Name: differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
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Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (1R35GM133496-01) para Z. Gao. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ryan Hobbs pela ajuda na secção. Agradecemos as instalações principais da Penn State College of Medicine, incluindo as Ciências do Genoma e Bioinformática, a Imagem Avançada de Microscopia de Luz e a Citometria de Fluxo. Agradecemos também ao Dr. Yuka Imamura pela assistência na análise do RNA-seq.

1. cultura mESC
<ol><li>Cubra uma placa tratada com 10 cm de tecido com gelatina de 0,1% e deixe que a gelatina se estafina por pelo menos 15-30 minutos antes de aspirar.</li>
	<li>Sementes γ camundongos embrionários (MEFs) um dia antes de cultivar os mESCs no meio mESC pré-aquecido (médio águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 15% de soro bovino fetal (FBS), aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Permita que os MEFs irradiados de γ se acomodem e se anexem à superfície da placa antes de estancar as células E14.</li>
	<li>Descongele E14 ESCs em banho-maria de 37 °C e transfira rapidamente as células em um tubo cônico de 15 cm com meio mESC quente. Pelota as células a 200 x g por 3 min e remova o supernasce.</li>
	<li>Resuspengem as células em 10 mL de mESC médio e emplaque as células na placa de cultura contendo os MEFs irradiados γ anteriormente. Incubar a cultura celular em uma incubadora de 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Para a passagem de cultura, aspire e o médio e lave a placa com 1x PBS estéril. Adicione 0,05% de trippsina suficiente para cobrir a superfície da placa e incubar a 37 °C por 3 min.</li>
	<li>Neutralizar a trippsina com mESC médio e pipeta para gerar suspensão unicelular. Centrifugar as células a 200 x g por 3 min e remover o supernante.</li>
	<li>Conte as células com um hemótmetro ou contador de células e sementes cerca de 5,0 x 105 células em uma placa de cultura de 10 cm.</li>
	<li>Resuspenque as células em 10 mL de mESC médio, plaque as células na placa de cultura de tecido revestida de gelatina e incuba culturas como descrito anteriormente. NOTA: Recomenda-se que os mESCs sejam aprovados a cada 2 dias para evitar que as células se diferenciem em suas colônias. O fenol vermelho no médio funciona apenas como um indicador de pH e dependendo da densidade celular, pode ficar amarelado (mais ácido), mais cedo do que 2 dias. Portanto, pode ser necessário mudar o meio todos os dias. Os MEFs irradiados γ acabarão morrendo depois de algumas passagens.</li>
</ol>2. EB, NPC e diferenciação de neurônios
<ol><li>Executar o protocolo de passagem de cultura mencionado anteriormente e contar as células (etapas 1.7-1.10).</li>
	<li>Método de queda de suspensão(dia 0)<ol>
<li>Para uma placa de cultura celular de 10 cm, contar cerca de 2,5 x 104 células onde 5,0 x 10 2 célulasserão suspensas em 20 μL de diferenciação (DMEM com 15% de FBS, aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e pirudo de sódio). Cerca de 50 gotículas de 20 μL contendo as células podem ser banhadas em uma placa de 10 cm.</li>
		<li>Alíquotar o número apropriado de células, e então centrifugar as células a 200 x g por 3 min e remover o supernante.</li>
		<li>Resuspenncie as células no volume adequado do meio de diferenciação para uma densidade celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por exemplo, 2,5 x 104 células em 1 mL de meio de diferenciação).</li>
		<li>Usando uma micropipette ou uma pipeta repetidora, coloque 20 gotículas de μL da suspensão celular na tampa da placa de cultura tecidual. Certifique-se de que as gotículas não estão muito próximas umas das outras para evitar que elas se fundam. NOTA: As gotículas podem ser banhadas em uma placa de fixação tratada com cultura tecidual ou placa de suspensão, pois serão colocadas na tampa e não na placa em si. Para uma abordagem mais viável e estéril, plaque as gotículas em uma placa de cultura tecidual de fixação e transfira-as para uma placa de suspensão como descrito abaixo.</li>
		<li>Encha a placa com 5-10 mL de 1x PBS e coloque cuidadosamente a tampa de volta na placa. Incubar a cultura na incubadora de 37 °C. NOTA: O PBS é adicionado à placa de cultura para evitar que as gotículas sequem.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 2,use uma micropipette para coletar as gotículas da tampa e colocá-las em uma placa de suspensão de cultura celular de 10 cm preenchida com 10 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em um agitador orbital tremendo em baixa velocidade na incubadora.</li>
