Bu araştırma hibe PHY-1205494 aracılığıyla Ulusal Bilim Vakfı ve MCB-1413134 (EL) ve Ulusal Araştırma Vakfı Kore grant 2017R1D1A1B03035671 tarafından desteklenmiştir (KSL).

İletişim kuralı aşağıdaki WormSpa5, daha önce açıklanan mikrosıvısal aygıt Worms boyuna görüntüleme için kullanır. WormSpa (istek üzerine yazarlardan elde CAD dosyaları ile başlayan) imalatı basit ama bazı uzmanlık gerektirir. Çoğu durumda, imalat kolayca bir çekirdek tesis veya gibi hizmetler sağlar ticari bir şirket tarafından yapılabilir. Cihaz imalatı, belgili tanımlık şekil yüksekliği 50 µm olduğunu belirtmek emin olun.
1. deneysel Kur
<ol><li>Motorlu bir sahne ile bir ters Floresans mikroskobu mikrosıvısal aygıt bağlama.</li>
	<li>Orbital Çalkalayıcı mikroskop yakın yerde ama titreşim shaker dan mikroskop doğrudan etkilemez emin olun. Örneğin, görme duyusuyla ilgili tablo ile hiçbir temas yapar bir duvar üzerinde sabit bir raf shaker koymak.</li>
	<li>Bir şırınga pompa üzerinde orbital Çalkalayıcı yerleştirin. Sallayarak süre Jikleyi değil shaker pompa teyp.</li>
</ol>2. mikrosıvısal ortamı hazırlanması
Not: deneme sırasında dört şırınga mikrosıvısal aygıt yolu ile şırınga tüpler, şekil 1' de belirtildiği gibi bağlanır. Bu adımı bu şırınga hazırlanması açıklar. Aksi takdirde mezkur onları gergin yapmadan şırınga tüpler olabildiğince kısa tutmak.
<ol><li>Bir çıkış şırınga ve bir şırınga tüp hazırlayın. Bu şırınga ( şekil 1' deki S1) daha sonra olacak şırınga tüpünden cihazın çıkışına bağlı ve sıvı cihazınızdan geçici depolama için kullanılır.<ol>
<li>Bir bağdaştırıcı iğne sadece iğne (metal parça) tutmak bir 20 G x 1/2 inç şırınga ucu plastik parçaları kaldırarak olun. Plastik ve metal parçalar pense ile tutarak ve onları ayrı çekerek bunu. İğne üzerinde kalan plastik kalıntı Bunsen burner ile ebilmek yanmak.</li>
		<li>Deneysel Kur geometrisini göre iğne pense ile iki uçlarından tutarak viraj. Burada açıklanan tasarımında ortasından iğnede ~ 110 ° açı için bükme en uygundur.</li>
		<li>Bağdaştırıcı iğne yarım tüp içine takın. Diğer yarısı daha sonra cihazın içine takılı. Şırınga tüp bir sızıntı (örneğin, boru 0,86 mm iç çap ve 1.32 mm dış çapı ile) olmadan bir 20 G şırınga ucu ile uyumlu olmalıdır. Önerilen boru uzunluğu ~ 50 cm'dir.</li>
		<li>Bir 10 mL radarı-kilit şırınga şırınga tüp 20 G x 1/2 inç şırınga ucu üzerinden (açık) diğer ucunu bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arabellek girişi şırınga hazırlamak ve tüpler şırınga. Bu şırınga biri ( şekil 1' deki S2) için goes içine belgili tanımlık aygıt ve enjeksiyon akışını kontrol etmek için sıvı su deposu olarak kullanılır. Diğer şırınga (S3 şekil 1' deki) adım 3.2 açıklandığı gibi arabellek alışverişi için gerekli.<ol>
<li>Bir 10 mL radarı-kilit şırınga (S2) doğrudan bir 3-yollu vana bağlanmak ve bir şırınga tüp (şekil 1) ile aynı Vana başka bir şırınga (S3) bağlanmak: S3 tüp bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak ve tüp valf başka bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak. Not: Bu malzemelerin bağlandığı sırası önemli değil.</li>
		<li>Bir şırınga tüp 3-yollu vana kalan bağlantı noktasına bağlayın. Adım 2.1.2 olduğu gibi başka bir bağdaştırıcı iğne hazırlamak ve yarım iğne şırınga tüp (açık) diğer ucunu takın.</li>
		<li>Adım 2.2.2 ve S2 şırınga tüp bağlı S3 kapalı iken kapak ayarlayın (şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir solucan-giriş şırınga ve bir şırınga tüp hazırlayın. Bu şırınga (S4 şekil 1' deki) solucanlar cihazın içine yüklemek için kullanılır.<ol>
<li>Bir uzun şırınga tüp 10 mL radarı-kilit şırınga (S4) bağlayın. Bu yükleme için kullanılacak olan sıvı hacmi tüpünden belirlemek; Örneğin, 100 cm hortumunun üzerinde 2 mL sıvı destekler (Ayrıca, bkz: adım 4.2).</li>
		<li>Adım 2.1.2 olduğu gibi başka bir bağdaştırıcı iğne hazırlamak ve ayaklardan biri iğne şırınga tüp diğer (açık) sonuna yarısı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırıngalar ve boru S-Orta12 ile iki kez yıkayın. Şırıngaları ve tüpler S-Orta tüm hava kabarcıkları kaldırmak için dikkat çekici doldurun.</li>
	<li>Çıkış şırınga tüp cihazı prize bağlayın.<ol>
<li>Bağdaştırıcı iğne şırınga tüp çıkış bağlantı noktasına sonunda takın.</li>
		<li>Küçük bir S-Orta arabellek giriş ve solucan giriş dışarı gelene kadar aygıt, doldurmak için çıkış S-orta küçük bir birim enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arabellek girişi şırınga tüp solucan-giriş (1/32-inç çapında paslanmaz çelik dübel PIN) PIN'i ile tıkalı ise cihazın tampon-giriş bağlantı noktasına bağlayın.</li>
	<li>Sürekli bir akış arabellek cihazın içine enjekte. Bir şırınga pompa13üzerine tampon-giriş şırınga S2 yük ve S2 ortamda sürekli bir akış hızı 3 µL/dk at cihaz içine enjekte edilir pompa ayarlayın.</li>
</ol>3. yükleme bakteri içine mikrosıvısal aygıt
<ol><li>S-Orta12' askıya Escherichia coli OP50 hazırlayın.<ol>
<li>Standart bir protokol, bir 250 mL şişe 50 mL LB ve bir koloni ile aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Gecede kültür 4000 devirde 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet 30 mL S-Orta resuspend.</li>
		<li>Süspansiyon 5 mikron şırınga filtre ile filtre. 600 optik yoğunluğu tarafından bakteri konsantrasyonu ölçmek nm (OD600) ve 3 bir OD600 konsantrasyonu ayarlayın. Bu yüksek yoğunluklu kurtlar besili tutmak için gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OP50 süspansiyon aygıtla arabellekte değişimi.<ol>
<li>Temiz bir şırınga (S5) OP50 süspansiyon ile dolu hazırlayın. Şırınga dikey tutun ve üstündeki tüm hava baloncuklar toplamak için birkaç kez dokunun.</li>
		<li>3-yollu vana aygıtına bağlantıyı kapatmak için arabellek giriş şırıngaların açın ve iki şırınga, S2 ve S3 bağlayın. S2 şırınga pompa devreden çıkar.</li>
		<li>S2 Vana dan çıkarıp S5 kapak için takın. Biraz OP50 arabellek S3 gidene S5 üst kısmında S3 için vana toplanan tüm hava dışarı itin. Bunu yaparken, hiçbir hava kabarcığı S5 veya kapak kalır emin olun.</li>
		<li>3-yollu vana S3 ve S5 arasındaki bağlantıyı kapatmak ve S5 cihaza iletişime geçmek için yeniden orijinal konumuna gelmek. S5 şırınga pompa yükleyin. Pompa tutan orbital Çalkalayıcı üzerinde açın. Yaklaşık 200 rpm sallama hızını ayarlar.</li>
		<li>100 µL/dk'ya olmak akış hızını ayarlayın. İçinde belgili tanımlık aygıt solucanlar ulaşması için yeni tampon için gereken zaman arabellek giriş şırınga tüp (yaklaşık 5 dakika yukarıda açıklanan boru ile) uzunluğunu bağlıdır. Daha hızlı bir tampon değişimi gerekli ise bir daha yüksek akış hızı istihdam edilebilir.</li>
		<li>Bir kez OP50 arabellek cihazın yayılır, akış hızı 3 µL/dak için geri ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yükleme solucanlar mikrosıvısal cihazın içine
<ol><li>Bir küçük düşük bağlama microcentrifuge tüp (650 µL) hazırlamak ve OP50 süspansiyon 100 µL ile doldurun. Çevresinde transferi tek solucan ile seçerek (46 saat sonrası L1 larva tutuklama 25 ° C'de) Yetişkin solucanlar bir NGM (nematodunun büyüme orta) agar plaka tüp almak 20-30 yaş senkronize genç. Yaş-eşitleme standart protokol12yapılabilir.</li>
	<li>Solucan-giriş doldurmak şırınga ve şırınga tüp (S4 şekil 1' deki) OP50 süspansiyon ile. ~ 500 µL sıvının Kurtlarla microcentrifuge tüp içine enjekte. Süspansiyon ile solucanlar solucan-giriş şırınga tüp içine çizin. Şırınga tüp yeterince uzun olduğundan emin olun (> 1 m) ve çizilmiş solucanlar şırınga tüp içinde kalmak ve yapmak değil yapmak şırınga S4 sonuna kadar.</li>
	<li>S4 solucan-koya bağlayın. Tüm solucanlar solucan-giriş şırınga tüp mikrosıvısal cihazın içine enjekte. S4 ve şırınga tüp çıkarın. Solucan-giriş bir iğne ile takın.</li>
	<li>S2 arabellek giriş şırıngadan mekanik pompa ( Resim 1) kapatın ve el ile S1 ve S2 tüm solucanlar ayrı kanal içine itmek için kontrol edin. S1 basmak onları ters yönde ilerlemeye neden olur iken S2 basmak solucanlar kanallarına ilerlemeye neden olur. Bir kanal yüklendikten sonra solucan her kanaldaki diğer solucanları girişini engeller.</li>
	<li>Solucanlar 2-3 saat için yeni ortamına ayarlamak izin.</li>
</ol>5. bir görüntüleme Protokolü kurma
<ol><li>Güvenli belgili tanımlık aygıt içinde yer alan tüm solucanlar bulmak ve her-in onları içinde senin mikroskop denetler görüntü edinme yazılım için bir görüntüleme konumu ayarlayın. Unutmayın bazı durumlarda (örneğin daha yüksek büyütme istendiğinde veya fotoğraf makinesi ile daha küçük bir CCD sensör kullanırken) birden çok görüntüleme pozisyonlar her kanal için gereklidir. Not: Bu el ile yapılabilir iken, bazı satın alma yazılım paketleri görüntüleri nereden alınacağını konumlarını listeleyen bir metin dosyası yükleyebilirsiniz. Bu pozisyonlar düzenli olarak WormSpa içinde sıralanır beri bir kullanıcı (Örneğin, Python veya ticari yazılım) otomatik olarak böyle bir liste oluşturduğu küçük bir betik yazabilirsiniz. Bu komut dosyası hassas biçimi edinme yazılım (bakınız ek malzeme 1örnekte bir) tarafından beklenen dosya biçimi bağlıdır.</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme gerekli sıklığını ayarlayın. Örneğin, görüntüleme bağışıklık gen yanıt enfeksiyon kare başına 10 dakika bir frekansta yapılır. Tüm gerekli kanal (örneğin parlak alan ve GFP floresan) her zaman noktasında iktisap emin olun.</li>
</ol>6. ana bilgisayar yanıt Pseudomonas enfeksiyon
Not: Bu ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim için belirli bir adımdır. Alternatif olarak, bir faiz (biyotik ve abiyotik stres, ilaçlar, sinyal molekülleri, vb) diğer çevre ipuçları içeren bir arabellek hazırlayabilirsiniz.
<ol><li>SK-orta14' te askıya Pseudomonas aeruginosa PA14 hazırlayın.<ol>
<li>50 mL LB ve bir koloni ile 250 mL şişe aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Başka bir 250 mL şişe 50 mL lb ve bir aliquot kültür aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Gecede kültür 4000 devirde 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet 10 mL SK-orta resuspend. Bakteri konsantrasyonu ölçümü ve konsantrasyon OD600 ayarlamak = 4.</li>
		<li>Süspansiyon için temiz bir şişeye aktarmak ve 24 saattir 37 ° c ve 25 ° c sallayarak süre başka bir 24 saat kuluçkaya. Bu adımı tahlil14öldürme standart plaka-kuluçka adımda taklit eder.</li>
		<li>Süspansiyon 5 mikron şırınga filtre ile filtre. Bu cihazın tıkanma bakteriyel toplamları önlemektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihazın OP50 süspansiyon aşağıdaki adım 3.2 olduğu gibi aynı yordamı PA14 süspansiyon ile değiştirin. 10 saat için Imaging tutmak.</li>
</ol>

<ol><li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+to+changing+environments%3A+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li>
<li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+gene+expression+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+Streamlining+discovery+in+worm+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670(2017).</li>
<li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-enabled+phenotyping%2C+imaging%2C+and+screening+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862(2016).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221(2017).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sisweb.com/lc/new-era-ne1000.htm">NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps</a>. , New Era Pump Systems Inc. (2017).</li>
<li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183(2006).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
<li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li>
<li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li>
<li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li>
<li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345(2013).</li>
<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19997/">C. elegans II</a>. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li>
<li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mikrosıvısal araçları solucanlar eğitim birden çok yarar sağlar. Bir PDMS görüntüleme aygıt standart NGM agar plaka ile karşılaştırıldığında daha yüksek görüntü kalitesi sunar. Birden çok görüntüyü hangi hayvanlar plaka aldı ve mikroskop slayt görüntüleme için monte geleneksel yöntemler aksine tek bir solucan alınabilir. Buna ek olarak, solucanlar bulunduğu microenvironment sabit veya istediğiniz ortamı bileşimi ve hayvanların yanıt arasındaki eşlemeyi kesin izin kadar modüle tutulabilir.
Burada nasıl bir özel mikrosıvısal aygıtı (WormSpa) kullanarak fırsatçı patojen P. aeruginosa PA14 için birden çok bireysel solucanlar yanıt Imaging tarafından ana bilgisayar yanıt bakteriyel enfeksiyon boyuna bir ölçüm gerçekleştirileceği gösterilmiştir. Alan parlak ve floresan görüntüleri, birden çok kez devam eden deney perturbing olmadan alındı. Özellikle, yumurta döşeme ve IRG-1 gen ekspresyonu Kinetik her 10 dakikada bir, zamansal çözünürlük geleneksel yöntemleri14,15üzerinde önemli bir artış probed.
Bu cihazda herhangi bir zamanda her solucan kaydedilmiş konumunu yeniden ziyaret etme birden çok Worms boyuna ölçümleri gerçekleştirilebilir. Bu rakamlar 2C ve 3Bnerede biz ölçmek IRG-1, gösterilmiştir:: GFP Floresans ve yumurta koydu bireysel solucanlar tarafından. Bu rakamlar solucanlar Kinetik profilleri çok çeşitli ekran göster. Daha önce gösterildiği gibi tek hücreli çalışmalar19,20,21, bu bireysellik tasarım genetik devreleri yanı sıra farklı yolları19, arasındaki ilişkiyi anlamak için kullanılabilir 22.
Başarılı deneyler için solucanlar mikrosıvısal cihazın içine hızlı bir şekilde yüklemek için önemlidir. Solucanlar agar yüzeyinde tarama, sıvı ortamda thrash eğilimindedir ve bu davranış AMP aktive protein kinaz dahil23,24olan genetik bir program neden olmaktadır. Bu istenmeyen pertürbasyon en aza indirmek için katı yüzey taklit eden bir ortam Kurtlarla microstructures odası ve PDMS hava geçirgenliği sağlamak gibi solucanlar ayrı kendi odasında hızlı bir şekilde yerleştirmek önemlidir. 5 yüksek basınç uygulayarak yükleme solucanlar daha hızlı yardımcı olur rağmen cihazın çok fazla bastırmayın solucanlar mekanik stres neden. Ciddi bir şekilde vurguladı solucanlar içinde açıkça gözlemlenebilir torbalama fenotip25kaynaklanan değil yem veya yatıyordu yumurta yapar. Yükledikten sonra solucanlar 2-3 saat için solucanlar mikrosıvısal çevreye ayarlamak izin ve araştırmacı hayvanlar gözlemlemek ve bu da zarar görmüş atmak için bir fırsat sağlayarak, E. coli OP50 beslenir.
Boyutu ve microstructures her odasında aralığını L1 tutuklama 25 ° C'de 46 Saat yetiştirilen solucanlar için optimize edilmiştir Yapıların büyük solucanlar çalışmaya ölçekli ya da boyut olarak daha küçük olan L4 larva incelemek için azaltılmış. Ancak, solucanlar odasında çalışma sonrası embriyonik gelişme bu cihazın çağrısı başarıyla tüy dökme mümkün değildir. Bu tür uygulamalar için WorMotel26 gibi yöntemler kabul edilebilir. Beri solucanlar sınırlı ama WormSpa içinde hareketsiz değil, başarılı bir dayanıklı Deney hayvanları odasında kalmak üstünde bağlıdır. Biz bu aşamasındaki larva, erkek yetişkin ve bazı hermafrodit mutantlar zor olabilir bulmak.
Bir tek Arabellek girişi (üst şekil 1merkezinde) kullanmak yerine, iki baş aşağı balon şeklinde alıcılar aynı anda kullanılabilir. İki şırınga ile farklı arabellekleri doldurma, bir başka zamanda farklı şırınga basarak geçici yapılandırılmış ortamlar oluşturabilirsiniz. Bu, örneğin, çalışma ortamı değiştirme için uyum sağlar. 27 , 28
Yukarıda belirtildiği gibi burada açıklanan mikrosıvısal cihaz çok çeşitli diğer uygulamalar için kullanılabilir. Bu yanıt için diğer çevre ipuçları eğitim içerir. Böyle yanıt gen ekspresyonu ve yumurta atarken değişiklikleri içerebilir davranışları, burada, ama aynı zamanda metabolizması ve yağ birikimi (örneğin yağ Nil kırmızı ile boyama yoluyla), değişimler nöronal fizyolojisi ve (örneğin tarafından sinyal olarak Kalsiyum tedirginlikler) görüntüleme ve optogenetic, pompalama, dışkılama ve kafa hareketi (yolu ile hızlandırılmış dizileri otomatik nicel görüntüleme) ve diğerleri gibi motor davranış değişiklikleri.
Son olarak, bu yaklaşım büyük ölçüde otomatik olarak gerçekleşir ve birçok saat içinde uzun deneyler için gerekli işçi azaltır bile gün. Bir kez bireysel solucanlar konumlarını veri toplama yazılımı içinde kaydedilir, mekanik pompa denetleyicisi arabellek sabit akı cihazın içine korur sırada deneme görüntülerin otomatik kaydı oluşur. Önemlisi, uydurma bir WormSpa cihazın herhangi bir fazla standart yumuşak litografi Protokolü gerektirmez ve kendi tasarım ve işletme kadar basittir havacilik Hayır önceki deneyim ile araştırmacılar için bile. Çeşitli yukarıda açıklanan avantaj ve nispeten basit hazırlık adımları ile bu yaklaşım tam kontrollü şartlar altında canlı solucanlar boyuna ölçümü düşünüyorsanız olanlar için yararlı olabilir.

Çevre koşulları değişiklikler genetik programlar indüksiyon ve baskı belirli genler1,2ifadenin eşliğinde aktivasyonu neden olabilir. Bu kinetik değişiklikler doku aynı hayvanlarda ve farklı hayvanlar arasında arasında değişken olabilir. Çalışmalar genetik gibi programlar bu nedenle bireysel hayvanların boyuna görüntüleme izin ve çevre koşulları hassas dinamik kontrol sağlar yöntemler için ara.
Son yıllarda, microfabricated sıvı aygıtlar yanıt ve davranış küçük hayvanlarda, solucanlar, sinekler, su ayılar ve daha fazla3,4,5,6de dahil olmak üzere birçok açıdan incelemek için kullanılmıştır, 7. Uygulamalar içerir, örneğin, derin fenotipleme, kimyasal uyaranlara yanıt olarak nöronal aktivite kayıt ve hareket ve pompa8,9,10 gibi motor davranışların optogenetic , 11.
Yanıt-e doğru yerel microenvironment, bakım sağlayan esnek tasarım hassas dinamik kontrol dahil olmak üzere, çevre yardımlar uzun vadeli uzunlamasına görüntüleme faydalı olacağını pek çok özellik mikrosıvısal tabanlı yaklaşımlar tutun bireysel hayvanlar ayrı üç aylık dönemler ve görüntüleme için olumlu nitelikleri. Ancak, onların iyi varlıklar üzerinde en az yan etki ile uzun bir süre bir mikrosıvısal odası hayvanlarda Bakımı mikrosıvısal cihazın tasarımının yanı sıra deneme yürütülmesi özel dikkat gerektirir bir meydan okumadır.
Burada WormSpa, bir mikrosıvısal aygıt Caenorhabditis elegansboyuna görüntüleme için kullanımını göstermektedir. 5 bireysel solucanlar odasında sınırlı. Sıvı ve bakteriyel süspansiyon sürekli bir düşük akış garanti eder iyi beslenmiş ve iyi bir sağlık bakımı ve stresi hafifletmek için yeterince aktif solucanlar ve yumurtalarını bırakmak solucanlar odaları yapısını sağlar. Tasarımın sadeliği ve WormSpa işletme araştırmacılar ile hayır önceki deneyim havacilik bu cihaz kendi araştırma planları dahil etmek için izin vermelidir.

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>An inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.034&amp;rdquo; (0.86 mm) I.D. x 0.052&amp;rdquo; (1.32 mm) O.D</td></tr><tr><td>Syringe Tip</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 Gauge x 1/2&amp;rdquo; blunt tip stainless steel canula</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL Male Luer Lock Syringe</td></tr><tr><td>3 Way Valve</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile</td></tr><tr><td>Dowel Pin</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32&quot; Dia. x 1/2&quot; Lg.)</td></tr><tr><td>Low Binding Microcentrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans

Son on yılda, mikrosıvısal teknikleri küçük hayvanlar Caenorhabditis elegans, Yuvarlak solucanlar da dahil olmak üzere, çalışma için başvuran ve uygun bir canlı görüntüleme platformu için hassas kontrol sağlar yararlı kanıtladık deneysel koşullar içinde gerçek zaman. Bu makalede, biz bireysel Worms WormSpa, daha önce yayımlanmış özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı. Belgili tanımlık yeteneklilik göstermek için biz solucan içinde belgili tanımlık aygıt patojen bakteri ile enfekte ve bağışıklık yanıtı genler ve yumurta atarken ifadesi dinamiklerini sürekli bireysel takip kanıt prensibi deneyler gerçekleştirilen hayvanlar. Basit tasarım ve işletme bu cihazın uygun mikrosıvısal tabanlı deneyleri ile önceki deneyimi olmayan kullanıcılar için yapmak. Önerdiğimiz bu yaklaşım pek çok araştırmacı iyi tanımlanmış koşullar altında biyolojik süreçlerin boyuna gözlemler ilgilenen yararlı olacaktır.

(46 saat sonrası L1 larva tutuklama 25 ° c)12 iletişim kuralında tanımlanan olarak cihazda yüklü yaş senkronize genç yetişkin solucanlar. Solucanlar ayrı ayrı ayrı kanalları, hayvanların yanıt patojeni boyuna ölçümü etkinleştirme yer. Deneme başarılı olduğunda, Solucanların çoğu onların kanallarında deneme süresince kalır. Bu durumda, bireysel solucanlar görüntülerini aktif olarak hayvan bulma gereksinimini kaçınarak görüntüleme yolundaki onların kanal yerleştirerek alınır. Resim 2 A aygıt 10 saat boyunca tek temsilcisi solucan alan parlak görüntüleri gösterir. Onlar taşıyabilirsiniz up - solucanlar onların kanal içinde sınırlı iken ve aşağı akım ve özgürce başlarını açabilirsiniz. Bu cihazın kendisi neden stres değil veya hayvanlara zarar güvence altına almak için önemlidir.
Biz yanıt Worms bakteriyel enfeksiyona P. aeruginosa, C. elegansen çok çalışılmış bakteriyel patojenler biri tarafından izlenir. Kistik fibrozis ve immün hastalarda enfeksiyon yol açan insan bir fırsatçı patojen da sağlar. Solucanlar gibi klinik PA14, ölümcül bağırsak enfeksiyonu, yol açar yalıtmak ve virülans faktörleri bu sürecine memeli ev sahibi enfeksiyonunda da karıştığı P. aeruginosa, belirli suşları ile besleme. 14 , 15
Gen ifadesinin bakteriyel enfeksiyon sırasında değişiklikleri paterni incelemek için floresan gazetecilere istihdam edilebilir. Dinamik yanıt enfeksiyon görüntülemek birçok genler arasında biz GFP Floresans transgenik solucanlar IRG-1::GFP ifade üzerinden görüntüleme tarafından IRG-1 (enfeksiyon yanıt gene 1), transkripsiyon yanıt izlenir (AU0133 [agIs17 () PIRG-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], Ausubel Laboratuarı'ndan elde edilen). IRG-1 güçlü enfekte hayvanların bağırsak enfeksiyonu erken aşamada P. aeruginosa PA14 tarafından indüklenen olduğu bilinmektedir. 16 , 17 Resim 2 B zaman atlamalı görüntüleri temsilcisi solucan ( Şekil 2Aolduğu gibi aynı hayvan) gösterir. Her floresan görüntü hemen karşılık gelen alan parlak görüntü sonra çekildi. İlk 5 saat sonrası enfeksiyonunda GFP Floresans sadece hafif artar Orta beden ve kuyruk. Sonra orta vücuttan başlayan Floresans önemli bir artış görülmektedir. Her solucan toplam Floresans Şekil 2saat sonrası enfeksiyon'cC bir fonksiyonu olarak çizilir. Bu veriler sadece IRG-1 PA14 enfeksiyon üzerine daha önce açıklanan indüksiyon, aynı zamanda zamanlaması ve ölçüde indüksiyon solucan solucan değişkenlik göstermektedir.
WormSpa mikrosıvısal aygıt tasarımını her bireysel solucan5tarafından atılmıştır yumurta toplamak filtreleri içerir. Yumurtadan sonra L1 larva filtre ve çıkış tüp içine yıkanır. Bu bize el ile bireysel solucan yumurta atarken Kinetik bakteriyel enfeksiyon sırasında izlemek izin. Zaman atlamalı görüntüleri olduğu gibi Resim 2 aynı solucan tarafından yumurta şekil 3' teAgösterilmektedir. Bu görüntüler doğru Şekil 2Akarşılık gelen alan parlak Albümdeki sonra alınmıştır. Her solucan tarafından atılmıştır yumurta toplam kaç saat sonrası şekil 3Benfeksiyonunda bir fonksiyonu olarak gösterilir ve ortalama ve standart sapma tüm popülasyonu üzerinde şekil 3' teCgösterilmektedir. Hayvan hayvan değişkenlik yanı sıra daha önce açıklanan düşüş yumurta atarken enfeksiyon ilerledikçe, bu veri yakalama. Buna ek olarak, yumurta atarken oranı kadar düşüş değil hastalık bulaşmamış tek hayvanlarda 25 ° C5,18, L1 doruklarına ~ 54 saat sonrası.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig1.jpg"> Resim 1: deneysel bir mikrosıvısal cihazın Worms canlı görüntüleme düzeninin. Solucanlar solucan girişcihazı içine yüklenir ve daha sonra ayrı kanal içine itilir. Bakteriyel süspansiyon arabellek giriş aygıtından içine bir orbital Çalkalayıcı monte mekanik pompa enjekte edilir. Arabellek çıkış bağlantı noktası üzerinden cihazın çıkar. Dört şırınga (S1, S2/S5, S3 ve S4) cihazı çalıştırmak için kullanılır. Kırmızı kesik çizgiler şırınga ve aygıt bağlama şırınga tüpler vardır. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/57348fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig2.jpg"> Resim 2: temsilcisi gen ifade Kinetik. Zaman atlamalı görüntüleri parlak-alan (A) ve (B) GFP Floresans mikroskobu tarafından alınan bir temsilcisi solucan. Sadece patojen tanıtıldı önce en soldaki görüntüleri alındı, en sağdaki görüntüleri alındı, ancak enfeksiyon PA14 tarafından 10 saat sonrası. 1 saat görüntüler arasında zaman aralığıdır. (C) toplam IRG-1saat ders:: bireysel solucanlar GFP floresan. Her satır için tek bir hayvan karşılık gelir. Satır ortalama Floresans azalan şekilde sıralanmış. Floresan yoğunluğu renk kodlu ve renk ölçeği sağ tarafta gösterilir. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/57348fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi yumurta atarken Kinetik. (A) zaman atlamalı görüntüleri Şekil 2A ve Bgösterilen aynı solucan tarafından yumurta sayısı. Sadece patojen tanıtıldı önce en soldaki görüntüleri alındı, en sağdaki görüntüleri alındı, ancak enfeksiyon PA14 tarafından 10 saat sonrası. 1 saat görüntüler arasında zaman aralığıdır. (B) zaman ders bireysel solucan yumurta sayısı. Her satır için tek bir hayvan karşılık gelir. Satır solucan koydu yumurta toplam sayısı azalan düzende sıralanır. Yumurta sayısı renk kodlu ve renk ölçeği sağ tarafta gösterilir. (C) yumurta ortalama sayısı bir fonksiyonu olarak solucan koydu. Gri alan ± bir standart sapma gösterir. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/57348fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplementary Material 1" src="/files/ftp_upload/57348/57348supfig.jpg"> Takıma giren madde 1: WormSpa aygıtı görüntüleme konumlarda bulunan tüm kanallar için içeren bir metin dosyası oluşturan bir örnek komut dosyası. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/Supp1.EditZeissTiles.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

Bu makalede, biz bireysel Worms özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı.

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

6.5K Görüntüleme.  Kongju National University. Bu makalede, biz bireysel Worms özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı.

Video: A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Biyomühendislik

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Gelişim Biyolojisi

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Nörobilim

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biyoloji

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Için basit Mikroakışkan Cihazlar

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis