Name: visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Bu araştırma NIH ödül 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Tüm hayvan çalışma mevzuatına ve Albert Einstein Tıp Koleji Hayvan Araştırmaları Enstitüsü kurallarına uygun olarak yapıldı. C. 1. Yetiştirilmesi neoformans H99 (serotip A) <ol><li> Bireysel C büyütün Sabouraud agar plakaları üzerinde neoformans (Cn) kolonileri. </li><li> Bir gün önce deney, tek bir koloni seçip Sabouraud suyu 10 ml aşılamak. </li><li> Kültür 250 rpm bir hızda çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir gece boyunca büyümeye izin verin. </li></ol> 2. İzolasyon ve C57 Primer Kemik Makrofagların Hazırlık / BL6 Fareler <ol><li> Artık nefes kadar bir CO2 odasına hayvana yerleştirerek fareler öldürülür. İkinci bir önlem olarak, cervically diseksiyonu başlamadan önce, boyun yerinden. % 70 etil alkol ile tüm vücut sterilize. </li><li> Steril DMEM&#39;de hem femur ve tibia ve yer kemikleri çıkarın. </li><li> Aşırı doku ve kas DE kullanarak sökünKemikler tamamen temizlenene kadar licate mendil. </li><li> % 70 etil alkol içeren bir Petri kutusu sadece sağlam kemikleri yerleştirin ve ilgili mikroorganizmaları öldürmek için 3 dakika boyunca inkübe edin. Steril DMEM ile Petri kabındaki kemikleri ve yer çıkarın. </li><li> Dikkatle kemiklerin uç kesti. Boş bir 50 ml konik tüp, buz üzerine yerleştirildi ve her bir kemik içinden bir 25 G iğne kullanılarak soğuk DMEM, 10 ml dikkatli bir hizada fazla kemik tutun. NOT: Her fare 4 kemikleri (2 femur, tibia 2) verecektir. Bu nedenle, bir fare hücre süspansiyonu yaklaşık olarak 40 ml elde edilmelidir. </li><li> 650 x g&#39;de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje hücre süspansiyonu. </li><li> Bu Santrifüj sırasında hazırlamak ve filtre kemik iliği makrofaj% 20 L929,% 10 fetal dana serumu,% 10 NCTC-109,% 1 Pen-strep,% 1 HEPES,% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM ortamı oluşur besleme sterilize , temel olmayan amino asitler,% 1,% 0.1 2-mersaptoetanol eklenir. </li><li> Besleme ortamı 10 ml ile yeniden süspanse edilen topak. Hücre esas asma geçmekhücre kümeleri bozabilir ve büyük enkaz kaldırmak için 70 mikron hücre süzgecinden iyon. </li><li> Levha (10 plakaların toplam) doku kültürü kullanılmak üzere optimize edilmiştir Petri tabaklarında besleme ortam 10 ml hücre süspansiyonu 1 mi. </li><li> Hücreler% 10 CO2 ile 37 ° C &#39;de yapışmaya izin verin. 7. günde, 3. günde taze besleme ortamı 5 ml tam ortam besleme ve makrofajlar kullanılmaya hazırdır değiştirin. </li><li> Deneyden önceki gün, besleme ortamı kaldırarak levhadan ayırmak ve makrofaj plaka reaktif sıyırma yumuşak bir hücrenin 5ml ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle inkübe ve hafif pipetle makrofajlar çıkarın. </li><li> 10 dakika boyunca 650 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Medya besleme 1 ml içinde süspanse pelet. 1:20 seyreltme kullanılarak, bir haemositometre üzerine hücre süspansiyonundan 10 ul pipetleme makrofajların konsantrasyonunu hesaplamak. </li><li> Petri kapları 14 mm cam tabanı kullanarak, bir plakaşirketinden 200 ul maksimum kapasitesi iç kuyu üzerine 1 x 10 5 makrofaj konsantrasyonu, bu yüzden, Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, bu birimin aşmaması için dikkatli alır. </li><li> Hücreler 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör yemekleri yerleştirerek cam bir Petri tabağına yapışma izin verin. </li><li> 500 U / ml, 1 mg / ml IFNg LPS ile takviye edilmiş ortam besleme 1-2 ml ilave edilir ve hücreler bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> Primer sıçan makrofaj lan ve C. 3. alk kuluçkalama neoformans <ol><li> Deney gününde, 420 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj edilerek bir gece kültürü aşılandı ve pelet maya hücrelerinin 1 ml&#39;sini uzaklaştırın. </li><li> Yukarıda belirtilen hızda ve zamanda polisakkarit glucuronoxylomannan (GXM) gibi medya ve hücre dışı kriptokoksik ürünleri kaldırmak için steril PBS ile hücreler 3 kez yıkayın. </li><li> 100 seyreltme: steril 1 ml PBS içinde yeniden süspanse ve hücre topağı, 1 olun. T pipetle 10 ulo bir haemocytometer üzerine seyreltme ve hücreleri saymak. 