	<li>No dia 4, para colher os EBs, coletar as células, centrífugas a 200 x g por 3 min, e remover o sobrenante. NOTA: Os EBs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com os requisitos dos experimentos subsequentes.</li>
	<li>Para continuar o procedimento e induzir a diferenciação do EB em células progenitoras neurais (NPCs), prepare o meio de diferenciação com ácido retinóico de 5 μM (RA).</li>
	<li>Remova o meio antigo pelo menos os EBs a 100 x g por 3 min ou deixe que os EBs se acomodem antes de aspirar o meio antigo. Adicione 10 mL do meio de diferenciação contendo RA de 5 μM à placa de cultura.</li>
	<li>No dia 6,substitua pelo menos metade do meio por meio fresco contendo RA de 5 μM, inclinando a placa e pipetando o meio como descrito acima. NOTA: Recomenda-se que pelo menos metade do meio seja substituída por um meio fresco contendo RA nos dias 5 e 7. Tome nota do indicador vermelho fenol; se ficar amarelado, é melhor substituir todo o meio.</li>
	<li>No dia 8,colhe os NPCs coletando as células, centrifugando a 200 x g por 3 min, e removendo o sobrenante. NOTA: Os NPCs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com as necessidades de experimentos subsequentes. Se necessário, os NPCs podem ser congelados e descongelados novamente para cultura e análise posteriores. Se os NPCs forem cultivados, a accutase também pode ser usada como alternativa à trippsina.</li>
	<li>Para continuar o procedimento e diferenciar os NPCs em neurônios, colete NPCs em um tubo cônico de 15 mL por centrifugação, dissociá-los com trippsina e incuba-los a 37 °C por 3 min. Pipetar os NPCs para garantir que todos os agregados de NPC sejam dissociados e neutralizar o trypsin com o meio.</li>
	<li>Filtre as células com coador de células de nylon de 40 μm e conte as células antes de emplacar-as a uma densidade de 1,5 x 105/cm2 em n2 médio (médio DMEM/F12 + 3 mg/mL de glicose + 3 mg/mL rico em lipídios albumina de soro bovino (LBSA) + 1:100 Suplemento N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL pen/strep + 1 mM L-glutamine) em uma placa tratada de cultura tecidual para experimentos subsequentes de PCR e blot ocidental; ou em uma câmara de cultura de tecidos para experimentos de imunofluorescência.</li>
	<li>No dia 9,substitua o antigo meio por um novo meio N2.</li>
	<li>No dia 10,troque o n2 médio com n2/B27 médio (50% DMEM/F12 e 50% basal neural, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 suplemento, 1:100 B27 suplemento, 50 U/mL caneta/estreptococos, e 1 mM L-glutamina).</li>
	<li>Nos dias 11-12,colhe os neurônios da seguinte forma. Lave as células com 1x PBS, adicione trippsina e incuba a cultura na incubadora de 37 °C por 3 minutos antes de neutralizar a trippsina com média e centrífuga a 200 x g por 3 min.</li>
</ol>3. Caracterização de mESCs e células diferenciadas
<ol><li>Ensaio de fosfatase alcalina (AP) 
	<ol>
<li>Use um kit para avaliar a atividade de fosfates alcalina (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Retire o meio da placa de cultura e lave os ESCs com 1x PBS.</li>
		<li>Adicione 1 mL da solução fixa (consiste em formaldeído e metanol) fornecido com o kit à placa e incuba-o à temperatura ambiente por 2-5 min. NOTA: A super incubação na solução de correção pode comprometer a atividade AP.</li>
		<li>Remova a solução de correção, lave os ESCs com 1x PBS e deixe alguma quantidade de PBS na placa. NOTA: Mantenha os ESCs úmidos no PBS para não comprometer a atividade ap.</li>
		<li>Prepare a solução AP misturando as soluções de substrato A, B e C na proporção 1:1:1. Misture primeiro as soluções A e B e incubar a mistura à temperatura ambiente por 2 minutos antes de adicionar a solução C.</li>
		<li>Remova o PBS 1x e adicione a solução AP preparada anteriormente.</li>
		<li>Incubar os ESCs por cerca de 15 minutos no escuro, embrulhando a placa de cultura com papel alumínio ou realizando o passo 3.5 em uma sala escura.</li>
		<li>Monitore a reação e remova a solução de reação quando a solução ficar brilhante para evitar manchas não específicas.</li>
		<li>Lave os ESCs duas vezes com 1x PBS.</li>
		<li>Evite que a amostra seque, cobrindo os ESCs com 1x PBS ou meio de montagem. NOTA: Uma mancha vermelha ou roxa aparecerá para a expressão AP. A placa pode ser armazenada em uma geladeira de 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Coletar células em vários estágios seguindo as etapas 1.6-1.7 e 2.4 para ESCs e EBs e NPCs, respectivamente.</li>
