Questo nuovo protocollo descrive l'uso di più sequenze distinte dell'acido nucleico sintetico che imitano la gamma PNA per formare nanostrutture in specifiche miscele di solventi organici. I test qui descritti mostrano la necessità di adattare i protocolli di nanotecnologia dell'acido nucleico esistenti ai solventi organici dove sono stati pubblicati pochi o nessun protocollo. I professionisti nuovi a questa tecnica potrebbero avere difficoltà ad adattare i protocolli esistenti sviluppati per ambienti ricchi di acquosi in ambienti organici ricchi di solventi a causa della propensione del nanomateriale PNA ad aggregarsi.
Inizia preparando le scorte di PNA gamma. Dopo aver ottenuto trefoli gamma PNA purificati di grado HPLC da un produttore commerciale, rimescolare ogni filamento in acqua deionizzata a 300 concentrazioni micromolare. Conservare i PNA gamma a meno 20 gradi Celsius per un massimo di diversi mesi.
Quando si è pronti per eseguire l'auto-assemblaggio, preparare campioni di batch ricotto in 75%DMSO, 75%DMF e 40%1, 4-diossano. In primo luogo, preparare 20 sottostock micromolari di ogni oligomero aliquotando 0,67 microlitri dallo stock principale e aggiungendo acqua deionizzata per un volume finale di 10 microlitri. Aggiungere un microlitro di ogni oligomero dai 20 sottostock micromolari a un tubo PCR da 200 microlitri, che arriverà a un volume totale di nove microlitri per nove oligomeri.
Aggiungere 30 microlitri di DMSO anidro o DMF con un microlitro aggiuntivo di acqua deionizzata per un volume finale di 40 microlitri. Per preparare il lotto 40%1, 4-diossano, aggiungere 16 microlitri da 1, 4-diossano e portare il volume a 40 microlitri con acqua deionizzata. Ricottura dei campioni per 22,5 ore in un raffreddamento a ciclo termico da 90 a 20 gradi Celsius.
Tipicamente, le temperature di fusione ottenute per due sottoinsiemi di oligomero e tre oligomeri gamma PNA si trovano nell'intervallo da 40 a 70 gradi Celsius per diverse condizioni del solvente. Programmare il ciclore termico secondo le indicazioni manoscritte. Una volta completata la ricottura, i campioni possono essere conservati a quattro gradi Celsius per 12-24 ore prima della caratterizzazione.
Creare una camera di umidità da una scatola vuota di punte di pipetta riempiendo la scatola con circa cinque millilitri di acqua. Preparare una diluizione di 20 volte il collodio del 2% disponibile in commercio in acetato di amile con solvente acetato di isoamile per creare la soluzione di nitrocellulosa. Utilizzare una pinzetta per immergere un coverslip nella soluzione di nitrocellulosa e consentirgli di asciugare all'aria, quindi fare una camera di flusso da uno scivolo del microscopio, due strisce di nastro a doppia lato e il coverslip rivestito di nitrocellulosa.
Preparare la soluzione di biotina BSA pesando un milligrammo di biotina BSA e scioglierla in un millilitro di PBS. Pipettare 15 microlitri della biotina BSA nel canale di flusso con un angolo e incubarlo per due o quattro minuti a temperatura ambiente nella camera umidificata. Soffiare 15 microlitri del tampone di lavaggio, che consiste in un milligrammo di BSA in un millilitro di PBS, nel canale per lavare via la biotina in eccesso BSA, quindi passivare la superficie incubando il canale di flusso per due o quattro minuti nella camera umidificata.
Misurare 0,5 milligrammi di streptavidina e un milligrammo di BSA, quindi sciogliere entrambi in un millilitro di PBS. Pipettare 15 microlitri della soluzione di streptavidina nel canale di flusso e posizionarlo nella camera umidificata per due o quattro minuti e lavare il canale scorrono 15 microlitri di tampone di lavaggio. Successivamente, scorrono 15 microlitri del lotto ricotto degli oligomeri gamma PNA nella camera umidificata, quindi lavano le nanostrutture non unite fluendo 15 microlitri di un Trolox millimolare nella stessa composizione solvente delle nanostrutture.
Trasferire il canale di flusso al porta scorrevole e imagerlo con un microscopio a fluorescenza dotato di imaging TIRF, un obiettivo di immersione dell'olio 60X e una lente d'ingrandimento 1.5X. Scansiona il canale di flusso con ingrandimento 60 o 90X durante il monitoraggio del canale Cy3. Preparare scorte di SDS 20 e 6% secondo le indicazioni manoscritte, quindi ricotturare gli oligomeri gamma PNA aggiungendo un microlitro di ogni oligomero micromolare 20 a un tubo PCR da 200 microliter.
Aggiungere 30 microlitri di DMSO anidro e un microlitro del 6% o del 20% SDS ai tubi PCR per un volume finale di 40 microlitri, che si tradurrà in una concentrazione finale di SDS rispettivamente di 5,25 o 17,5 millimolare. Ricottura dei PNA gamma nel termociclo come descritto in precedenza. Caratterizzare le nanostrutture gamma PNA in presenza di SDS utilizzando il protocollo TIRF o TEM.
L'imaging TIRF di oligomeri gamma PNA ricotto nel 75%DMSO ha mostrato architetture ben organizzate mentre la ricottura nel 75%DMF ha portato a nanostrutture a forma di spicule o ad ago. La condizione del 40%1, 4-diossano ha prodotto una decorazione sparsa di nanostrutture filamentose. Inoltre, i campioni di nanotubi gamma PNA formati nel 75%DMSO hanno dimostrato l'aggregazione di nanofibre ad alto ingrandimento o risoluzioni nanoscopiche durante l'imaging TEM.
L'analisi quantitativa della larghezza delle nanostrutture ha mostrato una larghezza mediana di 16,3 nanometri con valori massimi oltre gli 80 nanometri. Gli oligomeri di DNA isosequenziali che hanno sostituito i PNA gamma contigui formavano strutture filamentose dritte mentre la sostituzione dei PNA gamma crossover si traducono in strutture stellate. Le nanostrutture che sono state sostituite con oligomeri di DNA contigui avevano larghezze medie di circa 19 nanometri.
Ad alte concentrazioni di SDS, le nanofibre gamma PNA adottano anche morfologie altamente in rete rispetto alle sue concentrazioni critiche di micelle se viste con l'imaging TIRF. L'imaging TEM indica che l'assemblaggio di PNA gamma in SDS da 5,25 millimolari ha le riduzioni più sostanziali nell'aggregazione strutturale. Quando si tenta questo protocollo, è importante ricordare di mantenere le composizioni del solvente come menzionato a causa della propensione delle nanostrutture ad aggregarsi.
Questi metodi incoraggiano i praticanti a perseguire altre strade inesplorate di diverse composizioni di solventi, tensioattivi e altre nanostrutture di DNA PNA.
