マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

私たちの体は毎日1〜100億個のアポトーシス細胞を生成します。これらの細胞の効率的なクリアランスは、細胞の破片を除去し、在庫を維持するのに役立ちます。この方法は、多くのアプリケーションにおいて、他の多くの貪食細胞タイプによるアポトーシス細胞結合および摂取を特徴付けるために用いることができる。

この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の上級技術者であるユクサン・ジェンです。胸腺細胞を収穫するには、ナイーブC57ブラック6マウスの胸腔を開いた後、曲面した細かい先端鉗子を使用して胸腺を引き出す。10ミリリットルのRPMI培地を含む組織培養皿に臓器を入れます。

2つの顕微鏡スライドの曇った端に対して胸腺全体を粉砕し、得られた組織懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにフィルター処理します。遠心分離によって胸腺細胞を収集し、40ミリリットルでペレットを再中断します。カウント後、再び遠心分離し、50ミリリットルチューブあたり新鮮なPBSの20ミリリットルで8細胞に最大2倍10倍まで再懸濁する。

細胞に、チューブあたりPBSの20ミリリットルで5ミクロモルCFSEをラベル付けします。チューブを2〜3回反転させ、胸腺細胞を光から保護された室温で2分以下にインキュベートする前に混合します。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルの加熱不活化馬血清で反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。

標識された細胞を40ミリリットルの新鮮なPBSで再中断し、その後40ミリリットルの培地で追加の洗浄を行う。培地洗浄後、胸腺細胞を7倍10回にして、培養培地濃度のミリリットル当たり6細胞に再懸濁し、100ミリの組織培養皿に細胞を播種する。次に、1つのマイクロモル最終濃度で細胞培養にスタウロスポリンを加え、4時間組織培養インキュベーターにプレートを入れます。

腹膜マクロファージ分離の場合、5日目に腹膜を乱すことなく腹部皮膚を開く前に、ゼロ日目に3%熟成チオグリコール酸の1ミリリットルで腹腔内に2つのC57黒6マウスを注入する。腹腔を洗い流すために、18ゲージ針を装備した10ミリリットルのシリンジを使用して、10ミリリットルの洗浄バッファーを空洞に素早く押し込み、50ミリリットルのチューブに回収するための洗浄バッファーをゆっくりと吸引します。腹膜洗浄をPBSで2回洗います。

腹膜マクロファージを、組織培養培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に対して2倍10回で再懸濁する。次の種子500マイクロリットルのマクロファージを24ウェルプレートの各ウェルに入れ、2時間組織培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりに、上清を吸引して浮遊細胞を除去し、各ウェルに500マイクロリットルの組織培養培地を加える。

培養物の各ウェルに500マイクロリットルの培地で6回の胸腺細胞に直ちに0〜12倍10を加え、4時間組織培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSでそれぞれをよく2回洗い、フリーの浮遊アポトーシス細胞を取り除き、続いて染色バッファーで1回洗浄します。次に、プレート結合マクロファージに、十分に適した抗CD11b抗体を補った200マイクロリットルの染色バッファーで標識し、プレートを摂氏4度で20分間置きます。

本代表的な実験では、チオグリコール酸刺激性腹膜マクロファージの最大30%が、これらの食細胞がCFSE標識アポトーシス細胞を摂取したことを示すCFSEチャネルで陽性シグナルを示した。アポトーシス細胞のマクロファージ巻き込みの顕微鏡観察は、個々のマクロファージ内のアポトーシス細胞の数が異なることを示す異なる強度のために、CFSE陽性マクロファージが右下象限に広がるにつれて、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの能力を調べるために不可欠である。マクロファージに対するアポトーシス細胞の比率が高くなると、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの数が増えるだけでなく、より多くのアポトーシス細胞を摂取するマクロファージの能力も高まります。

別の実験では、CFSE標識アポトーシス胸腺細胞がマクロファージ培養物に4時間添加されたときに、マクロファージの約15%がCFSE陽性となった。Mer抗体は用量依存的にマクロファージ・エフェロサイトーシスをブロックし、全体的な閉塞は現在の設定におけるefferocytosis効率の約30%を占める可能性がある。さらに、新たに承認されたTAM受容体阻害剤は、約100ナノモル濃度までの用量依存的な方法でマクロファージ・エフェロサイトーシスを減衰させる。

この数は、直接エフェロサイトスの効率に影響を与えるとして、常にアポトーシス細胞の割合を確認することを忘れないでください.食細胞性マクロファージは、ウエスタンブロットによってさらに分析され、巻き込みプロセスによって調節されるシグナル伝達分子を調べ、巻き込みのダイナミクスを研究するための顕微鏡検査によって分析することができます。