		<li>Isolar o RNA usando solução de RNA, DNA e extração de proteínas (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Gerar cDNA com um kit de transcriptase reversa (ver a Tabela de Materiais) e seguir o manual do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação e incorporação 
	<ol>
<li>Colher EBs e NPCs conforme descrito acima (passo 2.6) e corrigi-los com solução de paraformaldeído (PFA) de 4% em 1x PBS por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire o PFA e lave a amostra com 1x PBS por 5 minutos.</li>
		<li>Coloque a amostra em uma diluição serial de 1x PBS, 10%-, 20%-, e 30% de soluções de sacarose a 25\u201228 °C onde a amostra é transferida para a próxima solução após 30 minutos de incubação. NOTA: A amostra pode ser armazenada na solução de sacarose de 30% a 4 °C antes de continuar com a etapa de incorporação.</li>
		<li>Molhe a ponta da pipeta com solução de sacarose antes de colocar a amostra (sem empilhá-las) no centro do molde crio-mold e pipeta para fora do excesso de líquido. NOTA: O papel do filtro também pode ser usado para remover a solução em excesso. Molhar a ponta da pipeta com solução de sacarose é importante para evitar que os EBs e NPCs grudem nas paredes da ponta.</li>
		<li>Adicione cuidadosamente a solução de temperatura de corte (OCT) ideal ao molde sem reutilizar as amostras e remova bolhas em excesso com uma pipeta.</li>
		<li>Coloque o molde com a amostra em uma batedeira de laboratório em baixa velocidade para agitar levemente a amostra por 15 minutos. Isso ajuda a resolver os EBs e NPCs até o fundo se eles forem resuspensados na solução OCT.</li>
		<li>Congele rapidamente a amostra colocando o molde em nitrogênio líquido ou em gelo seco. NOTA: As amostras podem ser armazenadas em um congelador de -70 °C antes de continuar para o próximo passo.</li>
	</ol></li>
	<li>Criocendo 
	<ol>
<li>Defina o criostat para esfriar para -20 a -18 °C antes de transferir a amostra para o instrumento.</li>
		<li>Retire o bloco OCT congelado do molde e fixe-o no suporte com uma pequena solução oct colocada na superfície do suporte.</li>
		<li>Alinhe o bloco OCT para que os EBs e NPCs estejam mais próximos da lâmina para garantir que a amostra não seja perdida durante a secção.</li>
		<li>Seção cuidadosa 10 μm do bloco e preste muita atenção às fatias que contêm a amostra.</li>
		<li>Coloque rapidamente a fatia OCT contendo a amostra no slide de vidro de incorporação de tecido e permita que as fatias de OCT sequem ao ar por 1 h à temperatura ambiente. NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -70 °C para uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunofluorescência (IF) 
	<ol>
<li>Bloco de seções OCT ou câmaras de cultura contendo neurônios em soro de burro 10% normal/0,1% Triton X-100 em 1x PBS por 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar as amostras em anticorpo primário diluído em 5% de soro de burro normal/0,05% Triton X-100 em 1x PBS durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Lave amostras em 1x PBS/0,1% Triton X-100 três vezes por 5 min cada lavagem.</li>
		<li>Incubar as amostras com anticorpo secundário diluído em 5% de soro de burro normal/0,05% Triton X-100 em 1x PBS por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave amostras em 1x PBS/0,1% Triton X-100 três vezes por 5 min cada lavagem e incubar as amostras em 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Monte as amostras com um deslizamento de tampa e algum meio de montagem e deixe secar.</li>
		<li>Observe as amostras sob um microscópio de fluorescência.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de RNA-seq 
	<ol>
<li>Recolher as células em vários estágios e realizar a extração de RNA (ver passo 3.2).</li>
		<li>Preparar as bibliotecas cDNA, realizar sequenciamento profundo e análise de dados de acordo com o protocolo descrito em Wang et al.8.</li>
		<li>Execute a análise de Ontologia genética (GO) usando o pacote R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria de fluxo 
	<ol>
<li>Colete ESCs seguindo as etapas 1.6-1.7 e resuspenque as células em médio. Colete os EBs e NPCs seguindo o passo 2.4 e resuspenque as células em médio.</li>
		<li>Filtre a suspensão celular usando o coador de células de nylon de 40 μm em um novo tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Meça o sinal de GFP das amostras utilizando o citômetro de fluxo (realizado pela instalação central da instituição).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.

O método de diferenciação neural de células-tronco embrionárias do camundongo foi estabelecido há décadas e os pesquisadores continuaram a modificar os protocolos anteriores ou criar novos para vários propósitos7,10,11. Utilizamos uma série de ensaios para analisar de forma abrangente a eficiência e o progresso das etapas de diferenciação dos mESCs aos neurônios, que podem ser utilizados na análise de outras difer...

Desde sua primeira derivação da massa celular interna dos blastocistos do camundongo em desenvolvimento1,2, as células-tronco embrionárias do rato (mESC) têm sido usadas como ferramentas poderosas para estudar a autoconexão e diferenciação das células-tronco3. Além disso, estudar a diferenciação do MEESC leva a uma tremenda compreensão dos mecanismos moleculares que podem melhorar a eficiência e a segurança na terapia baseada em células-tronco no tratamento de doenças como distúrbios neurodegenerativos4. Em comparação com os modelos animais, este sistema in vitro oferece muitas vantagens, incluindo simplicidade na prática e avaliação, baixo custo na manutenção de linhas celulares em contraste com os animais e relativa facilidade em manipulações genéticas. No entanto, a eficiência e a qualidade dos tipos de células diferenciadas são frequentemente afetadas por diferentes linhas de mESCs, bem como pelos métodos de diferenciação5,6. Além disso, os ensaios tradicionais para avaliar a eficiência de diferenciação dependem do exame qualitativo de genes marcadores selecionados que carecem de robustez e, portanto, não conseguem compreender as mudanças globais na expressão genética.
Aqui pretendemos usar uma bateria de ensaios para avaliação sistemática da diferenciação neuronal. Utilizando ambas as análises in vitro tradicionais em marcadores selecionados e RNA-seq, estabelecemos uma plataforma para medição da eficiência de diferenciação, bem como as alterações transcriômicas durante este processo. Com base em um protocolo previamente estabelecido7,geramos corpos embrionários (EBs) através da técnica de queda suspensa, seguidos pela indução usando quantidade suprafisiológica de ácido retinóico (RA) para gerar células progenitoras neurais (NPCs), que foram posteriormente diferenciadas aos neurônios com meio de indução neural. Para examinar a eficiência da diferenciação, além dos ensaios tradicionais de RT-qPCR e imunofluorescência (IF), realizamos RNA-seq e citometria de fluxo. Essas análises fornecem uma medição abrangente da progressão da diferenciação específica do estágio.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Collected from MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#039;</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#039;</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mNeuroD1 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mOct4 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#039;</td></tr><tr><td>mPax6 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#039;</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin primary antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament primary antibody</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>- Potassium chloride</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium chloride</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

Descrevemos o procedimento passo-a-passo para cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias do camundongo em linhagens neuronais, seguido por uma série de ensaios para caracterizar as células diferenciadas. As células-tronco embrionárias do rato E14 foram usadas para formar corpos embrionários através do método de queda suspensa, e então induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais por ácido retinóico, e finalmente diferenciadas em neurônios. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e os experimentos de imunofluorescência revelaram que os progenitores e neurônios neurais exibem marcadores correspondentes (nestin para progenitores neurais e neurofilamento para neurônios) nos dias 8 e 12 pós-diferenciação, respectivamente. Experimentos de citometria de fluxo em uma linha E14 expressando um repórter gfp orientado pelo promotor Sox1 mostraram que cerca de 60% das células no dia 8 são GFP positivas, indicando a diferenciação bem sucedida das células progenitoras neurais nesta fase. Finalmente, a análise do RNA-seq foi utilizada para traçar o perfil das alterações transcriômicas globais. Esses métodos são úteis para analisar o envolvimento de genes e caminhos específicos na regulação da transição da identidade celular durante a diferenciação neuronal.

Como representação do nosso método, realizamos um experimento de EB, NPC e diferenciação de neurônios em células E14. As células E14 foram cultivadas em MEFs irradiados γ(Figura 1A)até que a população de MEF irradiada γ diluída. Confirmamos a pluripotência das células E14 realizando coloração de Fosfattase Alcalina (AP)(Figura 1B)e posteriormente RT-qPCR (veja abaixo) para marcadores Nanog e Oct4. As células E14 sem MEF γ fo...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.8K visualizações.  Penn State Hershey Cancer Institute. Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Vídeo: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Neurociência

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologia

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

Source: Hanafiah, A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61446">Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos pelo método Hanging Drop

1. mESC culture

	Coat a 10 cm tissue-culture-treated plate with 0.1% gelatin and allow the gelatin to set for at least 15&#8211;30 min before aspirating ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em progenitores neurais

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

Advanced Neuronal Models

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.