Lo scopo generale di questa procedura è quello di utilizzare la microscopia come strumento per studiare la fagocitosi della specie fungina patogena Cryptococcus neoformans dal suo predatore ambientale ameba. Questo video descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-coltura di cellule criptococciche e amebe che studierò utilizzando microscopia a scansione laser confocale e microscopia elettronica a trasmissione. Le informazioni ottenute dall'uso di queste tecniche potrebbero fornire informazioni sul comportamento delle cellule criptococciche quando interiorizzate durante l'infezione.
Strizza i ceppi fungini di prova sulle piastre di agar YPD. Incubare la piastra per 48 ore a 30 gradi Celsius. Raschiare un loopful di cellule dalla piastra di 48 ore e inocularle in un pallone conico da 250 millilitri contenente 100 millilitri di brodo YNB che è integrato con il 4% di glucosio.
Incubare il pallone a 30 gradi Celsius per 24 ore su uno shaker rotante. Dopo un periodo di incubazione di 24 ore, contare le cellule fungine usando un emocitometro e regolare il numero di cellule a un milione di cellule per millilitro con soluzione tampone fisiologica. Coltiva le cellule di ameba nell'estratto di lievito peptone brodo di glucosio per una settimana a 30 gradi Celsius.
Contare le cellule dell'ameba usando un emocitometro e regolare il numero di cellule a 10 milioni di cellule per millilitro con atcc sterile fresco medio 712. In seguito, eseguire un test di fattibilità utilizzando una macchia blu trypan. Si consiglia di lavorare con celle che mostrano almeno l'80% di vitalità.
Distribuire una sospensione da 200 microliter di cellule amebe standardizzate in camere di uno scivolo aderente. Lasciare passare due ore affinché le cellule aderiscano alla superficie a 30 gradi Celsius. Mentre le cellule dell'ameba si stanno depositando, macchiare le cellule criptococciche standardizzate con isotiocianato di fluoresceina.
Agitare delicatamente le cellule fungine per due ore a temperatura ambiente e al buio. Erogare la sospensione da 200 microliter di cellule criptococciche macchiate dopo il lavaggio in camere appropriate che contengono già cellule di ameba. Incubare la cocoltura preparata a 30 gradi Celsius per un ulteriore periodo di due ore.
Alla fine del periodo di coincubazione, lavare le camere due volte con PBS per rimuovere eventuali cellule di ameba non vincolate tra cui cellule criptococciche non internalizzate. Aspirare la glutaraldeide che è stata utilizzata per fissare le cellule e lavare la camera due volte con PBS. Smontare lo scivolo della camera.
Visualizzare le celle co-coltivate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Per completare il saggio di cui sopra, macchiare le cellule criptococciche con colorante pHrodo che consente selettivamente la lettura di cellule intrappolate all'interno del vacuolo alimentare. Distribuire queste cellule macchiate nei pozzi di una piastra di microtitoro aderente nera che contiene già cellule di ameba seminate.
Misurare la fluorescenza su un lettore di micropiatte in grado di convertire i segnali logaritmici in unità di fluorescenza relative. Aggiungere cinque millilitri di cellule criptococciche standardizzate allo stesso tubo di centrifuga che contiene già cinque millilitri di cellule amebe standardizzate. Lasciare riposare il tubo per due ore a 30 gradi Celsius.
Aspirare il supernatante dopo la centrifugazione. Fissare il pellet che rappresenta le cellule co-coltivate con un molare di fosfato di sodio tamponato al 3% di glutaraldeide a pH 7 per tre ore. Lavare le cellule co-coltivate una volta con tampone di fosfato di sodio.
Fissare nuovamente per 1 ora e mezza in tetrossido di osmio tamponato in modo simile, seguito da lavaggio. Disidratare il materiale TEM noto anche come cellule co-coltivate in una serie graduata di acetone del 30%50%70%95% e 100% per 15 minuti ciascuna. Qui, ripetere la fase finale di disidratazione in due modifiche.
Preparare la resina epossidica pesando epossidico di consistenza normale. Incorporare materiale nella resina epossidica. Polimerizzare il materiale TEM per otto ore a 70 gradi Celsius.
Tagliare sezioni da 16 nanometri con coltelli di vetro montati sull'ultratomo. Macchiare le sezioni con acetato di uranile per 10 minuti al buio seguito da citrato di piombo per 10 minuti, anche al buio. Visualizza le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione.
A scopo illustrativo, nel video, vengono esaminati due isolati, uno che produce acido grasso 3-idrossi e l'altro che non lo fa. Gli acidi grassi 3-idrossi sono metaboliti secondari che non svolgono ruolo nella crescita delle cellule criptococciche. Ecco le istantanee che mostrano momenti interattivi tra Cryptococcus e amebae.
Al punto, si può osservare una cellula criptococcica prima e dopo l'internalizzazione. Quando si studia la fagocitosi, è l'ideale per utilizzare l'imaging dal vivo. Tuttavia, non è sempre possibile per i ricercatori avere accesso a tale microscopio per seguire continuamente il processo di fagocitosi.
Una possibile soluzione per compensare questa limitazione può essere quello di integrare le immagini con dati quantitativi attraverso la lettura di unità di fluorescenza relativa. Il grafico a barre è un esempio di dati che ho usato per integrare le immagini. È importante sottolineare che sia i dati qualitativi sotto forma di immagini che i dati quantitativi possono essere presi in diversi momenti nel corso del tempo.
Mettendo a piecing tutte le informazioni, si può iniziare a costruire un'immagine più grande di ciò che emerge durante il processo di fagocitosi. Dai dati quantitativi, è chiaro che le cellule con acidi grassi 3-idrossi sono meno suscettibili all'azione dell'ameba rispetto alle cellule che non producono acido grasso 3-idrossi poiché meno cellule sono internalizzate. Il TEM è particolarmente uno strumento potente in quanto può dare una visione a volo d'uccello del lume del vacuolo alimentare a causa del suo potere ad alta risoluzione, e questo è il tipo di dettaglio che spesso viene perso quando si esaminano immagini dal vivo e immagini fisse.
In questa specifica micrografia TEM, le protuberanze sulla superficie delle cellule criptococciche possono essere chiaramente viste. In precedenza, è stato teorizzato che queste strutture cellulari superficiali sono canali attraverso i quali gli acidi grassi 3-idrossi vengono rilasciati nell'ambiente circostante. Al punto, questi canali possono aiutare a fornire acidi grassi 3-idrossi nel lume del vacuolo alimentare delle amebe per alterare le condizioni interne, da qui la promozione della sopravvivenza cellulare.
pHrodo o come FITC può essere una macchia molto migliore da usare in quanto fluoresce solo a basso pH, come all'interno del vacuolo alimentare. Per essere specifici, pHrodo consente solo al ricercatore di ottenere dati riguardanti cellule internalizzate. A tal fine, è importante che le cellule siano sospese in soluzione tampone fosfato prima della colorazione e che il supporto di ameba sia di un pH neutro.
Gli operatori del microscopio elettronico a trasmissione devono essere ben addestrati a se sezionersi correttamente in quanto questo è spesso il punto in cui i risultati potrebbero essere distorti e la micrografia danneggiata dal bombardamento elettronico. Si prevede che i ricercatori saranno in grado di prendere informazioni sufficienti dal protocollo presentato e ottimizzarle nei propri studi. Inoltre, i ricercatori possono anche sviluppare anticorpi contro metaboliti mirati e applicarli durante il loro studio di microscopia immunofluorescente, inclusa l'etichettatura immunogold durante l'esame TEM.
