bir miktar montaj ortamı ile monte edin ve kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Floresan mikroskop altında örnekleri gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-seq analizi 
	<ol>
<li>Hücreleri çeşitli aşamalarda toplayın ve RNA ayıklaması gerçekleştirin (bkz. adım 3.2).</li>
		<li>cDNA kütüphanelerini hazırlayın, Wang ve ark.8'deaçıklanan protokole göre derin sıralama ve veri analizi yapın.</li>
		<li>Gene Ontology (GO) analizini R paketi clusterProfiler kullanarak gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi 
	<ol>
<li>1.6–1.7 adımlarını izleyerek ESC'leri toplayın ve hücreleri orta olarak yeniden uygulayın. 2.4 adımını izleyerek DB'leri ve NPC'leri toplayın ve hücreleri orta olarak yeniden biriktirin.</li>
		<li>40 μm naylon hücre süzgecini kullanarak hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.</li>
		<li>Akış sitometresini (kurumun çekirdek tesisi tarafından gerçekleştirilen) kullanarak numunelerin GFP sinyalini ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kaufman, M. H., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Sugaya, K., Vaidya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases.">Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).</li><li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems.">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).</li><li>McKee, C., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+stem+cell+culture.">Advances and challenges in stem cell culture.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WDR68+is+essential+for+the+transcriptional+activation+of+the+PRC1-AUTS2+complex+and+neuronal+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Visan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+a+tool+to+assess+developmental+neurotoxicity+in+vitro.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro.</a> NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochemical So. 31, 45-49 (2003).</li><li>Park, Y. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro.</a> Development &amp; Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+leukemia+inhibitory+factor+for+establishing+and+maintaining+embryonic+stem+cells+in+mice.">Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).</li><li>Onishi, K., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIF+signaling+in+stem+cells+and+development.">LIF signaling in stem cells and development.</a> Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336, 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ghimire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+naive,+primed+and+ground+state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells+originating+from+the+same+genetic+background.">Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+for+Forming+Embryoid+Body+from+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).</li><li>Wang, X., Yang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+(mES)+cells+using+the+hanging+drop+method.">In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).</li><li>Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Retinoic+Acid+in+the+Differentiation+of+Embryonal+Carcinoma+and+Embryonic+Stem+Cells.">Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells.</a> Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).</li><li>Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox1+marks+an+activated+neural+stem/progenitor+cell+in+the+hippocampus.">Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus.</a> Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+Re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Bahmad, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt/mTOR+pathway+in+cancer+stem/progenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma.">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li><li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings.">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li><li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarların olmadığını beyan eder.

Fare embriyonik kök hücrelerinin sinirsel farklılaşması için yöntem onlarca yıldır oluşturulmuştur ve araştırmacılar önceki protokolleri değiştirmeye veya çeşitli amaçlar için yenilerini oluşturmaya devam etmişlerdir7,10,11. MESC'lerin nöronlara farklılaşma aşamalarının verimliliğini ve ilerlemesini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için bir dizi tahlil kullandık, bu da fare veya insan ESC'lerin...

Gelişmekte olan fare blastosistlerinin iç hücre kütlesinden ilk türetmelerinden bu yana1,2, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmayı incelemek için güçlü araçlar olarak kullanılmıştır3. Ayrıca, mESC farklılaşması, nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıkların tedavisinde kök hücre bazlı tedavide verimliliği ve güvenliği artırabilecek moleküler mekanizmaların muazzam bir şekilde anlaşılmasına yol açar4. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, bu in vitro sistem pratik ve değerlendirmede basitlik, hayvanların aksine hücre hatlarının bakımında düşük maliyet ve genetik manipülasyonlarda göreceli kolaylık gibi birçok avantaj sağlar. Bununla birlikte, farklılaştırılmış hücre türlerinin verimliliği ve kalitesi genellikle farklı mESC çizgilerinin yanı sıra farklılaşma yöntemlerinden etkilenir5,6. Ayrıca, farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için geleneksel tahliller, sağlamlıktan yoksun olan seçilmiş marker genlerinin nitel incelemesine dayanır ve bu nedenle gen ifadesindeki küresel değişiklikleri kavrayamazlar.
Burada nöronal farklılaşmanın sistematik olarak değerlendirilmesi için bir dizi tahlil kullanmayı hedefliyoruz. Seçilen belirteçlerde hem geleneksel in vitro analizleri hem de RNA-seq kullanarak, bu süreçteki transkriptomik değişikliklerin yanı sıra farklılaşma verimliliğinin ölçümü için bir platform oluşturuyoruz. Daha önce belirlenmiş bir protokol7'ye dayanarak, asma damla tekniği ile embriyoid cisimleri (EBs) oluşturduk, ardından daha sonra nöral indüksiyon ortamına sahip nöronlara farklılaştırılmış olan nöral progenitör hücreler (NPC' ler) oluşturmak için suprafizyolojik retinoik asit (RA) kullanarak indüksiyon oluşturduk. Farklılaşmanın verimliliğini incelemek için, geleneksel RT-qPCR ve immünofluoresans (IF) testlerine ek olarak, RNA-seq ve akış sitometrisi gerçekleştirdik. Bu analizler, aşamaya özgü farklılaşmanın ilerlemesinin kapsamlı bir ölçümünü sağlar.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Collected from MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#039;</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#039;</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mNeuroD1 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mOct4 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#039;</td></tr><tr><td>mPax6 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#039;</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin primary antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament primary antibody</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>- Potassium chloride</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium chloride</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

Fare embriyonik kök hücrelerinin nöronal soylara kült haline alınması ve ayırt edilmesi için adım adım prosedürü ve ardından farklılaştırılmış hücreleri karakterize etmek için bir dizi tahlil açıklıyoruz. E14 fare embriyonik kök hücreleri, asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimleri oluşturmak için kullanıldı ve daha sonra retinoik asit ile nöral progenitör hücrelere farklılaşmaya teşvik edildi ve son olarak nöronlara farklılaştı. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofluoresans deneyleri, nöral progenitörlerin ve nöronların sırasıyla 8 ve 12. Sox1 promotör güdümlü bir GFP muhabirini ifade eden bir E14 hattında yapılan akış sitometrisi deneyleri, 8. günde hücrelerin yaklaşık% 60'ının GFP pozitif olduğunu ve bu aşamada nöral progenitör hücrelerin başarılı farklılığını gösterdiğini göstermiştir. Son olarak, küresel transkriptomik değişikliklerin profilini çıkarmak için RNA-seq analizi kullanılmıştır. Bu yöntemler, nöronal farklılaşma sırasında hücre kimliği geçişini düzenlemede belirli genlerin ve yolların katılımını analiz etmek için yararlıdır.

Yöntemimizin bir temsili olarak, E14 hücreleri üzerinde EB, NPC ve nöron farklılaşma deneyi gerçekleştirdik. E14 hücreleri, γ ışınlanmış MEF popülasyonu seyreltilene kadar γ ışınlanmış MEF'lerde kültürlenmiştir (Şekil 1A). Nanog ve Oct4 belirteçleri için Alkalin Fosfataz (AP) boyama ( Şekil 1B ) ve daha sonra RT-qPCR (aşağıya bakın) gerçekleştirerekE14hücrelerinin pluripotency'liğini doğruladık. γ ışın...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.8K Görüntüleme.  Penn State Hershey Cancer Institute. Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Video: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Nörobilim

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

Source: Hanafiah, A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61446">Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

Asılı Damla Yöntemi ile Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

1. mESC culture

	Coat a 10 cm tissue-culture-treated plate with 0.1% gelatin and allow the gelatin to set for at least 15&#8211;30 min before aspirating ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Progenitörlere Farklılaşması

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

Gelişmiş Nöron Modelleri

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.