1 MOI&#39;da maya hücreleri ekleyin: 5&#39;tir. , 1 x 10 5 makrofajlar bulunmaktadır, örneğin, / yuva, Cn 5 x 10 6 / ml &#39;lik bir hücre süspansiyonu yapmak ve 5 x 10 5 Cn toplam bir miktarda bu çözeltiye 100 ul ilave edin. </li><li> 10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda mAb 18B7 antikor ile besleme ortam 1 ml hücre süspansiyonu, kriptokokal hesaplanmış hacim. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> Camdan besleme medyayı çıkartın Petri dipli çanak ve steril PBS ile 1x yıkayın. Iyi doğrudan opsonize Cn 100 ul ekleyin. </li><li> Hücreler% 10 CO2 ile 37 ° C&#39;de 2 saat inkübasyona izin verin. </li><li> Co-kuluçkasından sonra, makrofajlar Cn içselleþtirdikleri bu mikroskop ile kontrol edin. Içselleştirilmesi kabul edilmesi için, kriptokokal hücreler açıkça makrofaj sınırları içinde görülmelidir. </li><li> Steril PBS ile yıkayın Petri kabı, 3x her türlü extracellula kaldırmak içinr Cn. </li><li> 1-2 mAb 18B7 eklenmeksizin ortam besleme ml ve ayarlamak mikroskop ekleyin. </li></ol> Dijital Işık Mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı 4. görselleştirme Non-litik Ekzositoz NOT: CO 2 teslimat ve bir ısıtma ünitesi gerekli içeren ekli bir kuluçka odası ile birlikte bir mikroskop bu deneyler gerçekleştirmek için. <ol><li> Deneyden önce en az 30 dakika 37 ° C&#39;de inkübe Kabin, önceden ısıtın. CO2 birimi Deneyin başlangıcında% 5 okur emin olun. </li><li> Yer cam CO 2 kapaklı kapak ve hiçbir ısı kaçar sağlamak için bütün kapılarını kapatmak, mikroskop platformda Petri dipli. </li><li> Faz kontrast mikroskop ile 10X objektif kullanılarak, enfekte makrofajlar net bir alana odaklanmak. Deney göre, üzerinde çalışılacak gerekir kaç makrofajlar tarafından kullanılan hedefi belirler. </li><li> Ta için mikroskop yazılımı kurmabir görüntüye 24 saatlik bir süre boyunca her 4 dakikada ke. </li><li> 24 saat sonra deney sona ulaştığını olacak ve 361 bir görüntü toplanan toplam olacaktır. 5% sıkıştırmada .jpegs olarak bu görüntüleri aktarın. Resim J yazılımı kullanarak, saniyede 5 kare Visual Stack olarak görüntüleyebilirsiniz. Film yayın veya sunum için inceledi gerekiyorsa, bir avi veya biçim izleyici için en iyi çalıştığını bağlı Mov dosyası ya olarak kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System.">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+interactions+with+macrophages:+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen.">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans.">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li><li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+&#8212;+a+case+of+convergent+evolution.">Intracellular pathogenic bacteria and fungi &#8212; a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages.">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast.">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15 (2007).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2/3+complex-mediated+actin+polymerisation.">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li><li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis.">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li><li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans.">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li><li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını veya diğer ilgi çatışmaları olmadığını beyan ederim.

