Name: a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

KP e como escreveu e revisou o manuscrito. KP realizados os experimentos e a análise. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de transição de carreira do National Institutes of Health (NIH) (K22AI112816) às.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade da Califórnia, Irvine.
1. buffers e soluções
<ol><li>Prepare o caldo de lisogenia (LB) em um frasco de vidro de 1 L, acrescentando 25 g de mistura de LB-Miller em 1 litro de água bidestilada (ddH2O). Para placas de Petri, adicione um adicional 20 g de ágar-ágar. Autoclave para esterilizar. Despeje a 25 mL de ágar-ágar fundido Petri de 10 cm de diâmetro e deixar para solidificar à temperatura ambiente. Armazenar a mídia líquida à temperatura ambiente e placas de ágar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar pratos de glicose levedura peptona (cigano) em um frasco de vidro de 1 L misturando-se 1 g de D-glicose, extrato de 2 g de peptona, 0,25 g de levedura, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g de Na2HPO47 H2O e 25 g de ágar-ágar em 1 L de DDQ2 O. Autoclave para esterilizar. Despeje a 25 mL de ágar fundido Petri de 10 cm de diâmetro e deixar para solidificar à temperatura ambiente. Loja a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare o suporte de peptona S (PS) em uma garrafa de vidro 1L pela mistura de 10g de peptona, extrato de 7 g de fermento, 15 g de D-glicose, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 µ g de vitamina B12 , e 80 µ g de ácido fólico em 800 mL de DDQ2O. calibrar um medidor de pH eletrônico usando padrões de pH 7 e pH 4 se o medidor de pH não tenha sido usado dentro de um dia.<ol>
<li>Medir o pH do meio PS usando o medidor de pH. Adicione 5 M KOH ou 5 M H3PO4 para ajustar o pH a 6.5. Ajustar o volume final para 1 L usando ddH2O. Filter esterilizar usando filtro de vácuo 0,22 µm e armazenar a 4 ° C. Nota: Proceda com cautela com os ajustes do pH através do uso de equipamento de proteção incluindo luvas, roupas de proteção, óculos de proteção e protecção facial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 10 x desenvolvimento Buffer Prime (DB') buffer em um frasco de vidro de 1 L, adicionando 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O e ddH2O para um volume total de 800 mL. Calibre um medidor de pH eletrônico usando padrões de pH 7 e pH 4 se o medidor de pH não tenha sido usado dentro de um dia.<ol>
<li>Medir o pH do buffer usando o medidor de pH eletrônico. Ajuste o pH a 6.5 adicionando suavemente ou 5m KOH ou 5 M H3PO4 conforme necessário. Ajustar o volume final para 1 L usando ddH2O e esterilizar em autoclave. Armazenar em temperatura ambiente. Nota: Proceda com cautela com os ajustes do pH através do uso de equipamento de proteção incluindo luvas, roupas de proteção, óculos de proteção e protecção facial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer 1 x buffer de desenvolvimento (DB) misturando-se 100 mL de 10 x DB' buffer com 1 mL de esterilizados de MgCl 2 M2, e 1 mL de esterilizados 1 M CaCl2. Ajuste o volume final para 1 L em um frasco de vidro de 1 L usando um de DDQ esterilizado autoclavado2loja O. à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare PS:DB médio em um frasco de vidro de 1 L misturando-se 100 mL de meio de PS esterilizado, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer e esterilizado ddH2O para um volume total de 1 L. suplemento com 1 mL de esterilizados de MgCl 2 M2 e 1 mL de esterilizados 1 M CaCl 2. loja a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare a solução-mãe de calceína-AM, acrescentando 50 µ l de DMSO para 50 µ g de calceína-AM no recipiente plástico fornecido pelo fabricante. Loja a-20 ° C.</li>
</ol>2. o crescimento e manutenção das amebas
<ol><li>Cresce Escherichia coli estirpe b/r17 como fonte de alimento para as amebas durante o período de crescimento inicial. Raia Escherichia coli b/r de um estoque congelado armazenado a-80 ° C em uma placa de ágar LB e incubar a 37 ° C durante a noite para obter colônias única.</li>
	<li>Inocular uma única colônia de e. coli b/r em 2 mL de meio LB e incubar durante uma noite em um tambor de cilindro ou um agitador a 37 ° C.</li>
	<li>Trazer o pernoite cultura de e. coli para a temperatura ambiente. Usando uma vara de madeira, inocule as amebas de um estoque congelado mantida a-80 ° C em 750 µ l de cultura durante a noite. Nota: Use d. discoideum estirpe AX3, que é capaz de crescimento axénica18. Esta etapa não requer crescimento axénica, mas as etapas subsequentes, terão sua exigência.</li>
	<li>Imediatamente adicione 700 µ l de amebas -Escherichia coli mistura em um prato de glicose levedura peptona (cigano). Difundir a cultura uniformemente sobre a superfície da placa, inclinando-se e para trás e de lado conforme necessário. Evite o uso de um difusor.</li>
	<li>Coloque a placa de cigano com agar para cima em uma caixa que mantém a umidade elevada. Use dois recipientes de plástico descartáveis (183 x 183 cm x 91 cm) empilhadas no topo de um ao outro. Encha o recipiente de fundo com cerca de 25 mL de água e coloque o recipiente superior com vários 0,5 cm de diâmetro furos através do revestimento do recipiente para permitir que a umidade mover o reservatório de água para o recipiente superior.</li>
	<li>Incube a placa de cigano e caixa a 22 ° C por 4-5 dias até ameba esporos são observados crescendo perto da superfície da placa (Figura 2). Use uma incubadora refrigerada para incubar as placas, ao invés de incubação à temperatura ambiente. Nota: Depois de esporos têm crescido, eles permanecem viáveis em placas durante várias semanas, quando armazenadas a 4 ° C. Armazene as placas com agar para cima. Após 3-4 dias de incubação, zonas de clareira dentro do gramado bacteriana podem ser observadas, que indicam o início de esporulação de ameba.<ol>
<li>Observe as amebas pequenas esporos acima da superfície da placa após 4-5 dias de incubação (Figura 2). Nota: Não crescem as amebas por mais de uma semana, como a qualidade dos esporos diminui além deste período de tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colete esporos de amebas para se preparar para o crescimento axénica das amebas varrendo uma ponta da pipeta estéril mL 1 paralela à superfície da placa. Colete os esporos de metade de uma placa de Petri de 10 cm. Nota: Evite tocar a superfície da placa de ágar como este movimento irá recolher um grande número de Escherichia coli.</li>
	<li>Resuspenda as amebas na ponta da pipeta por imergindo a ponta em 1 mL de meio de PS e suavemente pipetagem para cima e para baixo.</li>
	<li>Transfira a mistura inoculada em um frasco de 250 mL contendo 25 mL do meio de PS, suplementado com a antibiótico antimicótico solução na concentração de x 0,25. Nota: Guarde a solução antibiótico antimicótico como 250 alíquotas µ l a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de congelamentos e descongelamentos desta solução como isto pode diminuir sua eficácia.</li>
	<li>Crescem as amebas axenically a 22 ° C, em um agitador rotativo a 100 rpm. Para o ensaio de virulência na etapa 5, desenvolvem-se células para uma densidade óptica medida em 600 nm (OD600) de 0,2 a 0,5. Nota: Esta etapa exige 3-4 dias de crescimento desde o momento da inoculação (passo 2.7). Se as células têm crescido de uma densidade mais elevada, diluir a cultura no médio e PS uma OD600 de 0,05 ou inferior e crescer para uma OD600 de 0,2 a 0,5.</li>
</ol>3. o crescimento de p. aeruginosa
<ol><li>Escolher uma única colônia de p. aeruginosa de uma placa LB, inoculá-lo em um 2 mL PS:DB cultura e crescer durante a noite a 37 ° C, a saturação. Nota: Não adicione a solução de antibiótico antimicótico para a mídia PS:DB.</li>
	<li>Dilua a 1: 100 de cultura durante a noite ou 1:1,000 em um prato de Petri de 6 cm de diâmetro usando PS:DB. Se a virulência das células planctônicas unicamente está sendo analisada, crescem as culturas utilizando tubos de cultura convencional em vez disso. Agite a cultura em rotacao bancada fixado em 100 rpm a 37 ° C.</li>
	<li>Colheita de culturas em pontos de tempo específico para garantir a reprodutibilidade. A 30 min a 1 h antes de avaliar a virulência, prepare uma almofada de ágar, conforme descrito na seção 4. Nota: Virulência em p. aeruginosa é induzida por cerca de 8 h de crescimento em superfícies.</li>
	<li>Para isolar as células conectado à superfície, retire o prato de Petri o meio líquido, lavar imediatamente com 1 mL de tampão de DB para remover células planctônicas e proceder de imediato à etapa 5.1. Atenção: Não lave mais de 30 s como este irá perturbar e desanexar conectado à superfície de células e pode afetar a medição de virulência.</li>
	<li>Para isolar as células planctônicas, transferir 10 µ l da cultura da caixa de Petri para um prato de Petri limpo e proceder de imediato à etapa 5.1.</li>
</ol>4. microscopia - preparação do ágar Pad
<ol><li>Prepare-se almofadas de ágar cerca de 30 min a 1 h antes de amebas estão prontas para ser misturado com p. aeruginosa.</li>
	<li>50 mL de ágar de 1% (p/v) em tampão de DB em um balão de 250 mL de microondas. Mix cada 20 s até grupos de ágar desaparecer.</li>
	<li>Legal o ágar fundido, colocando-o num banho de água pré-aquecida a 55 ° C por 15 min.</li>
	<li>Adicione 15 µ l de solução-mãe calceína-AM a 15 mL de ágar fundido em um tubo cônico. Misture suavemente invertendo o tubo-4 - 5 vezes e dirijam-se para a próxima etapa. Nota: Execute esta etapa em um tubo de centrífuga de polipropileno 15 mL. Não utilize um recipiente de vidro grosso como isso fará com que o ágar solidificar demasiado rapidamente.</li>
	<li>Despeje a mistura de ágar derretido em cima de uma placa de vidro de 12 cm x 10 cm e permitir que o ágar solidificar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Corte o bloco de ágar solidificado em seções menores de 1,5 x 1,5 cm, colocando a placa de vidro sobre uma grade impressa e corte ao longo da grade usando uma régua de metal.</li>
	<li>Manter o gel hidratado em uma caixa de úmido, até que esteja pronto para uso.</li>
</ol>5. microscopia - preparação da amostra bactérias-ameba para a imagem latente
<ol><li>Para ensaiar a virulência das células bacterianas conectado à superfície, adicione 10 µ l de células de ameba de passo 2.10 para bactérias conectado à superfície da etapa 3.4. Nota: Este passo descreve a mistura de amebas com bactérias.</li>
	<li>Para ensaiar a virulência das células planctônicas, misture 10 µ l de células de ameba da etapa 2.10 com 10 µ l de bactérias planctônicas da etapa 3.5. Nota: Não lave as células cultivadas axenically ameba (em um OD de600 de 0,2-0,5) antes de misturar com as bactérias. Não há crescimento de Escherichia coli será observado na cultura ameba devido ao uso da solução de antibiótico antimicótico.</li>
	<li>Imediatamente, coloque a almofada de ágar de calceína-AM de 1,5 x 1,5 cm da etapa 4.5 em cima a mistura de bactérias-ameba na superfície do prato de Petri. Nota: Coloque a almofada de ágar em cima a mistura usando um movimento rápido e suave. Não inferiores a almofada lentamente na mistura como este movimento tende a empurrar as células em direção a periferia e longe da parte de baixo da almofada. Esta etapa irá garantir que as bactérias e as amebas são uniformemente misturado, imobilizada e que os dois tipos de células estão confinados ao mesmo plano.</li>
	<li>Remova o excesso de líquido pipetando suavemente para fora de qualquer líquido restante em torno do bloco de ágar. Permitir que a placa de Petri secar por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Cubra com o prato de Petri com uma tampa e incubar a mistura de ameba-bactérias imobilizadas em temperatura ambiente por um adicional 40 min. prosseguir para a etapa 6.1. Nota: É importante incubar todas as amostras para a mesma quantidade de tempo, como o plano de fundo da fluorescência aumenta ao longo do tempo. Recomenda-se um tempo de incubação de 1 h. Incubação por mais de 1h é menos reprodutível como células de amebas podem começam a estourar.</li>
</ol>6. microscopia - aquisição de imagem
<ol><li>Amebas de imagem usando um microscópio de fluorescência, capaz de adquirir imagens de fluorescência brightfield e verde. Para fluorescência verde, use filtros de proteína (GFP) fluorescência verde com 474/27 nm e 525/45 nm de excitação e emissão, respectivamente. Use um objectivo de (≥0.3 abertura numérica) X 10 para as amebas de imagem. Nota: O calceína-AM em agar causará amebas morrendo de fluorescência no canal de fluorescência verde. Amebas saudáveis, caso contrário não são fluorescentes.</li>
	<li>Ajuste os tempos de aquisição para o contraste de fase, canais GFP limitar fototoxicidade e otimizar a gama dinâmica das intensidades da imagem. Se necessário, substitua o contraste de fase de contraste (DIC) de interferência diferencial. Nota: Use exposições de 100-200 ms para contraste de fase e fluorescência de GFP, se possível. Manter as configurações de exposição e instrumento inalteradas ao longo de todo o experimento. Isto é crítico para o cálculo do índice de matar o hospedeiro.</li>
	<li>Adquira imagens pelo menos 100 células de ameba a fim de obter boas estatísticas para calcular o host índice de mortes.</li>
</ol>7. análise e índice de mortes de Host de imagem
<ol><li>Realizar análise de imagem usando o ImageJ.</li>
	<li>Abra o arquivo de imagem de contraste de fase em ImageJ clicando no arquivo | Abra e selecionar a imagem. Ajustar o limite clicando na imagem de | Análise | Limiar de. Ajuste o limite superior e inferior para selecionar somente o pico de intensidade(Figura 3).</li>
	<li>Converter a imagem para binário clicando processo | Binário | Tornar binário. Preencher os buracos, selecionando processo | Binário | Preencher os buracos. Nota: Usando a imagem na Figura 1 como a fonte, etapas 7.1-7.2 produzirá uma imagem na qual as amebas e bactérias conectado à superfície aparecem como regiões escuras (Figura 3B).</li>
	<li>Certifique-se de que as caixas da área e quer dizer valor cinza são verificadas em Analyze | Definir medidas. Medir o tamanho aproximado das amebas, selecionando a ferramenta oval na barra de ferramentas principal. Clique em analisar | Medida e observe a área de amebas representativas.</li>
	<li>Criar máscaras para as amebas clicando Analyze | Analisar as partículas. Na caixa tamanho, digite a área que irá incluir as amebas mas excluir as bactérias. Selecione máscaras na barra de menus dropdown para a opção de mostrar. Certifique-se de que a caixa Adicionar ao Gerenciador é verificada.</li>
	<li>Clique Okey e uma imagem mostrando apenas as amibas e um gerente de ROI diálogo aparecerá (Figura 3C).</li>
	<li>Abra a imagem de fluorescência usando arquivo | Abra e selecionando o arquivo apropriado. Selecione todas as regiões no ROI Manager mantendo pressionada a tecla Shift e clicar em cada região na lista (Figura 3-D).</li>
	<li>Clique no botão de medida no ROI Manager. Isto irá abrir uma janela de resultados, exibindo o valor de intensidade média de cada ameba.</li>
	<li>Copiar os valores de fluorescência para cada ameba em um programa de planilha e calcular o host matando o índice, tendo a média de todos os valores de fluorescência.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um método rápido e quantitativo para ensaio de virulência em p. aeruginosa. Este protocolo pode ser testado com outras bactérias. No entanto, é importante ter em mente que o meio de crescimento deve ser compatível com as condições de crescimento de ameba. Em particular, otimizamos o protocolo usando PS:DB como meio de crescimento bacteriano. Se forem utilizados outros meios de comunicação, pode ser necessário realizar um controle de somente mídia de crescimento em que não há nenhuma célula bacteriana presente para verificar se o meio é compatível com as amebas.
