Мы описываем здесь простой рабочий процесс на основе открытого источника на Фиджи под названием Worm-align, который может быть использован для создания одиночных или многоканаправленных монтажей выпрямленных червей, представляющих интерес из необработанных изображений микроскопии. Поскольку этот рабочий процесс зависит от выбранных пользователем животных, представляющих интерес, он может быть особенно полезен при анализе изображений с C.elegans, где черви не все на правильной стадии или состоянии. Следует отметить, что выход Червь-выравнивание может быть использован для последующей количественной оценки флуоресценции либо с Фиджи или другого программного обеспечения анализа изображений.
Здесь мы демонстрируем количественную оценку флуоресценции с помощью трубопровода CellProfiler Worm_CP. Начните с создания микропипюты для рта, расширяя тонкую стеклянную капиллярную камеру в пламени горелки Bunsen. После расширения в пламени, разбить капилляр на две части, если он не разбить на две части после расширения.
Если он разбился на две части, разрежьте конец самого длинного. Выберите более длинный кусок и проверить, является ли капилляр открыт, пытаясь аспирировать воду. Отсоедините адаптер от трехмиллиметровой силиконовой трубки.
Подключите стеклянный капилляр к капилляру, связанному с шестимиллиметровой силиконовой трубкой. Затем подключите другой конец шестимиллиметровой трубки к фильтру диаметром 0,2 микрометра и трехмиллиметровой силиконовой трубке на другом ее конце. Подключите один миллиметровый кончик фильтра в свободный конец трехмиллиметровой силиконовой трубки, чтобы аспирировать жидкость.
Под микроскопом вскрытия удалите как можно больше жидкости вокруг гранулы фиксированных червей с микропипютом рта. Быстро добавьте 10 микролитров монтажной среды на дно трубки. Промыть 10 микролитер отзыв в PBS со следами моющего средства, чтобы предотвратить червей от прилипания к бокам пластиковой наконечник пипетки.
Затем вырежьте самый конец кончика ножницами. Перенесите восемь микролитров монтажной среды с червями на ранее подготовленную агарозную площадку. Наблюдая за слайдом под микроскопом, осторожно агитировать его, чтобы избежать перекрытия червей.
Затем накройте каплю монтажной среды на агарозной площадке крышкой 18 на 18 миллиметров. Чтобы смонтировать живых червей, пипетка от трех до четырех микролитров из трех миллимолейных левамизола растворяется в M9 на агарозной площадке. Выберите от 30 до 50 червей в состоянии в каплю левамизола.
Затем накройте каплю крышкой 18 на 18 миллиметров и изображения червей в течение одного часа. Установите пакет программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом Fiji от ImageJ, или если он уже установлен на компьютере, убедитесь, что это версия 1.52A или позже, затем загрузите репозиторий Worm-align с GitHub и сохраните его на компьютере. После загрузки и установки всех компонентов конвейера откройте Фиджи и выполните макрос Worm-align, нажав на плагины, макросы и запустите в главном баре меню.
Найдите червь-выравнивание. ijm скрипт и нажмите открытым. Перейдите к папке ввода с изображениями для анализа и нажмите выберите, убедившись, что выбранная папка содержит только файлы изображений.
Макрос автоматически генерирует папку вывода, где все результаты будут сохранены. Название папки будет таким же, как папка ввода с выходом в постфикса. Разрешить макрос, чтобы открыть первое изображение в папке ввода и использовать его в качестве репрезентативного изображения для извлечения параметров, необходимых для создания монтажа, в том числе ширина червей, яркость и контрастность.
Используя инструмент рисования прямой линии, нарисуйте линию по ширине червя и нажмите OK. Используйте длину этой линии, чтобы определить высоту обрезанных областей для одиночных червей. Для каждого канала укажите имя, таблицу осмотра и следует ли включить его в монтаж, а затем нажмите OK. Затем отрегулируйте настройки яркости и контрастности для каналов с помощью ползунков. Повторите этот процесс для остальных каналов.
Как только все настройки будут настроены, они будут записаны в таблице настроек и сохранены в подсвекателе CellProfiler папки вывода. Изображение генерируется, чтобы показать, как будут выглядеть все изображения после применения настроек. Если изображение является удовлетворительным, отметьте верхнюю коробку.
Во второй и третьей коробке проверки всех настроек панели указаны варианты генерации монтажа. Оставьте оба ящика галочкой и нажмите OK, чтобы выполнить остальную часть макроса. Неспособность поставить галочку в верхней коробке приведет к повторной настройке макроса.
Затем макрос открывает все изображения в папке ввода. Для каждого изображения, рисовать линии на продольной оси всех червей, которые будут включены в монтаж с помощью сегментированных или от руки линии инструмента. Нарисуйте линии последовательно с головы до хвоста или наоборот по всей длине червей и добавить каждую строку к менеджеру рентабельности инвестиций, нажав Control T.Once все желаемые черви были добавлены, нажмите OK. Червь выравнивания будет генерировать обрезанные изображения отдельных выбранных червей, которые будут сохранены в одном червь subfolder выходной папки.
Монтажи всех выбранных червей будут сохранены в выровненной папке. Скачать и установить CellProfiler 2.2.0, нажав на ссылку для предыдущих релизов CellProfiler на странице загрузки и выбрав необходимую операционную систему. Перед запуском Worm_CP конвейера убедитесь, что все ожидаемые выходные изображения присутствуют в субфолдере CellProfiler папки вывода Worm-align.
Обработанная копия исходного изображения, двойная маска изображения популяции червя, выравнивает маску, если линия нарисована на выбранных червях, и должно присутствовать одно изображение, представляющее каждый из каналов в исходном изображении. Откройте CellProfiler, затем нажмите на модуль ввода изображений и перетащите папку модуля CellProfiler в окно, в которое говорят файлы и папки. Если список изображений присутствует в предыдущем анализе, сначала удалите их, нажав правой кнопкой мыши в окне и выбрав четкий список файлов.
Нажмите на модуль ввода метаданных и на второй метод извлечения, нажмите на желтую папку и перейдите к подфолдеру CellProfiler папки вывода Worm-align. Выберите файл настроек, а затем нажмите обновление. Далее нажмите на модули ввода имен и типов и убедитесь, что все изображения, необходимые для конвейера, присутствуют.
Перед запуском конвейера выберите пункт назначения для вывода результатов в выходе модуля. Используйте тестовый режим, чтобы увидеть, как работает конвейер, нажав на тестовый режим запуска и дайте ему возможность пробежать через первое изображение в папке. Удовлетворив производительность конвейера, нажмите режим теста выхода и проанализируйте изображения.
Перед началом анализа убедитесь, что все глаза перед аналитическим модулем закрыты. Когда анализ завершен, откройте папку Worm_CP, которая состоит из двух файлов CSV, червей CSV и линий CSV. Культивирование и визуализация C.elegans в соответствии с методом, описанным в этом протоколе производит большие обзорные изображения популяций червей.
Выход трубопровода во многом зависит от качества линий, нарисованных поверх изображений. Здесь показаны несколько примеров строк и их выход из Worm-align. При использовании скрипта Worm-align визуальная идентификация пересекающихся червей возможна на основе изображений наложения, найденных в подфолдере данных, а также с панелей отдельных червей в монтаже.
Таблица КК также может быть использована для выявления перекрывающихся червей. Однако пересекающиеся линии являются проблематичными для Worm_CP трубопровода. Это потому, Worm_CP использует маску линии, а не области, представляющие интерес, чтобы помочь определить отдельных червей.
Таким образом, CellProfiler будет сегментировать один из червей, как два объекта. Трубопровод Worm_CP для количественной оценки интенсивности флуоресценции от фиксированных животных, помеченных флуоресцентным красителем, который включается в липидные капли. Содержание липидных капель снижается на 17% между диким типом и мутантами DBL1 животных с помощью ручной количественной оценки, и на 12% с помощью Worm_CP трубопровода.
Worm_CP был также использован для количественной оценки реакции теплового шока в живых червей, выражаюющих GFP под контролем теплового шока неодобоваемого гена. При отсутствии теплового стресса черви не вызывают экспрессии GFP. Когда черви подвергаются воздействию в качестве короткого теплового удара, GFP выражение индуцируется.
Выход этой Worm_CP во многом зависит от качества линий, которые вы рисуете с помощью Worm-align. Убедитесь, что ваши линии не касаются или перекрытия и сделать все ваши линии в одном направлении. Проверка таблицы КК может помочь вам определить линии, которые касаются или перекрываются, так что вы можете исключить эти случаи из анализа.
Выход Worm-align может быть использован для последующей количественной оценки либо на Фиджи, либо в других пакетах программного обеспечения для анализа изображений. Мы показали здесь очень простой трубопровод CellProfiler, в который можно было бы очень легко включить другие аналитические модули, например, для подсчета количества липидных капель или количественной оценки интенсивности отдельных капель внутри червя. Одним из преимуществ этого метода является возможность количественной оценки флуоресценции от отдельных червей быстро.
В нашей лаборатории, мы заинтересованы в индивидуальной жизнеспособности с помощью флуоресценции репортеров, и мы используем Червь выравнивания и Worm_CP регулярно для этой цели.