Burada, mantar-makrofaj etkileşimleri kaydedildi ve 24 saatlik bir süre boyunca gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Bizim laboratuvar olmayan litik ekzositoz zamansal açıdan birçok incelemek için bu protokolü kullandı ve bu süreci çevreleyen morfolojik bileşenleri tespit etmek için gerçek zamanlı mikroskobu kullanmaya devam edecektir. Bu teknik, doğru sonuçlar elde etmek için özel bir dikkat protokol belirli adımlara verilmelidir. Çok fazla hücre hareketi ve tek tek hücrelerin etkileşimlerinin izleme engellenmiş olduğu gibi kullanılabilir olmayan bir film oluşturmak için çok az sayıda hücre önemli değildir veriler elde iken bir gece önce kaplanır hücre yoğunluğu, önemlidir. Amaç, bağımsız makrofajlar ve enfeksiyon döneminin süresi boyunca takip edilebilir şekilde makrofaj, düzgün biçimde aralanmış bir alan elde etmektir. Aynı mantıkla, hücre dışı Cn yıkayarak ex gibi kritik bir adımdırekstrasellüler Cn alanını gizlemek ve makrofajların görünürlüğü kaybına neden olabilir zaman içinde böleceğiz. Filmin uzunluğuna bağlı olarak, çerçeve incelemek için kullanılamaz görüntüleri yapar ve bu nedenle, kayıt enfeksiyon sırasında çeşitli noktalarda kontrol edilmelidir odak dışında kayabilir. Belirtildiği gibi, bu tekniğin diğer deney parametreleri sığacak şekilde modifiye edilebilir çeşitli yollar vardır. Birçok farklı floresan boyalar ve belirteçler membran ve phagosomal dinamiklerini vurgulamak için kullanılabilir ama bir fotoğraf beyazlatma dikkatli olmalı ve bu hücrelerin fitness olabilir etkiler. Hücre tiplerinin çeşitli da oluşabilir farklılıklarını incelemek için, diğer mantar türleri ile bağlantılı olarak J774.1 makrofaj-benzeri hücreler, monositler veya amip gibi kullanılabilir. Bizim deneyler hücrelerinin büyük miktarda veri toplama gerektirir çünkü biz ancak bir üst kullanabilirsiniz, 10X objektif kullanmanızı öneririzSadece birkaç hücre çalışma hedefi. Her görüntü alınır zamanlaması da ayarlanabilir. Görüntü çekmek 24 saat boyunca her 4 dk tüm çerçeveler sıkıştırılan uzunluğunda kabaca 1 dakika çalışan bir film verir. Artan ya da yönü (enfeksiyonun süresi ve çerçeveler arasındaki süre) Bazı laboratuarlarda için bir sorun olabilir depolanması gerekmektedir dosyaların miktarını artırır. Litik olmayan ekzositozu enfeksiyonu esnasında hızlı bir şekilde ve çeşitli zaman aralıklarında gerçekleşir derece dinamik bir süreçtir. Bu nedenle, iletim ve taramalı elektron mikroskobu gibi diğer yöntemleri kullanarak, bu etkileşimi geçiren makrofajlar yakalamaya çalışırken son derece nadir olabilir. Nedeniyle örnekler sabit ve işlenir nasıl doğası gereği, bir şey inceledi ediliyor kesin gibi parçalama veya apoptoz gibi diğer hücresel süreçlerin karşı litik olmayan ekzositoz olduğundan emin olamaz. Ayrıca, olmayan-litik Ekzositoz bir işaretidir konak ve patojen ile kalmasıdır<html> Daha sonra ble bu yöntemler sadece belirli bir anda bir sürecin anlık üretebilir beri sabit görüntülerden çıkaramayız bir şeydir. Bu protokol hücresel süreçlerin sayısız görüntüleri sağlayabilir iken, konak patojen etkileşimleri çalışmak için bu tekniği kullanarak bazı sınırlamalar vardır. Düşük amacımız fagozomun olmayan litik Ekzositoz bir iyi anlaşılmış bir yönü değildir, hücre zarının arasındaki etkileşimi görselleştirmek için, yeteri kadar yüksek çözünürlüklü görüntü için izin vermez aynı anda makrofaj büyük miktarda çalışma için kullanılır. Tüm görüntüleri kaydedilmiş edildikten sonra, izleyen birçok makrofaj sonrası analizi çok sıkıcı ve zaman alıcı olabilir. Makrofajlar, cama yapıştırılmış bile bu, çok hareketli olabilir ve çok hızlı bir şekilde ve çerçevenin dışında hareket edecek. Bu zor baştan bireysel makrofajlar, çerçevenin çevre yakınında özellikle o takip yapabilir. jove_content &quot;&gt; Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol konak-patojen etkileşimleri birçok farklı yönlerini incelemek için çeşitli şekillerde kullanılabilir olduğunu.

Kriptokokal hücreleri ve makrofajlar arasında bir mantar enfeksiyonunun safhaları 1-3 belgelenmiştir. Maya hücreleri, makrofajlar tarafından sindirilen sonra etkileşimlerin çeşitli oluşabilir: makrofaj hücre dışı alanı içine mantar yükünü serbest lize olabilir veya hücresel membran 4 sınırları içinde maya hücrelerini tutarak enfeksiyon kontrolü olabilir. Litik olmayan ekzositozu, bir makrofaj çevredeki ortama kriptokokal hücrelerin bazı veya tüm expunged bir işlemdir ya da komşu hücre ve ana ve hem de patojen 5 canlı kalır: Bununla birlikte, birkaç yıl önce, yeni bir sonuç iki grup ile bağımsız bir şekilde tanımlanmıştır -8. Çeşitli çalışmalar bu etkileşimin ardındaki moleküler mekanizmalarını anlamaya çalıştılar ama biz hala bu fenomen neyin tam bir kavrayışa sahip değilsiniz. Yeteneği, gerçek zamanlı görüntü yakalama ve sonradan birden Infect analized makrofajlar bir mantar enfeksiyonu sırasında morfoloji ve makrofajlar hatta stres zamanlaması, mekansal kapasite, değişim ile ilgili olmayan litik eksositoz çevreleyen fiziksel özellikleri hakkında birçok sorulara cevap verir. Hücreler bir kuluçka karşılaştırılabilir bir ortamda muhafaza edilecek izin, biz makrofaj-mantar hücre etkileşimlerinin dinamik doğasını belirti. Araştırmacılar, bu sürecin çeşitli bileşenleri incelemek için bu tekniği kullandık. Başka bir grup litik olmayan ekzositozu protein alanlarının çekirdek YIKAMA 10 silinen oldu hücrelerde bloke olduğunu göstermek için bu yöntemi kullanan Bu işlemde fagozomun rolü, floresan lekelenmesi ve aktin bloke edici maddeleri kullanılarak açık 9 yapılmıştır. Sitokin sinyallerinde etkisi de gerçek zamanlı mikroskobu 11 kullanılarak tespit edilmiştir. Bu işlem, C bunlarla sınırlı değildir bunun gibi neoformans, Candida albicans gözlenmiştir anothemakrofajlar 12 bulaştırmak için yeteneğine sahiptir mantar patojen r. Bu bulgular bu yöntem hakkında o kadar az şey biliyoruz bir alana bir bilgi zenginliği sağlayabilir nasıl örnekleridir.

<table><tbody><tr><td>Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>DF0109-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Dextrose Broth</td><td>BD</td><td>DF0382-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Dubelcco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 109</td><td>Invitrogen</td><td>21340-039</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>3003 Tissue Culture Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L3137</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-g</td><td>Roche</td><td>NC 9222016</td><td></td></tr><tr><td>mAb 18B7</td><td>Non-commerical antibody produced in our lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy

Cryptococcus neoformans ile makrofajların enfeksiyonun pek çok yönü, geniş olarak araştırılmış ve iyi bir şekilde tanımlanmıştır. Ancak, açıkça anlaşılmış değildir belirli bir etkileşim olmayan litik ekzositoz olduğunu. Bu işlemde, maya hücreleri, makrofajlar ve Cn uygulanabilir hem yaprak, az anlaşılmış bir mekanizma ile hücre dışı alana salınır. Burada, zaman lapsed mikroskobu ile 24 saatlik bir enfeksiyon dönemi için ayrı ayrı enfekte makrofajlar çok sayıda takip açıklanmıştır. Enfekte olmuş makrofajların, bir hücre kültürü inkübatöründe olduğu gibi aynı şartlar sağlayan bir mikroskop bağlı bir CO2 atmosfere sahip bir ısıtma odasına yerleştirilmiştir. Canlı dijital mikroskopi statik görüntülerin mevcut olmayan bir ev sahibi ve patojen arasındaki dinamik etkileşimleri hakkında bilgi verebilir. Tersi makrofajlar mantar enfeksiyonları nasıl idare için ipuçları sağlayabilir ve her enfekte hücreyi görselleştirmek için güçlü olmak. Bu teknik, ıkarmaşık bir fenomenin arkasında dinamikleri okuyan sa güçlü bir araçtır.

Bu tekniğin ürettiği görüntüler hücreleri C fagosite sonra ne çevreleyen bilgi toplamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir neoformans. Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi, enfekte edilmiş veya enfekte edilmemiş ya da yaklaşık 100 makrofajlar vardır. Bu makrofajlar her biri izleyiciye çok mikroskobik düzeyde konak-patojen etkileşimleri çalışmak için bir fırsat verir. Şekiller 2 ve 3&#39;ün gibi, farklı bir makrofaj ve maya hücre arasında oluşabilir sonuçlar, hatta makrofaj makrofaj arasında bulunmaktadır. Makrofajlar olmayan litik eksositoz, hücre-hücre transferi, ya da oluşabilecek diğer hücresel sürecinden olarak atılır olabilir. Enfeksiyon sırasında bu tür olayların zamanlaması da film kaydedilirken ayarlanır parametrelere dayalı tespit edilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width= &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52084 / 52084fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 1:. Edilen enfekte olmuş makrofaj Alan Bu rakam, 24 saatlik bir enfeksiyon süresinin başlangıcında bireysel olarak enfekte olan makrofaglar bütün bir alan gösterir. Daha da önemlisi, bu makrofajlar (büyük bir ok ucu ile gösterildiği gibi) enfekte olan ve (küçük ok ile belirtildiği gibi) herhangi bir mantar hücrelerini içeren verildiğini kadar açık alan hücre dışı Cn serbest olduğu not edilmelidir. Ölçek çubuğu 50 mm temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52084/Updated_Field_of_Macrophages.mov" target="_blank">Film 1</a> : makrofaj C Görselleştirme neoformans 24 saat Enfeksiyon Dönem. filmin ilk kare bulaşmamış olan bazı ve kriptokoksik hücrelerin değişen miktarlarda fagosite olduğunu bazı sahada boyunca birçok makrofajlar gösterir. Film ilerledikçe, hücreler, arE tüm hareketli ve alanıyla ilgili hareket görülebilir. Biz, tabi hücresel sürecin ne tür görmek için bu makrofajlar her takip edebiliyoruz. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52084/52084fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2:. İlköğretim Mürin Makrofaj Gören Sigara litik Ekzositoz (beyaz ok ile gösterilen, Panel A) virüslü bir makrofaj olmayan litik ekzositoz başlayan aşamasında geçiyor görülmektedir. Fagosom (panel M.Ö.) Ayrıntı için başlar ve mantar yük kayması başlar. Paneller DE görülebileceği gibi çeşitli Cn sonra, hücreler, hücre dışı boşluğa salınır. Beyaz bir ok ucu ile gösterilen panel F ikinci bir enfekte makrofaj,, aynı zamanda, litik etkinlik ekzositozu (Panel GH) maruz kalır. Beyaz ok uçları ile gösterildiği gibi sürecin sonunda her iki boş makrofajlar (panel I) &#39;bırakılır. Ölçek çubuğu 25 mm temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52084/Non-Lytic_Exocytosis.avi" target="_blank">Film 2</a> :. görselleştirme İlköğretim Kemirgen Makrofaj Gören Sigara litik Ekzositoz Bu filmde, bu kriptokokal hücreleri enfekte makrofaj sınırları içinde olduğu açıktır. Makrofaj ajite olur ve bir maya hücresi fagozomun içinde filizlenen görülebilir. Hücreler daha sonra hızlı bir şekilde kriptokokal çevredeki ortama expunged edilir. İkinci bir enfekte olmuş makrofaj litik olmayan ekzositozu daha fazla maya hücreleri hücre-dışı alana maruz bırakılır. Hareket devam etme kabiliyetleri ile gösterildiği gibi konakçı hücreler, kriptokokal Ekzositoz sonra canlı kalır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52084/52084fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3:. İlköğretim Mürin Makrofaj Gören Hücre-Hücre Transferi Başka bir procBu protokolü kullanarak çekilebilir esini kriptokokal hücreler komşu makrofaj bir makrofaj transfer oluşur hücre-hücre transferi. İki enfekte makrofajlar, beyaz ok başları (A Paneli) ile gösterilen birbirine yakın olan ve hücre-hücre aktarımını (B Paneli) başlatmak için daha yakın hareket eder. Kırmızı ok uçlarıyla gösterilen bir hücre-hücre köprü kriptokokal hücreler transferi (Panel C ve E) sırasında çevreye maruz kalmayacakları şekilde iki makrofajlar arasında oluşturulmuştur. Aktarma işlemi tamamlandıktan sonra, hücreler (Panel D, F) ayrılacağım. Ölçek çubuğu 25 mm temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52084/Cell-Cell_Transfer.mov" target="_blank">Film 3</a> :. edilen enfekte olmuş makrofaj arasında hücre-hücre transferi, görselleştirme vesileyle, makrofajlar konakçı hücreler arasında kriptokokal hücrenin transferini kolaylaştıran bir şekilde etkileşime girer. Maya hücreleri maruz kalmazhücre dışı ortama ve ev sahibi hücrelerin canlı kalır. Bu filmde, iki enfekte makrofajlar bir makrofaj diğerine mekik kriptokokal hücrelere iki ayrı olayda hücre-hücre köprüler oluşturmak. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52084/52084fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4: Hücrelerin gösteren şematik hazırlanması.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Biz makrofaj C görselleştirmek için nasıl açıklar neoformans (Cn) dijital ışık mikroskobu kullanılarak litik olmayan ekzositoz sürecine özel vurgu ile gerçek zamanlı etkileşim,. Ayrı ayrı enfekte makrofajlar bu tekniği kullanarak bu olayın çeşitli yönlerini belirlemek için ele alınabilir.

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

visualizing-non-lytic-exocytosis-cryptococcus-neoformans-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

11.7K Görüntüleme.  Albert Einstein College of Medicine.  Biz makrofaj C görselleştirmek için nasıl açıklar neoformans (Cn) dijital ışık mikroskobu kullanılarak litik olmayan ekzositoz sürecine özel vurgu ile gerçek zamanlı etkileşim,. Ayrı ayrı enfekte makrofajlar bu tekniği kullanarak bu olayın çeşitli yönlerini belirlemek için ele alınabilir. 

Video: Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Biyoloji

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler