Unser Körper erzeugt täglich ein bis zehn Milliarden apoptotische Zellen. Die effiziente Clearance dieser Zellen hilft bei der Beseitigung von Zellablagerungen und der Aufrechterhaltung von Lagerbeständen. Diese Methode kann in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und -aufnahme durch viele andere phagozytische Zelltypen zu charakterisieren.
Demonstriert dieses Verfahren wird Yuxuan Zhen, ein leitender Techniker in meinem Labor. Um Thymosyten zu ernten, verwenden Sie nach dem Öffnen der Brusthöhle einer naiven C57 black 6 Maus gekrümmte feine Spitzenzange, um den Thymus herauszuziehen. Legen Sie das Organ in eine Gewebekulturschale mit 10 Milliliter rpMI 1640 Medium.
Schleifen Sie den ganzen Thymus gegen die gefrosteten Enden zweier Mikroskopschlitten und filtern Sie die resultierende Gewebesuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie die Thymosyten durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 40 Millilitern wieder auf. Nach dem Zählen zentrieren Sie die Zellen wieder und setzen Sie bis zu zwei Mal 10 bis zu den acht Zellen in 20 Millilitern frischer PBS pro 50 Milliliter Tube wieder ab.
Beschriften Sie die Zellen mit fünf mikromolaren CFSE in 20 Milliliter PBS pro Tube. Invertieren Sie die Rohre zwei bis drei Mal, um sie zu mischen, bevor Sie die Thymosyten für nicht mehr als zwei Minuten bei Lichtschutz inkubieren. Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Reaktion mit 10 Millilitern Hitze inaktiviertes Pferdeserum und sammeln die Zellen durch Zentrifugation.
Setzen Sie die beschrifteten Zellen in 40 Millilitern frischer PBS für Zählen und Zentrifugieren wieder auf, gefolgt von einer zusätzlichen Wäsche mit 40 Millilitern Medium. Nach der mittleren Wäsche die Thymosyten siebenmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Gewebekultur mittlere Rinnskonzentration aussetzen und die Zellen in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale säen. Dann staurosporin in die Zellkultur in einer mikromolaren Endkonzentration hinzufügen und die Platte vier Stunden lang in einen Gewebekultur-Inkubator geben.
Zur peritonealen Makrophagenisolierung, injizieren Sie zwei C57 schwarze 6 Mäuse intraperitoneal mit einem Milliliter von 3% im Alter von Thioglycolat am Tag Null, bevor Sie die Bauchhaut öffnen, ohne das Peritoneum am fünften Tag zu stören. Um die Peritonealhöhle zu spülen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Spur-Nadel, um schnell 10 Milliliter Waschpuffer in den Hohlraum zu schieben, bevor Sie langsam den Waschpuffer zur Abholung in ein 50-Milliliter-Rohr anzapfen. Waschen Sie die Peritonealspülung zweimal mit PBS.
Setzen Sie die peritonealen Makrophagen bei zwei mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter Gewebekultur mittlere Konzentration aus. Nächster Samen 500 Mikroliter Makrophagen in jeden Brunnen einer 24 Brunnenplatte und legen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie den Überstand, um die schwimmenden Zellen zu entfernen und fügen Sie 500 Mikroliter Gewebekultur Medium zu jedem Brunnen.
Fügen Sie sofort Null bis 12 mal 10 zu den sechs Thymosyten in 500 Mikroliter n. Medium zu jedem Brunnen der Kultur hinzu und legen Sie die Platte vier Stunden lang im Inkubator der Gewebekultur auf. Am Ende der Inkubation, waschen Sie jeden Brunnen zwei Mal mit frischen PBS, um alle frei schwebenden apoptotischen Zellen gefolgt von einer einzigen Wäsche mit Färbepuffer zu entfernen. Als nächstes beschriften Sie die plattengebundenen Makrophagen mit 200 Mikrolitern Färbepuffer, ergänzt durch einen geeigneten Anti-CD11b-Antikörper pro Brunnen, und legen Sie die Platte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius ab.
In diesem repräsentativen Experiment zeigten bis zu 30% der thioglyolat stimulierten peritonealen Makrophagen ein positives Signal im CFSE-Kanal, das darauf hindeutet, dass diese Phagozyten CFSE-markierte apoptotische Zellen aufgenommen hatten. Die mikroskopische Beobachtung der Makrophagenverschluckung von apoptotischen Zellen ist für die Untersuchung der Fähigkeit von Makrophagen, apoptotische Zellen aufzunehmen, als CFSE-positive Makrophagen sich im unteren rechten Quadranten ausbreiten, da verschiedene Intensitäten darauf hindeuten, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen innerhalb einzelner Makrophagen unterschiedlich ist. Ein höheres Verhältnis von apoptotischen Zellen zu Makrophagen erhöht nicht nur die Anzahl der Makrophagen, die apoptotische Zellen aufnehmen, sondern verbessert auch die Fähigkeit der Makrophagen, mehr apoptotische Zellen aufzunehmen.
In einer anderen Reihe von Experimenten wurden etwa 15% der Makrophagen CFSE-positiv, als CFSE-beschriftete apoptotische Thymozyten vier Stunden lang der Makrophagenkultur hinzugefügt wurden, was darauf hindeutet, dass diese Makrophagen die phagozytischen Makrophagen waren. Mer-Antikörper blockiert die Makrophagen-Efferozytose dosisabhängig und die Gesamtblockade kann etwa 30 % der Efferozytose-Effizienz in der aktuellen Einstellung ausmachen. Darüber hinaus dämt ein neu zugelassener TAM-Rezeptor-Inhibitor die Makrophagen-Efferozytose dosisabhängig bis zu einer Nanomolarkonzentration ab.
Denken Sie immer daran, den Prozentsatz der apoptotischen Zellen zu überprüfen, da diese Zahl direkt die Effizienz der Efferozytose beeinflusst. Die phagozytischen Makrophagen können von Western Blot weiter analysiert werden, um die Signalmoleküle zu untersuchen, die durch verschlungenen Prozess und mikroskopische Simulation reguliert werden, um die Dynamik der Verschlingen zu untersuchen.