Esse método pode ser expandido para ensaiar a dependência de fase de crescimento da virulência. Em particular, culturas bacterianas podem ser crescidas para uma ampla gama de vezes em vez de um ponto fixo de tempo. Em nossa experiência, é importante para a colheita de culturas bacterianas em pontos específicos de tempo como virulência em p. aeruginosa parece ser dependente da fase de crescimento. Observamos que a virulência em p. aeruginosa foi induzida entre 6-8 h de crescimento em placas de Petri.
Muitas variáveis associadas ao ambiente de crescimento afetam a saúde do hospedeiro e virulência bacteriana. Assim, é importante usar controles adequados em positivos e negativos para cada experimento. Nós usamos conectado à superfície do selvagem-tipo p. aeruginosa como um positivo controle e Δúltima como controlo negativo. Sugerimos realizar esses controles cada vez que o ensaio de virulência é executado. Esses controles são importantes para verificar que mortes de pilha de anfitrião não são devido a quaisquer fatores externos tais como a idade das amibas, as variações de temperatura, etc. além disso, sugerimos que executar todas as experiências em replicar biológica para estabelecer a reprodutibilidade dos fenótipos de virulência.
Já realizamos nossos experimentos usando amebas na densidade óptica de 0,2-0,5 após uma diluição de no mínimo 01:10 e ter regulado a temperatura da cultura de amebas precisamente a 22 ° C. Fora dessas condições de crescimento, nós encontramos que a susceptibilidade de amebas para bactérias virulentas e a reprodutibilidade do ensaio virulência sejam alteradas. Células de ameba pelota relativamente rapidamente. Certifique-se de que as culturas são resuspended pipetando acima e para baixo, imediatamente antes de feita a medição da densidade óptica. Não crescem as culturas de ameba superiores uma densidade de600 OD de 1 como crescimento a altas densidades afeta a reprodutibilidade do experimento. Propaga as culturas axénica para não mais de 1 semana. Além disso, é importante verificar que as amebas são cultivadas axenically (começando na etapa 2.7) através de 20 X ou microscopia de alta magnificação que outros micróbios não estão presentes na cultura. Se as culturas são turvas na etapa 2.10 após 2 dias de crescimento após inoculação inicial, isto provavelmente indica a presença de contaminantes microbianos. Se houver suspeita de contaminação bacteriana, sugerimos que 1 mL da cultura a 37 ° C para 4-8 h as amebas a crescer. A observação de uma cultura turva sob estas condições gostaria de sugerir contaminação bacteriana. Se repetiu a contaminação bacteriana é observada, a antibiótico antimicótico solução deve ser substituída.
O índice de mortes de acolhimento é um indicador fiável de saber se uma população bacteriana é virulenta ou avirulentas. Este ensaio não foi otimizado para comparações entre diferentes níveis intermediários de virulência (i.e., baixa virulência em comparação com a média-baixa virulência) e excesso de interpretação dos resultados deve ser evitada. Métodos possíveis para resolver esse problema são a repetição do ensaio virulência ao longo de vários dias usando diferentes lotes de células hospedeiras para estabelecer a confiança nos resultados, realizando experiências adicionais de replicar e desempenho adequado análises estatísticas.
A multiplicidade de infecção (MOI) de células planctônicas pode ser controlada por normalizar a densidade óptica da cultura bacteriana. No entanto, este ensaio não controla o MOI de células de bactérias conectado à superfície. Temos observado que a densidade de superfície bacteriana aumenta com o tempo. Assim, ajustar o tempo de crescimento na prato de Petri pode resultar em uma mudança correspondente na densidade de superfície. Além disso, a densidade da superfície depende do material da superfície. Células de p. aeruginosa anexar para superfícies poliestireno no ensaio descrito aqui. No entanto, outras superfícies, incluindo vidro, ágar e poliacrilamida também podem ser analisado13. A densidade da superfície das populações bacterianas de camada única pode ser medida usando 100 X microscopia de fase de ampliação. Se a superfície densidades são multi-camadas, microscopia confocal pode ser apropriada.
Aqui, descrevemos um método rápido e robusto para medir a virulência bacteriana. Modificando os parâmetros individuais tais como tempos de incubação, o corante fluorescente, a estirpe bacteriana, o tipo de célula do hospedeiro ou mídia de crescimento, esse método pode ser prorrogado para quantificar a virulência em uma ampla gama de organismos e as condições de crescimento.

Infecção bacteriana é uma das principais causas de mortalidade em humanos e animais,1,2. A capacidade de medir a virulência de bactérias em culturas ou biofilmes é importante em contextos de cuidados de saúde e pesquisa. Aqui, descrevemos um método relativamente simples, rápido e versátil para quantificar a virulência bacteriana. O organismo eucariótico Dictyostelium discoideum (ameba) é usado como o organismo hospedeiro do modelo. D. discoideum tem sido usado como um host para identificar fatores de virulência em Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 e outras bactérias6,7 ,8 e é suscetível a em grande parte os mesmos fatores de virulência que matam células de mamíferos incluindo tipo III secreção9,10. Ensaios de virulência anterior usando d. discoideum envolveram exposição prolongada de bactérias com células de d. discoideum ao longo de horas3,4,5. O protocolo, aqui, apresenta um método rápido de determinar a virulência usando essa ameba. Este protocolo (Figura 1) descreve como: (1) crescem as amebas axenically (na ausência de bactérias), (2) crescer bactérias para o ensaio, (3) preparar as bactérias e células hospedeiras para microscopia, (4) realizar microscopia de epifluorescência e (5) analisar ameba fluorescência.
Amebas são inicialmente listradas fora dos estoques congelados e crescidas em um gramado de Escherichia coli (e. coli), onde as amebas produzem esporos. Estes esporos são escolheu e inoculados em um meio enriquecido para o crescimento axénica. As amebas são mantidas através de crescimento axénica em condições ricas em nutrientes até que estejam prontos para serem misturados com as bactérias para a avaliação de virulência bacteriana. A sobrevivência ou a morte das amebas é quantificada pela medição da fluorescência de calceína-acetoximetil (calceína-AM), que é clivada por esterases intracelulares e, desse modo, ativado por fluorescência11,12. Ao vivo amebas apresentam pouca ou nenhuma fluorescência Considerando que salientou e células morrendo brilham intensamente. Este resultado é devido a uma pequena ou nenhuma incorporação de calceína-AM em amibas saudáveis e incorporação e clivagem do substrato em amibas estressado13. Esse comportamento é notavelmente diferente da fluorescência de calceína-AM em células de mamíferos11,14,15,16.
Bactérias que serão avaliadas para virulência são cultivadas separadamente. Aqui, descrevemos como medir a virulência do patógeno oportunista p. aeruginosa e detalhe como quantificar a virulência de planctônica (natação) e as subpopulações conectado à superfície. Este protocolo pode ser adaptado para testar a virulência de outras bactérias. Na seção de resultados de representante, mostramos que virulência é ativada nas células conectado à superfície e baixa em células planctônicas, que foi relatado anteriormente13. Virulência-ativado conectado à superfície de p. aeruginosa mata amebas enquanto não-virulenta células planctônicas são consumidas pelas amebas. Se a virulência das bactérias planctônicas unicamente está sendo analisada, as bactérias podem ser cultivadas em tubos de cultura comum, ao invés de usar placas de Petri, conforme descrito no protocolo.
O crescimento das amebas e p. aeruginosa culturas deve ser coordenado, tal que p. aeruginosa culturas alcançar a fase de crescimento pretendido enquanto as amebas estão crescendo no estado estacionário em condições ricas em nutrientes. Esta condição geralmente requer culturas amebas para ser diluído pelo menos 1 dia antes de quando eles são misturados com bactérias. Amebas e bactérias são imobilizadas usando almofadas de ágar, são incubadas co por 1h e fotografaram usando uma resolução baixa (10 X, abertura numérica 0.3) filtra proteínas fluorescência objetiva, verde (GFP) e uma câmera de imagens. Análise pode ser realizada usando disponível gratuitamente software ImageJ ou personalizado software de análise de imagem. Nossa análise foi realizada usando nosso próprio software escrito usando um pacote de análise científica13. O software deve criar uma máscara usando a imagem de contraste de fase e extrair valores de fluorescência das áreas mascaradas na imagem de fluorescência. Valores de fluorescência são calculados pelo menos 100 células, resultando em um índice de mortes de anfitrião numérica.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

Ensaios de virulência bacteriana tradicionais envolvem exposição prolongada de bactérias ao longo de várias horas para células hospedeiras. Durante este tempo, as bactérias podem sofrer alterações na fisiologia devido a exposição ao ambiente de crescimento de host e a presença de células hospedeiras. Desenvolvemos um ensaio para avaliar rapidamente o estado de virulência de bactérias que podem minimizar a extensão a que as bactérias crescem na presença de células hospedeiras. As bactérias e as amebas são misturadas e imobilizadas em um avião de imagem usando um bloco de ágar. O procedimento usa imagens de fluorescência de célula única com calceína-acetoximetil éster (calceína-AM) como um indicador da saúde de célula do hospedeiro. A fluorescência das células do hospedeiro é analisada após 1 h de exposição das células do hospedeiro para bactérias usando microscopia de epifluorescência. Software de análise de imagem é usado para calcular um índice de mortes do anfitrião. Este método tem sido usado para medir a virulência dentro planctônicos e conectado à superfície Pseudomonas aeruginosa sub-populações durante o estágio inicial de formação de biofilme e pode ser adaptado para outras bactérias e outras fases de crescimento do biofilme. Este protocolo fornece um método rápido e robusto de virulência de medição e evita muitas das complexidades associadas ao crescimento e manutenção de linhas de células de mamíferos. Fenótipos de virulência medidos aqui usando amebas também foram validados usando macrófagos de rato. Em particular, este ensaio foi usado para estabelecer essa virulência de upregulates acessório superfície em p. aeruginosa.

Nós crescemos selvagem-tipo p. aeruginosa esforçar PA1419 ou um Δúltima estirpe20 no mesmo fundo PA14 em pratos de Petri 6 cm de diâmetro e analisada a virulência das células planctônicas e conectado à superfície. Culturas foram inoculadas de single-colônias em culturas PS:DB, crescidas durante a noite em tubos de cultura em um tambor de cilindro, a 37 ° C, a saturação, diluído 1: 100 em PS:DB, cultivado para 8 h em pratos de Petri 6 cm de diâmetro a 100 rpm, a tremer e planctônicos e conectado à superfície As subpopulações de p. aeruginosa foram isoladas, conforme descrito na seção 3.
Conectados à superfície selvagem-tipo p. aeruginosa matou as amebas, que foi indicado por uma forma de célula de ameba redondo e a observação da fluorescência de calceína (Figura 4A, painel superior esquerdo). Isto resultou em um índice de mortes de anfitrião alta (Figura 4B). Células planctônicas foram consumidas pelas amebas, que foi indicado por formas de célula ameba amorfo e a observação da fluorescência de calceína pouca ou nenhuma acima de fundo (Figura 4A, canto superior direito do painel). Isto resultou em um índice de mortes de acolhimento relativamente baixa (Figura 4B). Tanto conectado à superfície e células planctônicas da estirpe Δúltima foram consumidas pelas amebas, que foi indicado pelo host baixa matando índices (Figura 4B, painel inferior). Os resultados mostram assim que virulência é upregulated em populações conectado à superfície e a última é necessária para a virulência de superfície está ativado, o que foi descrito anteriormente a13. Estas experiências assim estabelecem robustos controles positivos e negativos para experiências futuras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig1.jpg"> Figura 1 : Esquema descrevendo uma visão geral do ensaio virulência. (1) células do hospedeiro ameba são cultivadas, culturas (2) bacterianas são cultivadas, e (3) planctônicas ou conectado à superfície de células bacterianas são misturadas com amebas e imobilizadas no mesmo plano de imagem usando um bloco de ágar. Células hospedeiras são quantificadas para saúde usando calceína-AM, microscopia de fluorescência e análise de imagem. Barras de escala representam 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig2.jpg"> Figura 2 : Ameba esporos sobre uma placa de Petri GYP 10 cm-diâmetro após 5 dias de crescimento. Forma de esporos acima da superfície da placa de Petri. A inserção mostra uma visão ampliada de uma única seção da superfície do prato. A superfície pode conter bactérias que não podem ser discernidas a esta resolução. Barras de escala principal e inserir imagens representam 1 cm e 2 mm, respectivamente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig3.jpg"> Figura 3 : Análise de dados de microscopia usando o ImageJ de imagem. (A) seleção do pico de intensidade usando a ferramenta de limiar. (B) imagem de resultante após a imagem de origem de contraste de fase da Figura 1 é convertida em uma imagem binária. (C) resultando imagem depois que a imagem é posteriormente convertida em uma máscara. (D) Screenshots da seleção de regiões de interesse usando o Gerenciador de ROI. Barras de escala representam 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig4.jpg"> Figura 4 : Resultados representativos de ameba matando por células de p. aeruginosa . (A) fluorescência de calceína-AM sobreposta em imagens de microscopia de fase e (B) anfitrião matando índices conectado à superfície ou planctônicos selvagem-tipo ou Δúltima p. aeruginosa. Conectados à superfície do selvagem-tipo p. aeruginosa mata as amebas, que apresentam fluorescência calceína significativa e, portanto, um significativo host matando o índice. Células planctônicas são consumidas por amebas, que apresentam fluorescência de calceína pouco e produzem um índice de assassinato de baixo anfitrião. Tanto conectado à superfície e planctônicos Δúltima são consumidos por amebas e resultam em um índice de assassinato de baixo anfitrião. Escala barras representam 50 µm. barras indicam a média de três experimentos independentes e erros barras indicam o desvio padrão. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57844/57844fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a virulência das bactérias planctônicas ou conectado à superfície usando d. discoideum (ameba) como um host. Virulência é medida durante um período de 1h e anfitrião matando é quantificada usando análise de imagem e de microscopia de fluorescência. Vamos demonstrar a este protocolo utilizando a bactéria p. aeruginosa.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K visualizações.  University of California. Aqui, apresentamos um protocolo para medir a virulência das bactérias planctônicas ou conectado à superfície usando d. discoideum (ameba) como um host. Virulência é medida durante um período de 1h e anfitrião matando é quantificada usando análise de imagem e de microscopia de fluorescência. Vamos demonstrar a este protocolo utilizando a bactéria p. aeruginosa.

Vídeo: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Imunologia e Infecção

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Rastreamento e quantificação de longo prazo da motilidade das espécies de Acanthamoeba

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Estudando o comportamento de Acanthamoeba para desenvolver estratégias direcionadas para prevenir a ceratite por Acanthamoeba

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Tratáveis mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Resumo

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Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Tratáveis mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias