Vücudumuz her gün 1 ila 10 milyar apoptotik hücre üretir. Bu hücrelerin verimli temizlenmesi hücre enkaz kaldırma ve stokların korunmasında yardımcı olur. Bu yöntem birçok uygulamada apoptotik hücre bağlanmasını ve diğer birçok fagositik hücre tipi tarafından yenmesini karakterize etmek için kullanılabilir.
Bu prosedürü gösteren Yuxuan Zhen, benim laboratuvarda kıdemli bir teknisyen olacaktır. Timositleri hasat etmek için, saf bir C57 siyah 6 farenin göğüs boşluğunu açtıktan sonra, timusu çıkarmak için kavisli ince uçlu forceps kullanın. RPMI 1640 Orta 10 mililitre içeren bir doku kültür çanak içine organ yerleştirin.
Tüm timusu iki mikroskop kaydırağının buzlu uçlarına karşı öğütün ve ortaya çıkan doku süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Santrifüj ile timositler toplamak ve 40 mililitre pelet resuspend. Sayma sonra, hücreleri tekrar santrifüj ve 50 mililitre tüp başına taze PBS 20 mililitre sekiz hücre ye kadar iki kez 10 kadar askıya.
Hücreleri tüp başına 20 mililitre PBS cinsinden beş mikromolar CFSE ile etiketlayın. Tüpleri karıştırmak için 2-3 kez ters oda sıcaklığında ışıktan korunan en fazla iki dakika timositler kuluçkadan önce. Kuluçka sonunda, ısı inaktive at serum 10 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
Sayım ve santrifüj için 40 mililitre taze PBS etiketli hücreleri yeniden askıya alın ve ardından 40 mililitre orta ile ilave bir yıkama. Orta yıkamadan sonra, doku kültürü orta konsantrasyon mililitre başına altı hücreye yedi kez 10 timositler resuspend ve 100 milimetre doku kültür çanak hücreleri tohum. Sonra bir mikromolar son konsantrasyonda hücre kültürüne staurosporine ekleyin ve dört saat boyunca bir doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin.
Periton makrofaj izolasyonu için, iki C57 siyah 6 fareintraperitoneally bir mililitre ile enjekte 3% yaşlı tiyoglikololat gün sıfır da periton rahatsız etmeden önce karın deri açmadan önce beşinci gün. Periton boşluğunu temizlemek için, 18 gauge iğneile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak 10 mililitrelik yıkama tamponunu yavaşça 50 mililitrelik bir tüpe toplama için azarlamadan önce boşluğa doğru hızla itin. Periton lavajını PBS ile iki kez yıkayın.
Periton makrofajlarını iki kez 10'da doku kültürü orta konsantrasyonunun mililitresi başına altı hücreye yeniden askıya alın. Sonraki tohum 24 kuyu plaka her kuyuiçine makrofajlar 500 mikrolitre ve iki saat boyunca bir doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka sonunda, yüzen hücreleri kaldırmak ve her kuyuya doku kültürü orta 500 mikrolitre eklemek için supernatant aspire.
Kültürün her kuyusuna 500 mikrolitre orta daki altı timosite 12 çarpı 10'a hemen sıfır ekleyin ve plakayı dört saat boyunca doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Kuluçka sonunda, herhangi bir serbest yüzen apoptotik hücreleri ve ardından boyama tampon ile tek bir yıkama kaldırmak için taze PBS ile her iki kez yıkayın. Sonraki etiket iyi başına uygun bir anti-CD11b antikor ile desteklenen boyama tampon 200 mikrolitre ile plaka bağlı makrofajlar ve 20 dakika boyunca dört derece santigrat plaka yerleştirin.
Bu temsili deneyde, tiyoglikolat uyarılmış periton makrofajlarının %30'a kadarı CFSE kanalında bu fagositlerin CFSE etiketli apoptotik hücreleri yutturduklarına dair olumlu bir sinyal göstermiştir. Cfse pozitif makrofajlar farklı yoğunluklara bağlı olarak sağ alt kadranda yayıldığı için apoptotik hücrelerin makrofaj yutma makrofajlarının mikroskobik gözlemi, tek tek makrofajlar içindeki apoptotik hücre sayısının farklı olduğunu gösterir. Apoptotik hücrelerin makrofajlara oranı nın artması sadece apoptotik hücreleri sindiren makrofajların sayısını artırmakla kalmamış, aynı zamanda makrofajların daha apoptotik hücreleri yutma yeteneğini de arttırır.
Başka bir deney setinde, CFSE etiketli apoptotik timositler makrofaj kültürüne dört saat eklendiğinde bu makrofajların fagositik makrofajlar olduğunu gösteren makrofajların yaklaşık %15'i CFSE pozitif hale gelmiştir. Mer antikor, makrofaj eferositozisindoza bağlı bir şekilde bloke edilmesive genel tıkanıklık mevcut ortamda eferositoz veriminin yaklaşık %30'una neden olabilir. Buna ek olarak, yeni onaylanmış TAM reseptör inhibitörü makrofaj eferositoz yaklaşık 100 nanomolar konsantrasyona kadar doza bağımlı bir şekilde zayıflatır.
Bu sayı eferositozun verimliliğini doğrudan etkilediği için her zaman apoptotik hücrelerin yüzdesini kontrol etmeyi unutmayın. Fagositik makrofajlar, yutma işlemi yle düzenlenen sinyal moleküllerinin araştırılması için Batı lekeleri ve yutma dinamiklerini incelemek için mikroskobik tarafından daha fazla analiz edilebilir.
