Bu yeni protokol, sentetik nükleik asit taklit gama PNA'nın belirli organik çözücü karışımlarında nanoyapılar oluşturmak için birden fazla farklı dizinin kullanımını açıklamaktadır. Burada açıklanan tahliller, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin çok az veya hiç protokol yayınlanmamış organik çözücülere uyarlanma gereğini göstermektedir. Bu tekniğin yeni uygulayıcıları, nanomalzeme PNA'nın toplama eğilimi nedeniyle sulu-zengin ortamlar için geliştirilen mevcut protokolleri organik çözücü açısından zengin ortamlara uyarlamakta zorlanabilirler.
Gama PNA stokları hazırlayarak başlayın. Ticari bir üreticiden HPLC sınıfı saflaştırılmış gama PNA iplikçikleri aldıktan sonra, deiyonize sudaki her bir ipliği 300 mikromolar konsantrasyona geri alın. Gama PNA'larını eksi 20 derecede birkaç aya kadar saklayın.
Kendi kendine montaj yapmaya hazır olduğunuzda, %75 DMSO, %75 DMF ve %40 1, 4-dioksan toplu iş örnekleri hazırlayın. İlk olarak, ana stoktan 0,67 mikrolitre aliquoting ve 10 mikrolitre son bir hacim için deiyonize su ekleyerek her oligomer 20 mikromolar alt stokları hazırlayın. 20 mikromolar alt hisse senetlerinden her bir oligomerin bir mikrolitresini 200 mikrolitrelik PCR tüpüne ekleyin, bu da dokuz oligomer için toplam dokuz mikrolitre hacmine gelecektir.
40 mikrolitre lik son hacim için bir mikrolitre deiyonize su ile 30 mikrolitre susuz DMSO veya DMF ekleyin. 40%1, 4-dioksan toplu hazırlamak için, 1, 4-dioksan 16 mikrolitre ekleyin ve deiyonize su ile 40 mikrolitre hacmi getirmek. 90 ila 20 santigrat derece soğutma bir termal döngüc içinde 22,5 saat boyunca örnekler anneal.
Tipik olarak, iki oligomer ve üç oligomer gama PNA alt kümesi için elde edilen erime sıcaklıkları farklı çözücü koşulları için 40 ila 70 santigrat derece aralığında dır. Termal döngücörü el yazması talimatlara göre programla. Anneleştirme tamamlandıktan sonra, örnekler karakterizasyondan önce 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklanabilir.
Kutuyu yaklaşık beş mililitre suyla doldurarak boş bir pipet ucu kutusundan nem haznesi yapın. Nitroselüloz çözeltisi oluşturmak için izoamyl asetat çözücü ile amil asetat ticari olarak kullanılabilir% 2 kolokit 20 kat seyreltme hazırlayın. Nitroselüloz çözeltisine bir kapak daldırma ve hava-kuru izin için cımbız kullanın, sonra bir mikroskop slayt bir akış odası yapmak, iki çift taraflı bant şeritler, ve nitroselüloz kaplı coverslip.
Biotin BSA çözeltisini bir miligram biotin BSA tartarak ve bir mililitre PBS'de eriterek hazırlayın. Pipet 15 mikrolitre biotin BSA bir açıyla akış kanalına ve nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında 2-4 dakika kuluçka. Bir mililitre PBS'de bir miligram BSA'dan oluşan yıkama tamponunun 15 mikrolitresini, fazla biotin BSA'yı temizlemek için kanala üfleyin, sonra da akış kanalını nemlendirilmiş odada 2-4 dakika kuluçkaya yatırarak yüzeyi pasifize edin.
Ölçü 0.5 streptavidin miligram ve BSA bir miligram, sonra PBS bir mililitre her ikisi de çözünür. Pipet 15 mikrolitre streptavidin çözeltisi akış kanalına yerleştirin ve 2-4 dakika nemli haznesine yerleştirin ve 15 mikrolitre yıkama tamponu dederek kanalı yıkayın. Daha sonra, nemlendirilmiş odada gama PNA oligomerlerinin 15 mikrolitrelik kısmını boşaltın, sonra da bir milimolar Trolox'un 15 mikrolitresini nanoyapılarla aynı çözücü bileşiminde akıtarak bağlanmamış nanoyapıları yıkayın.
Akış kanalını slayt tutucuya aktarın ve TIRF görüntüleme, 60X yağ daldırma hedefi ve 1,5 X büyüteçle donatılmış bir floresan mikroskobuyla görüntüleyin. Cy3 kanalını izlerken akış kanalını 60 veya 90X büyütme de tazyin. El yazması talimatlara göre 20 ve%6 SDS stokları hazırlayın, ardından 200 mikrolitrelik PCR tüpüne her 20 mikromolar oligomerden bir mikrolitre ekleyerek gama PNA oligarmerlerini anneal.
40 mikrolitrelik son bir hacim için PCR tüplerine 30 mikrolitre susuz DMSO ve %6 veya %20 SDS mikrolitre ekleyin ve bu da sırasıyla 5,25 veya 17,5 milimolar son bir SDS konsantrasyonu ile sonuçlanır. Anneal gama PNA'lar termocycler daha önce açıklandığı gibi. TIRF veya TEM protokolünü kullanarak SDS varlığında gama PNA nanoyapılarını karakterize edin.
%75 DMSO'da bulunan gama PNA oligomerlerinin TIRF görüntülemesi iyi organize edilmiş mimariler gösterirken, %75 DMF'de annealing spicule şekilli veya iğne benzeri nanoyapılarla sonuçlandı. 40%1, 4-dioksan durumu ipliksi nanoyapıların seyrek bir dekorasyon üretti. Ayrıca, %75 DMSO'da oluşturulan gama PNA nanotüpleri, TEM görüntüleme sırasında yüksek büyütme veya nanoskobik çözünürlüklerde nanofiberlerin birleştirilmesini göstermiştir.
Nanoyapıların genişliğinin nicel analizi, maksimum değerler80 nanometrenin üzerinde olan 16,3 nanometre ortanca genişlik gösterdi. Bitişik gama PNA'larının yerini alan izoardiye DNA oligomerleri düz ipliksi yapılar oluşurken, çapraz gama PNA'larının değiştirilmesi yıldız yapılarına neden olur. Bitişik DNA oligomerleri ile değiştirilen nanoyapıların ortanca genişlikleri yaklaşık 19 nanometreidi.
Yüksek SDS konsantrasyonlarında, gama PNA nanofibers de TIRF görüntüleme ile bakıldığında kritik micelle konsantrasyonları ile karşılaştırıldığında son derece ağ morfolojileri benimsemek. TEM görüntüleme, 5.25 milimolar SDS'deki gama PNA montajının yapısal donatmada en önemli azalmalara sahip olduğunu göstermektedir. Bu protokolü denerken, nanoyapıların toplama eğilimi nedeniyle belirtildiği gibi çözücü bileşimlerini korumak önemlidir.
Bu yöntemler uygulayıcıları farklı çözücü bileşimleri, yüzey aktif maddeler ve diğer PNA DNA nanoyapılarının keşfedilmemiş diğer yollarını takip etmeye teşvik eder.
