Burada, ham mikroskopi görüntülerinden çıkarı olan düzleştirilmiş solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilen Worm-align adlı basit bir açık kaynak Fiji tabanlı iş akışını tanımlıyoruz. Bu iş akışı kullanıcı tarafından seçilen ilgi çekici hayvanlara dayandığından, solucanların hepsinin doğru aşamada veya durumda olmadığı C.elegans'tan gelen görüntüleri analiz ederken özellikle yararlı olabilir. Worm-align çıktısının, Fiji veya diğer görüntü analiz yazılımları ile floresan sonraki niceliklendirme için kullanılabileceğini belirtmek gerekir.
Burada CellProfiler boru hattı Worm_CP kullanarak floresan nicelliği göstermek. Alev uzatma sonra, uzatma sonra iki parçaya kırmak değilse iki parçaya kılcal kırın.
Eğer iki parçaya bölünüyorsa, en uzununun ucunu kes. Uzun parçaseçin ve su aspire etmeye çalışarak kılcal açık olup olmadığını test edin. Adaptörü üç milimetrelik silikon tüpten ayırın.
Cam kılcal damarı altı milimetrelik silikon boruya bağlı bir kılcal adaptöre takın. Daha sonra altı milimetrelik tüpün diğer ucunu 0,2 mikrometrelik bir filtreye ve diğer ucundaki üç milimetrelik silikon tüpe takın. Sıvı aspire etmek için üç milimetrelik silikon tüpserbest ucuna bir milimetrelik filtre ucu takın.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, ağız mikropipet ile sabit solucanlar bir pelet etrafında mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın. Hızlı bir şekilde tüpün altına montaj orta 10 mikrolitre ekleyin. Solucanların plastik pipet ucunun kenarlarına yapışmasını önlemek için PBS'de 10 mikrolitrelik bir ucu deterjan izleriyle durulayın.
Sonra bir makas ile ucun ucunu kesin. Solucanlar ile sekiz mikrolitre montaj ortamını önceden hazırlanmış bir agarose pedin üzerine aktarın. Mikroskop altında slayt gözlemlerken, yavaşça solucanların çakışmasını önlemek için çalkalayın.
Daha sonra agarose ped üzerinde montaj ortamı nın damlasını 18'e 18 milimetrelik bir kapak kaydırarak kapatın. Canlı solucanlar monte etmek için, pipet üç milimolar levamisole üç ila dört mikrolitre M9 bir agarose ped üzerine çözülmüş. Levamisole damla içine durum başına 30-50 solucanlar seçin.
Daha sonra damlayı 18'e 18 milimetrelik bir kapak la kaplayın ve solucanları bir saat içinde görüntüleyin. ImageJ'den açık kaynak görüntü analizi yazılım paketi Fiji'yi yükleyin veya bilgisayara zaten yüklenmişse, sürüm 1.52A veya daha sonra olduğunu doğrulayın, ardından Worm-align deposunu GitHub'dan indirin ve bilgisayara kaydedin. Tüm boru hattı bileşenleri indirilip yüklendikten sonra Fiji'yi açın ve eklentileri, makroları tıklatarak Worm-align makroyu çalıştırın ve ana menü çubuğunda çalıştırın.
Solucan hizasını bulun. ijm script ve açık tıklayın. Analiz edilecek resimlerle giriş klasörüne gidin ve seç'i tıklatın ve seçili klasörün yalnızca resim dosyaları içerdiğinden emin olun.
Makro, tüm sonuçların kaydedilen bir çıktı klasörü otomatik olarak oluşturur. Klasörün adı, post-fix olarak çıktısı olan giriş klasörüyle aynı olacaktır. Makronun giriş klasöründeki ilk görüntüyü açmasına ve solucanların genişliği, parlaklık ve kontrast da dahil olmak üzere montajı oluşturmak için gereken ayarları ayıklamak için temsili bir görüntü olarak kullanmasına izin verin.
Düz çizgi çizim aracını kullanarak, solucan genişliği boyunca bir çizgi çizin ve Tamam'ı tıklatın. Tek solucanlar için kırpılan bölgelerin yüksekliğini belirlemek için bu satırın uzunluğunu kullanın. Her kanal için, adı, arama tablosunu ve montaja dahil edilip edilmemesigerektiğini belirtin, ardından Tamam'ı tıklatın. Ardından, kaydırıcıları kullanarak kanalların parlaklık ve kontrast ayarlarını ayarlayın. Kalan kanallar için bu işlemi yineleyin.
Tüm ayarlar yapılandırıldıktan sonra, ayarlar tablosuna kaydedilir ve çıktı klasörünün CellProfiler alt klasörüne kaydedilir. Ayarlar uygulamasından sonra tüm görüntülerin nasıl görüneceğini göstermek için bir görüntü oluşturulur. Görüntü tatmin ediciyse, üst kutuyu işaretleyin.
Tüm ayarlar panelinin ikinci ve üçüncü kutusunda montaj oluşturma seçeneklerini belirtir. Her iki kutuyu da işaretli bırakın ve makronun geri kalanını yürütmek için Tamam'ı tıklatın. Üst kutuyu işaretlememek makronun kurulumu yeniden çalıştırmasına neden olur.
Makro daha sonra giriş klasöründeki tüm görüntüleri açmaya devam eder. Her görüntü için, parçalı veya serbest çizgi aracı kullanılarak montaja dahil edilecek tüm solucanların uzunlamasına eksenine çizgiler çizin. Solucanların tam uzunluğu boyunca sürekli olarak baştan başa veya tam tersi çizgiler çizin ve Her satırı Denetim T.'yi tıklatarak YG yöneticisine ekleyin.İstenilen tüm solucanlar eklendikten sonra Tamam'ı tıklatın. Solucan hizalama daha sonra, çıktı klasörünün tek solucan alt klasörüne kaydedilecek olan tek seçili solucanların kırpılmış görüntülerini oluşturur.
Seçilen tüm solucanların montajları hizalanmış klasöre kaydedilir. Download sayfasında önceki CellProfiler sürümleri için bağlantıyı tıklayarak ve gerekli işletim sistemini seçerek CellProfiler 2.2.0'ı indirin ve kurun. Worm_CP ardışık Worm_CP başlatmadan önce, beklenen tüm çıktı görüntülerinin Worm-align çıktı klasörünün CellProfiler alt klasöründe bulunduğundan emin olun.
Özgün görüntünün işlenmiş bir kopyası, solucan popülasyonunun ikili görüntü maskesi, seçili solucanlar üzerinde çizgi çizilirse maskeyi hizala ve orijinal görüntüdeki kanalların her birini temsil eden bir görüntü bulunmalıdır. CellProfiler'ı açın, ardından görüntüler giriş modülüne tıklayın ve CellProfiler modülü klasörünü burada dosya ve klasörleri bırak yazan pencereye sürükleyin. Önceki bir çözümlemeden bir resim listesi varsa, önce pencereye sağ tıklayarak ve dosya listesini temizleyerek bunları kaldırın.
Meta veri giriş modülüne ve ikinci çıkarma yöntemine tıklayın, sarı klasöre tıklayın ve Worm-align çıktı klasörünün CellProfiler alt klasörüne gidin. Ayarlar dosyasını seçin ve ardından güncelleştirmeyi tıklatın. Ardından, adlar ve tür giriş modülü ne tıklayın ve boru hattı için gerekli tüm görüntülerin mevcut olduğundan emin olun.
Ardışık hattı çalıştırmadan önce, çıktı modülündeki çıktı sonuçları için bir hedef seçin. Başlat test modunu tıklatarak ardışık yapının nasıl performans gösterdiğini görmek ve klasördeki ilk görüntüde çalışmasına izin vermek için test modunu kullanın. Boru hattının performansından memnun olduğunuzda, çıkış test moduna tıklayın ve görüntüleri analiz edin.
Analize başlamadan önce, analiz modülüönündeki tüm gözlerin kapalı olduğundan emin olun. Çözümleme tamamlandığında, iki CSV dosyası, solucanlar CSV ve CSV satırlarıoluşan Worm_CP çıktı klasörünü açın. Bu protokolde açıklanan yönteme göre C.elegans'ın kültürlenmesi ve görüntülenmesi solucan popülasyonlarının büyük genel bakış görüntülerini üretir.
Boru hattının çıkışı büyük ölçüde görüntülerin üzerine çizilen çizgilerin kalitesine bağlıdır. Worm-align'dan birkaç satır örneği ve çıktıları burada gösterilmiştir. Worm-align komut dosyası kullanılırken, kesişen solucanların görsel tanımlaması, veri alt klasöründe bulunan bindirme görüntülerinden ve montajdaki tek tek solucan panellerinden mümkündür.
QC tablosu, çakışan solucanları tanımlamak için de kullanılabilir. Ancak, kesişen çizgiler Worm_CP boru hattı için sorunludur. Bunun nedeni, Worm_CP tek tek solucanları belirlemeye yardımcı olmak için ilgi alanları değil, satır maskesi kullanmasıdır.
Bu nedenle, CellProfiler solucanlardan birini iki nesne olarak bölümlere ayıracaktır. Worm_CP boru hattı lipid damlacıkları içine dahil bir floresan boya ile etiketlenmiş sabit hayvanlardan floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılmıştır. Lipid damlacık içeriği, elle ölçülen yabani tip ve mutant DBL1 hayvanları arasında %17, Worm_CP boru hattı kullanılarak %12 oranında azalır.
Worm_CP aynı zamanda gfp'yi ısı şoku indükleyici genin kontrolü altında ifade eden canlı solucanlarda ısı şoku tepkisini ölçmek için de kullanıldı. Isı stresi yokluğunda, solucanlar GFP ifadesini tetiklemedi. Solucanlar kısa ısı şoku olarak maruz kaldığında, GFP ifadesi indüklenir.
Worm_CP çıktısı büyük ölçüde Worm-align kullanarak çizdiğiniz çizgilerin kalitesine bağlıdır. Çizgilerinizin dokunmadığından veya çakışmadığından emin olun ve tüm çizgilerinizi aynı yöne çizin. QC tablosunu denetlemek, bu durumları çözümlemenizden çıkarabilmeniz için dokunan veya çakışan satırları belirlemenize yardımcı olabilir.
Worm-align çıktısı, Fiji'de veya diğer görüntü analizi yazılım paketlerinde sonraki niceleme için kullanılabilir. Burada, örneğin lipid damlacıklarının sayısını saymak veya solucan içindeki tek tek damlacıkların yoğunluğunu ölçmek için diğer analiz modüllerinin kolayca dahil edilebildiği çok temel bir CellProfiler boru hattı gösterdik. Bu tekniğin avantajlarından biri de tek tek solucanlardan gelen floresanları hızla ölçme olasılığıdır.
Laboratuvarımızda floresan muhabirlerini kullanarak bireysel canlılığa ilgi görüyoruz ve bu amaç için Worm-align ve Worm_CP rutin olarak kullanıyoruz.
