Bu işlemin genel amacı, çevresel yırtıcı amip tarafından patojenik mantar türleri Cryptococcus neoformans fagosittoz çalışması için bir araç olarak mikroskopi kullanmaktır. Bu video, confocal lazer taramalı mikroskopi ve iletim elektron mikroskobu kullanarak inceeceğim kriptokok hücreleri ve amiplerden oluşan bir ortak kültür hazırlamak için bir protokolü ayrıntılarıyla anlatıyor. Bu teknikleri kullanarak elde edilen bilgiler enfeksiyon sırasında içselleştirilmiş kriptokok hücrelerinin davranışı içine anlayışlar döken olabilir.
YPD agar plakaları üzerinde test mantar suşları dışarı çizgi. Plakayı 48 saat boyunca 30 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saatlik plakadan bir döngü dolusu hücrekazıyın ve %4 glikoz ile desteklenen 100 mililitre YNB suyu içeren 250 mililitrelik konik bir şişeye aşılayın.
Şişeyi 30 derecede döner çalkalayıcıyla 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saatlik kuluçka döneminden sonra, hemositometre kullanarak mantar hücrelerini sayın ve fizyolojik tampon çözeltisi ile hücre sayısını mililitre başına bir milyon hücreye ayarlayın. 30 santigrat derece bir hafta boyunca peptone maya özü glikoz suyu amip hücreleri yetiştirmek.
Bir hemositometre kullanarak amip hücrelerini sayın ve hücre sayısını mililitre başına 10 milyon hücreye ayarlayın taze steril ATCC orta 712 ile. Bunu takiben, bir trypan mavi leke kullanarak bir canlılık tayini gerçekleştirin. En az %80 canlılık gösteren hücrelerle çalışmak tavsiye edilir.
Standart amip hücrelerinin 200 mikrolitrelik süspansiyonu yapışık bir kaydırağın odalarına dağıtın. Hücrelerin yüzeye 30 derecede yapışması için iki saat bekleyin. Amip hücreleri çökerken, standart kriptokok hücrelerini floresan isotiyosiyanat ile lekele.
Mantar hücrelerini oda sıcaklığında ve karanlıkta iki saat boyunca hafifçe hareketlendirin. Zaten amip hücreleri içeren uygun odalara yıkadıktan sonra lekeli cryptokokkal hücrelerin 200 mikrolitre süspansiyon dağıtın. Hazırlanan ortak kültürü iki saatlik ek bir süre için 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Coincubation döneminin sonunda, içselleştirilmemiş kriptokok hücreleri de dahil olmak üzere herhangi bir bağlanmamış amip hücrelerini kaldırmak için iki kez PBS ile odaları yıkayın. Hücreleri onarmak için kullanılan glutaraldehit aspire, ve PBS ile iki kez oda yıkayın. Oda kaydırağını sök.
Konfokal lazer taramalı mikroskop kullanarak eş kültürlü hücreleri görüntüleyin. Yukarıdaki test tamamlamak için, seçici gıda vakuol içinde sıkışıp hücrelerin okunması için izin pHrodo boya ile cryptococcal hücreleri leke. Zaten tohumlu amip hücreleri içeren siyah bir yapışık mikrotiter plaka kuyuları içine bu lekeli hücreleri dağıtın.
Logaritmik sinyalleri göreceli floresan birimlerine dönüştürebilen bir mikroplaka okuyucuda floresanlığı ölçün. Zaten standart laştırılmış amip hücrelerinin beş mililitre içeren aynı santrifüj tüpüne standartlaştırılmış kriptokok hücrelerinin beş mililitre ekleyin. Tüpün 30 derecede iki saat durmasına izin verin.
Santrifüjden sonra süpernatant aspire edin. PH 7'de bir azı azı lı sodyum fosfat ile eş kültürlü hücreleri temsil eden peleti üç saat boyunca pH 7'de %3 glutaraldehit tamponlu sabitle. Bir kez sodyum fosfat tampon ile ortak kültürlü hücreleri yıkayın.
Benzer şekilde tamponlu 1% osmiyum tetroksit 1 1/2 saat için tekrar düzeltin yıkama izledi. Her biri 15 dakika boyunca %30%50 %70%95 ve %100'lük dereceli aseton serilerinde eş kültürlü hücreler olarak da bilinen TEM materyalini kurutun. Burada, iki değişiklik son dehidratasyon adımı tekrarlayın.
Normal kıvamda epoksi tartarak epoksi reçine hazırlayın. Epoksi reçine içine malzeme gömün. TEM malzemesini 8 saat boyunca 70 santigrat derecede polimerize edin.
Ultratome üzerine monte cam bıçaklar ile 16 nanometre bölümleri kesin. Karanlıkta 10 dakika boyunca uranyl asetat ile lekeler kurşun sitrat takip 10 dakika, ayrıca karanlıkta. İletim elektron mikroskobu ile bölümleri görüntüleyin.
Açıklayıcı amaçlar için, videoda, iki izole incelenir, bir 3-hidroksi yağ asidi üreten ve diğer değildir. 3-hidroksi yağ asitleri kriptokok hücrelerinin büyümesinde rol oynamayan ikincil metabolitleri vardır. Burada Cryptococcus ve amip arasında interaktif anlar gösteren anlık görüntüler vardır.
Noktaya, bir cryptococcal hücre önce ve içselleştirme sonra görülebilir. Fagositoz incelenirken canlı görüntülemeden yararlanmak için idealdir. Ancak, araştırmacıların fagositöz sürecini sürekli takip edebilmek için böyle bir mikroskoba erişmesi her zaman mümkün değildir.
Bu sınırlamayı telafi etmek için olası bir çözüm, göreli floresan birimlerinin okunması yoluyla görüntüleri nicel verilerle tamamlamak olabilir. Çubuk grafiği, görüntüleri tamamlamak için kullandığım verilere bir örnektir. Daha da önemlisi, hem görüntü biçimindeki nitel veriler hem de nicel veriler zaman içinde farklı zaman noktalarında alınabilir.
Tüm bilgileri birleştirerek, fagositoz işlemi sırasında neler inanışı daha büyük bir görüntü oluşturmaya başlayabilirsiniz. Kantitatif verilerden, 3-hidroksi yağ asitleri olan hücrelerin daha az hücre içselleştirildikçe 3-hidroksi yağ asidi üretmeyen hücrelere kıyasla amip hareketine daha az duyarlı olduğu açıktır. TEM özellikle güçlü bir araçtır, çünkü yüksek çözünürlük gücü nden dolayı gıda boşluğunun lümenine kuş bakışı bir görüntü verebilir ve bu da canlı görüntülemenin yanı sıra hareketsiz görüntüleri incelerken sıklıkla gözden kaçırılan bir detaydır.
Bu özel TEM mikrografında kriptokok hücrelerinin yüzeyindeki protuberances açıkça görülebilir. Daha önce, bu hücre yüzey yapılarının 3-hidroksi yağ asitlerinin çevreye saldığı kanallar olduğu ortaya atılıyordu. Noktaya kadar, Bu kanallar iç koşulları değiştirmek için amip gıda vacuole lümen içine 3-hidroksi yağ asitleri teslim yardımcı olabilir, dolayısıyla hücre sağkalım promosyon.
pHrodo veya FITC gibi sadece düşük pH floresan olarak kullanmak için çok daha iyi bir leke olabilir, gıda vakuol içinde olduğu gibi. Spesifik olması için, pHrodo sadece araştırmacı içselleştirilmiş hücreler ile ilgili veri elde etmek için izin verir. Bu doğrultuda hücrelerin boyanmadan önce fosfat tampon çözeltisinde asılı olması ve amip ortamının nötr pH olması önemlidir.
İletim elektron mikroskobu operatörleri, genellikle sonuçların çarpıtılabileceği ve elektron bombardımanı sonucu mikrografın zarar görebileceği bir nokta olduğu için düzgün bir şekilde kesişmek üzere iyi eğitilmelidir. Araştırmacıların sunulan protokolden yeterli bilgiyi alabilecekleri ve kendi çalışmalarında optimize edebilmeleri öngörülmektedir. Ayrıca araştırmacılar, hedeflenen metabolite karşı antikorgeliştirebilir ve TEM muayenesi sırasında immünoaltın etiketleme dahil immünororesans mikroskopi çalışmaları sırasında uygulayabilirler.
