Этот новый протокол описывает использование нескольких различных последовательностей синтетической нуклеиновой кислоты имитировать гамма PNA для формирования наноструктур в конкретных органических смесей растворителя. Описанные здесь анализы свидетельствуют о необходимости адаптации существующих протоколов нуклеиновой кислоты к органическим растворителям, в которых практически не было опубликовано протоколов. Практикующим, новым для этого метода, может быть трудно адаптировать существующие протоколы, разработанные для богатых aqueous сред в органических богатых растворителями средах из-за склонности наноматериалов PNA к агрегировать.
Начните с подготовки гамма PNA запасов. После получения HPLC класса очищенных гамма PNA нитей от коммерческого производителя, повторно каждую прядь в деионизированной воде до 300 микромоляных концентраций. Храните гамма-ПНА при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
Когда готовы к самостоятельной сборке, подготовить аннеальные образцы партии в 75%DMSO, 75%DMF, и 40%1, 4-диоксан. Во-первых, подготовить 20 микромоляных подстоков каждого олигомера путем алицитирования 0,67 микролитров из основного запаса и добавления деионизированной воды для конечного объема в 10 микролитров. Добавьте один микролитр каждого олигомера из 20 микромоляных подстоков в 200 микролитров ПЦР-трубки, которые будут иметь общий объем в девять микролитров для девяти олигомеров.
Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO или DMF с дополнительным одним микролитером деионизированной воды для конечного объема 40 микролитров. Для приготовления 40%1, 4-диоксана партии, добавить 16 микролитров 1, 4-диоксан и довести объем до 40 микролитров с деионизированной водой. Аннеал образцы в течение 22,5 часов в тепловой циклер охлаждения от 90 до 20 градусов по Цельсию.
Как правило, температуры плавления, полученные для двух олигомеров и трех олигомерных гамма-подмножего PNA, находятся в диапазоне от 40 до 70 градусов по Цельсию при различных условиях растворителя. Запрограммировать тепловой циклер в соответствии с рукописными указаниями. После того, как annealing завершена, образцы могут храниться при четырех градусах по Цельсию в течение 12 до 24 часов до характеристики.
Сделайте камеру влажности из пустой коробки советы пипетки, заполнив коробку с примерно пятью миллилитров воды. Подготовка 20-кратное разбавление коммерчески доступных 2%collodion в ацетате амила с растворителем изоамил ацетата для создания раствора нитроцеллюлозы. Используйте пинцет, чтобы окунуть крышку в раствор нитроцеллюлозы и позволить ему высохнуть в воздухе, а затем сделать камеру потока из микроскопа слайд, две двусторонние ленточных полос, и нитроцеллюлозы покрытием крышки.
Подготовьте раствор биотина BSA, взвесив один миллиграмм биотина BSA и растворив его в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров биотина BSA в канал потока под углом и инкубировать его в течение двух-четырех минут при комнатной температуре во влажной камере. Удар 15 микролитров буфера мытья, который состоит из одного миллиграмма BSA в один миллилитр PBS, в канал, чтобы смыть избыток биотина BSA, а затем пассивировать поверхность путем инкубации канала потока в течение двух-четырех минут во влажной камере.
Измерьте 0,5 миллиграмма стрептавидина и один миллиграмм BSA, затем растворите оба в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров раствора стрептавидина в канал потока и поместите его в увлажненной камере в течение двух-четырех минут и мыть канал, вытекающих 15 микролитров мыть буфера. Далее, поток 15 микролитров аннулированной партии гамма PNA олигомеров во влажной камере, а затем мыть несырь наноструктур, вытекающих 15 микролитров одного миллимолярный Trolox в том же составе растворителя, как наноструктуры.
Перенесите канал потока на держатель слайда и извещаете его с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного изображением TIRF, целью погружения в масло 60X и 1,5-х magnifier. Сканирование канала потока на 60 или 90X увеличение при мониторинге канала Cy3. Подготовьте 20 и 6%SDS запасов в соответствии с рукописными указаниями, а затем аннеал гамма PNA олигомеры, добавив один микролитр из каждых 20 микромолейных олигомеров в 200 микролитров ПЦР трубки.
Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO и один микролитр 6%или 20% SDS в трубки ПЦР для конечного объема 40 микролитров, что приведет к окончательной концентрации SDS 5,25 или 17,5 миллимолейра соответственно. Аннеал гамма-ПНА в термоциклере, как описано ранее. Характеризуйте гамма-наноструктуры PNA в присутствии SDS с помощью протокола TIRF или TEM.
TIRF изображения гамма PNA олигомеры annealed в 75%DMSO показали хорошо организованные архитектуры в то время как annealing в 75%DMF привело к пряной формы или иглы, как наноструктуры. Состояние 40%1, 4-диоксана произвело редкое украшение нитей наноструктур. Кроме того, образцы гамма-нанотрубок PNA, образованные в 75% DMSO, продемонстрировали комплектацию нановофибер при высоком увеличении или наноскопических разрешениях во время визуализации TEM.
Количественный анализ ширины наноструктур показал медианную ширину 16,3 нанометров с максимальными значениями за 80 нанометров. Isosequential ДНК олигомеры, которые заменили смежных гамма-ПНА формируется прямой нити структур в то время как замена кроссовер гамма-ПНА привести к stellate структур. Наноструктуры, которые были заменены смежными олигомерами ДНК, имели среднюю ширину около 19 нанометров.
При высоких концентрациях SDS, гамма PNA нановобры также принять высоко сетевой морфологии по сравнению с его критических концентраций micelle при просмотре с TIRF изображений. TEM изображения показывают, что гамма PNA сборки в 5,25 миллимоляров SDS имеет наиболее существенное сокращение структурных комплектации. При попытке этого протокола, важно помнить, чтобы сохранить состав растворителя, как уже упоминалось из-за склонности наноструктур к агрегировать.
Эти методы побуждают практикующих преследовать другие неизведанные пути различных растворителей, сурфактантов и других наноструктур ДНК PNA.
