Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Bu eser İngiliz kalp Vakfı, Richard Bright VEGF araştırma güven ve MRC tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up bu fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme gerçekleştirilmesi gerektiğini açıklar. Her yöntemin kritik adımlarda glomerular işlevi, böbrekler geçirgenliği (uACR ve plazma kreatinin ölçümleri), bir bütün olarak değerlendirilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için izin geçirgenliği bireysel glomeruli (glomerular LpA / Vben), yapısal değişiklikler (PAS, Trichrome mavi ve EM) protein yerelleştirme (Eğer) ve glomerular gen ekspresyonu (RT-PCR ve Western blot). Bu yöntemler fare modelleri böbrek hastalığının glomerular işlevinde tam değerlendirilmesi anahtarıdır.
GFB geçirgenliği değerlendirirken konvansiyonel uACR veya 24 h albümin atılımı oranı etkili ölçü17,18kullanmak için birçok çalışma seçtiniz. Bu teknikler olanak GFB geçirgenliği bir bütün olarak değerlendirilmesi, ancak bu bireysel glomerular geçirgenliği değerlendirme ve glomeruli arasında varyasyon için izin vermiyor. Önceki çalışmalarda glomerular LpA ölçümü bulduk / Vi GFB geçirgenliği5,9değişikliklere daha duyarlı bir önlem olarak. Nitekim, bu yazıda gösterdi temsilcisi sonuçlarında 14 hafta VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-165b fareler VEGF-A KO fareler için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük bir uACR var A indüksiyon sonrası; Ancak, bu sonuç glomerular Lpiçinde A yansıtılmamış / nerede VEGF-A165b önemli ölçüde engel olmayın Vben ölçümleri, GFB geçirgenliği (resim 1 ve Şekil 2)5' te artırır. Bu böbrek geçirgenliği ve bireysel glomeruli geçirgenliği değerlendirmek için birden fazla deneyleri kullanmanın önemini gösterir. Ayrıca, glomerular LpA / Vben oncometric tahlil öneriyor aynı böbrek üzerinden bireysel glomeruli geçirgenliği büyük ölçüde değişebilir, özellikle içinde hastalık modelleri5,10, 19. glomerular LpA ölçme için bir sınırlama / Vben onu yalnızca deneysel son nokta; gerçekleştirilebilir Böylece, normal uACR ölçümleri deneysel son nokta bir göstergesidir için gereklidir.
Fonksiyonel fenotip değerlendirme ek olarak, mevcut yöntemi de yapısal ve ultrastructural fenotip değerlendirilmesi teşvik eder. Bu yapılabilir gibi PAS, trichrome, lekeleri ve gümüş lekeleri; bir seçim kullanma Her glomerular morfoloji farklı yönlerini değerlendirmek için. Kez fare modelleri için geçerli, glomerular hastalığın akut modellerinde olduğunu eğitimli bir böbrek patolog olmadıkça bu lekeler kullanarak büyük yapısal anormallikler tespit etmek zor olabilir. Bu nedenle, EM taşıyan GBM, endotel fenestrae boyutu ve sayısı ve podocyte özellikleri gibi parametreleri nicel ölçüm sağlar GFB ultrastructure değerlendirmek için önerilmektedir. Böyle ölçümleri gerçekleştirmek için minimum eğitim gerektiren ve hücre-türleri/yapıların bir hastalığı modelinde etkilenen belirlemek için Dedektif sağlar. Glomerular hastalığın hafif bir model olmak için VEGF-A KO fare bulundu temsilcisi sonuçlarında gösterilen örnekte, böylece, hiçbir büyük yapısal anormallikler PAS boyama üzerine hazır bulundu. Ancak, podocyte özgü VEGF-A KO GBM, podocytes ve endotel hücreleri değişiklikler glomerular ultra-yapısı5incelerken neden. Ne yazık ki, mevcut yönteminde açıklanan EM böbrek hazırlanması da GFB19geçirgenliği üzerinde önemli etkileri olduğu bilinmektedir endotel glycocalyx tespiti etkinleştirmez. Doğru glycocalyx derinlik ölçmek için böbrek Oltean ve ark19' açıklandığı gibi sıvı-sabit % 2.5 oxazolidin endotel glycocalyx etiketleme için % 1 Alcian mavi ile olmalıdır.
Fonksiyonel ve yapısal fenotip değerlendirildi sonra farklı genler ve yollar ifade/harekete geçirmek şekillerinin sonra glomeruli özel olarak tespit edilebilir. Önceki Ultra yapısal değerlendirme türleri/glomerular yapıları dahil, podocyte veya endotel özel genler/yollar muayene olup olmadığını gösteren hücre ile ilgili biraz bilgi verebilir misiniz. Örneğin, VEGF-A KO fareler temsilcisi sonuçlarından, (şekil 3D) endotel fenestrae numarasını bir azalma gözlenmiştir; Bu nedenle, VEGF-A yolu dahil olmak için bilinen bir endotel işaretleyici glomerular protein ifadesi incelenmiş; VEGFR-2 (Şekil 4B)5. Proteinlerin glomeruli ifadesi ek olarak, onların yerelleştirme da kullanarak görüntülenmeyecektir. Eğer artan GLUT1 ile podocin ortak yerelleştirme Zhang ve ark20tarafından bir çalışmada, podocytes tarafından yapılan GLUT1 podocyte özgü overexpression teyit edildi.
Glomerular işlevini değerlendirmek için literatürde sunulan alternatif yöntemleri ile karşılaştırıldığında fare modelleri glomerular hastalığı böbrek işlevinde değerlendirmek için bu kağıt belirtilen yöntem kullanımı tamamen üzerinden değerlendirilmek üzere glomerular fenotip sağlar. birden çok yönleri. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirmek mümkün. Mekanizması bu hayati bilgileri hastalığının bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gereklidir. Bu yöntem kolayca hastalık fenotipleri ve potansiyel tedavi glomerular işlevi her iki değerlendirme içine gelecek araştırmalar için uygulanabilir.
Sonuç olarak, bir tam böbrek iş-up fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme için bu genel ve uyarlanabilir protokolünü açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

İnsan böbrek hastalığı taklit etmek için fare modelleri kullanımını giderek yaygın hale geliyor. Fare modelleri gibi kendiliğinden hipertansif fareler (SHR)1, streptozotocin (STZ) spontan modelleri içerir-indüklenen diyabetik sıçan ve fareler2ve db/db yazın II diyabetik farelerin3, genetik modeller gibi birincil podocyte özgü fokal segmental glomerular skleroz (FSGS)4, podocyte özgü vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) modeli5, modeller ve Alport sendromu6modelleri ve elde 5/6 nefrektomi7 ve tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) model8gibi modelleri. Bu modeller glomerular işlevinde farklı yönlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Böbrek hastalığı fare modellerinde glomerular işlevi tam olarak değerlendirmek için gerçekleştirilmesi gereken kapsamlı bir iş-up göstermek için bu yöntemi kağıt amacı budur.
Bu yöntemin kullanılması arkasındaki mantığı birden çok yönleri tam olarak değerlendirilecek glomerular fenotip sağlar olduğunu. Bu glomerular geçirgenliği, protein ve su, glomerular yapısal anormallikler ve ifade/yapıştırma mRNA'ların ve proteinler normal glomerular fonksiyonu için temel değişiklikler için değerlendirme içerir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirmek mümkün. Bu hastalığın bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gerekli olan mekanizma üzerinde hayati bilgi yok.
Literatürde, glomerular hastalığı fenotip idrarda albümin artan bir düzeyde tarafından belirlendiği yerde bir fare modeli ile sunulmak üzere ortak bir durum. Ancak, glomerular işlevi belirlemek için tek bir yöntem her zaman etkili değildir önermek kanıt yoktur; üriner albümin atılımı oranı ya da üriner albümin kreatinin oranı (uACR) ölçme sadece toplam böbrek fonksiyonları üzerine ve bilgiler değil, bireysel glomeruli sağlar. Önceki çalışmalarda geçirgenliği farklı glomeruli aynı böbrek5,9,10değişebilir gösterdi. Buna ek olarak, bireysel glomeruli geçirgenliği değerlendirilmesi glomerular işlevi değerlendirme, daha duyarlı bir yoludur; bireysel glomerular Su geçirgenliği ölçüm tekniği (LpA / Vben) glomerular işlevinde uACR9ölçme daha değişiklikler daha duyarlı olmak göstermiştir. Bu tahlil fare modelleri dirençli proteinüri, bu c57BL/6 arka plan11gibi için bu faydalıdır. Mevcut yöntemi kağıdın hem toplam böbrek geçirgenliği albümin için hem de bireysel glomerular geçirgenliği su inceliyor avantajdır.
Glomerular yapısal anormallikler incelenmesi kez lekeleri gibi periyodik asit Schiff (PAS), trichrome, ve gümüş lekelerin bir pil tarafından değerlendirilir. Bunlar bir skor yöntemi ile böbrek hastalığı düzeyini değerlendirmek eğitimli bir böbrek patolog etkinleştirin. Her ne kadar tüm iyi yöntemleri, glomerular makro yapısındaki değişikliklerden her zaman içinde gözlenir değil akut böbrek yaralanma12modelleri. Bu yöntem yukarıda açıklanan böbrek Histoloji teknikleri yerine getiren ek olarak, glomerular ultra-yapısı da elektron mikroskobu (EM) değerlendirilmek ki öneriyor. Lekeli glomerulus nispeten normal ışık mikroskop altında normal bakabilirsiniz; Ancak, EM, glomerular membran (GBM) genişliğinde küçük değişiklikler ile değerlendirmesi üzerine podocyte ayak işlem efasman, endotel fenestrations ve alt-podocyte alan kapsama analiz. Bu nedenle, glomerular ultra-yapısı ve mikro-yapısı değerlendirildi da glomerular disfonksiyon mekanizmasının belirlemek için hayati önem taşımaktadır.
Glomerular yapısal anormallikler değerlendirme ek olarak, mRNA ve protein ifade ve yapıştırma yanı sıra protein harekete geçirmek (Örneğin, fosforilasyon) değişiklikleri daha da glomerular hastalığı mekanizmaları aydınlatmak için incelenmesi gerekir. Glomerular hastalığı ararken veya örneğin, KO/aşırı-expressing bir gen glomerular hücreleri, örneğin podocyte özgü VEGF-A KO fare5' i gibi özellikle de bu protein ve mRNA değişiklikleri yalnızca içinde incelenir önemlidir glomerular hücreler ve değil bütün böbrek. Bu iletişim kuralı glomeruli fare böbrek korteks izole edilmiştir ve sonra protein/RNA izole bir yöntem açıklanır. Bu hastalık modeli glomeruli içinde protein/mRNA bozukluk belirli analiz sağlar.
Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up bu fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme gerçekleştirilmesi gerektiğini açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

<table><tbody><tr><td>Metabolic Cages</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Substrate solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Sulphuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater stabilisation solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% precast protein gel</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Sample buffer</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot cell</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris running buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Blood Collection tubes</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Needle</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Glass Vial</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tissue Molds</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Surgical Disection Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td><td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sieves</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>e.g. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Cell Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF Substrate for Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Light Miscroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysis Software</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

İnsan böbrek hastalığı taklit etmek için fare modelleri kullanımını giderek yaygın hale geliyor. Bizim araştırma diyabetik nefropati ve podocyte özgü VEGF-bir knock-out fareler glomerular işlev değerlendirmesi üzerine odaklanmıştır; Bu nedenle, bu protokol tam böbrek iş-up bizim laboratuarımızda glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme bu fare modelleri değerlendirmek için kullanılan açıklar. Glomerular işlevini değerlendirmek için literatürde sunulan alternatif yöntemleri ile karşılaştırıldığında glomerular fenotip birden çok yönleri tam olarak değerlendirilmek üzere bu makalede açıklanan yöntemi kullanımını etkinleştirir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirin. Mekanizması bu hayati bilgileri hastalığının bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gereklidir. Glomerular filtrasyon bariyer ölçüm üriner albümin kreatinin oranı ve bireysel glomerular Su geçirgenliği hem yapısal ve ultra yapısal muayene ile ayrıntılı işlevsel değerlendirme yöntemleri izin Periyodik asit Schiff leke ve elektron mikroskobu kullanarak. Ayrıca, genlerin dysregulated mRNA ve protein düzeyinde analizini glomerular işlevinin mekanik çözümleme sağlar. Bu iletişim kuralı glomerular hastalığı tüm fare modelleri için uygulanan yöntemler genel ancak uyarlanabilir özetliyor.

İdrar toplanan metabolik mağaraları vahşi türü (WT), indüklenebilir podocyte özgü VEGF-A knock (VEGF-A KO) dışarı ve VEGF-A KO X Neph-VEGF165b fareler tarafından kullanarak (insan VEGF-A165b izoformu içinde podocytes içinde aşırı hızlı VEGF-A KO fareler bir Kurucu şekilde). Ölçümü üriner albümin kreatinin oranı 0, 4, 10 ve 14 hafta sonra doksisiklin indüksiyon VEGF-A KO VEGF-A KO fareler ilerici albuminuria 10 WT littermate kontrollere göre hafta tarafından geliştirilmiştir. Mutlak değerler Şekil 2Ave temel bir Şekil 2Bher fare değerleri normalleştirilmiş görülebilir. Ancak, albuminuria içinde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b fareler (resim 2), gözlenen değil o VEGF-A165gösteren b albuminuria5modelde koruyucudur.
Glomerular LpAVben bireysel glomeruli WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b böbrekler elenmiş olarak ölçüldü. Ne zaman perifused % 8 BSA ile 3A rakamgösterilir nasıl bir glomerulus yakalanıyor ve büzülme örneği görülmektedir. Bu büzülme sonra glomerular LpA belirlemek için kullanılan / Vben her glomerulus (Şekil 3B) için. VEGF-A KO fareler vardı bir önemli ölçüde artış glomerular LpA / Vben 14 haftalık WT kontrol glomeruli için karşılaştırıldığında VEGF-KO indüksiyon post. Daha düşük olmasına rağmen farelerde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, artan glomerular LpA / Vben değil VEGF-A165b 14 hafta5aşırı ifade tarafından engel.
PAS böbrek korteks bölümlerini 14 hafta sonra VEGF-A KO indüksiyon boyama glomerular yapısal anormallikler farelerde VEGF-A KO veya VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Şekil 4A) olmadığını göstermiştir. Ancak, analiz üzerinden EM glomerular ultra yapısının VEGF-A KO fareler bir artan GBM genişliği geliştirilen, endotel fenestrae sayısı azalmıştır, SPS kapsama azalmıştır ve ortalama podocyte yarık genişliği arttı (Şekil 4 c-4F ). Ortalama podocyte ayak genişliği ve yırtmaçlı değişmemiştir (Şekil 3B ve 3 G) sayısı işlem. VEGF-A165b VEGF-A KO farelerde aşırı ifade değişiklikleri için GBM engelledi ve genişliği (Şekil 4 c ve 4F) kesti. Ancak, VEGF-A165b değişmiş fenestrae numarası ve SPS kapsama (Şekil 4 d ve 4E)5üzerinde bir etkisi vardı.
RT-PCR süzülen glomeruli çıkarılan RNA üzerinde gerçekleştirilen insan VEGF-A165b mRNA sadece VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b fareler (5A rakam) mevcut saptandı. Protein süzülen glomeruli ve Western blot yoluyla protein düzeyleri değerlendirmek ayıklanan VEGFR-2 glomerular protein ifadesi VEGF-A KO fareler, azaltılan hangi VEGF-A165b ( aşırı ifade tarafından engellendi bulundu Şekil 5B ve 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Şekil 1. Grafiksel kurulum glomerular geçirgenliği (LpA) teçhizat. (A) glomerulus yakaladı (B) üzerinde emme kullanarak bir tutucu içinde micropipette, hangi istikrar için bir takma üzerine sabitlenmiş. (C) dikdörtgen microslide. (D) 4 X amacı, bir video kamera ile mikroskop. (E) % 1 BSA çözüm 37 ° C'ye ısıttı. (F) % 8 BSA çözüm 37 ° C'ye ısıttı. (G) uzaktan dokunun taşıyan iki perifusate içeren satırların, hızlı perifusate Satım izin veren. (H) rotanın glomerulus Hidromasajlı Küvet microslide doğru perifusate. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Şekil 2. Üriner albümin kreatinin oranı. (A) 0, 4, 10 ve 14 hafta sonra VEGF-A KO indüksiyon WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde uACR değerlerinde. (B) her bireysel fare temel değerine (hafta 0) aynı uACR değerleri normalleştirilmiş. UACR anlamlı bir artış VEGF-A KO fareler hafta 10 ve 14 WT littermate kontrollere, VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde engelledi göre (* p < 0,05; İki yönlü ANOVA, düzeltme çiftleri arasında karşılaştırma için; n = 4-12 fareler her zaman noktası; hata çubukları: standart hata ortalamaya [SEM]). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Şekil 3. Glomerular Su geçirgenliği ölçümü. (A) glomerulus emme; üzerinden micropipette üzerinde yakaladı perifusate % 1 BSA (AI) % 8 BSA (bütün) açık olduğundan ve glomerular büzülme görülmektedir. (B) önce ve % 8 BSA geçiş sonrası alınan ölçümlere glomerular LpA belirlemek için kullanılır / Vben. (C) VEGF-A KO fareler geliştirmek bir artan glomerular LpA / Vben 14 haftalık indüksiyon WT kontrollere göre VEGF-A KO post. Bu önemli ölçüde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde engellendi değil (* p < 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 4-9 fareler, 15-30 glomeruli; hata çubukları: SEM). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Şekil 4. Glomerular yapısal analizi. (A) PAS böbrek korteks boyama WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b fareler (AI - III)--dan glomeruli içinde yapısal anormallikler değil göstermek. EM VEGF-A KO glomeruli (AIV - VI) Ultra yapısal anormallikler ortaya koydu. (B) gruplar arasında ortalama FPW değişmedi. (C) GBM VEGF-A KO glomeruli, VEGF-A165b. fenestrae sayısı VEGF-A165b. (E) SPS kapsama tarafından değişmeden kaldı VEGF-A KO glomeruli içinde azalmıştır (D) tarafından engelleyen arttı yapıldı Ayrıca VEGF-A165b. yarık genişliği ortalama VEGF-A KO glomeruli artış oldu (F) tarafından değişmeden kaldı, VEGF-A KO glomeruli içinde azalmıştır değişmeden hangi VEGF-A165b (G) yarık numarası tarafından engellendi üç gruplar arasında (* p < 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 3 fareler, 9 glomeruli; hata çubukları: SEM). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Şekil 5. mRNA ve protein ifade işaretleri. (A) RT-PCR gösterdi insan VEGF-A165b mRNA ifade yalnızca belirgin VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b fareler üzerinden süzülen glomeruli. (B) Western blot VEGFR-2 proteini ifade VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli engelleyen aşağı VEGF-A KO glomeruli içinde düzenlenir olduğunu belirtti (* p < 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 3 - 6 fareler; hata çubukları: SEM). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

assessment-of-kidney-function-in-mouse-models-of-glomerular-disease

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Görüntüleme.  University of Exeter. Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Video: Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Farelerde Akut Böbrek Hasarı ve Post Yaralanma Fibrozis iskemi-reperfüzyon Model

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Tıp

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renal İskemi Reperfüzyon Hasarı: Yaralanma Fare Modeli ve Rejenerasyon

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Fare Böbrek Transplantasyonu: Allogreft Reddi Modelleri

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Bilinçli Kemirgenler Böbrek Fonksiyon Transkutanöz Değerlendirmesi

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Biyoloji

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Farelerde Glomerular filtrasyon transdermal ölçümü

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface glomeruli provide a unique opportunity to investigate physiological and pathophysiological processes using intravital 2-photon microscopy. Quantification of glomerular capillary blood flow and vasoconstriction and dilatation in response to drugs, permeability, and inflammation are just some of the processes that can be studied. In addition, transgenic rats, i.e., podocytes labeled with fluorescent dyes and other molecular biomarker approaches, provide increased resolution to directly monitor and quantify protein-protein interactions and the effects of specific molecular alterations.
In mice, which lack surface glomeruli after four weeks of age, unilateral ureteral obstruction (UUO) for several weeks has been used to induce surface glomeruli. As this induction model does not allow for baseline studies, we quantified the effects of UUO on glomerular processes in the UUO model in Munich Wistar Fr&#246;mter (MWF) rats, which have surface glomeruli under physiologic conditions. The UUO model for five weeks or more induced significant alterations to gross renal morphology, the peritubular and glomerular microvasculature, as well as the structure and function of tubular epithelia. Glomerular and peritubular red blood cell (RBC) flow decreased significantly (p &#60; 0.01), probably due to the significant increase in the adherence of white blood cells (WBCs) within glomerular and peritubular capillaries. The glomerular sieving coefficient of albumin increased from 0.015 &#177; 0.002 in untreated MWFs to 0.045 &#177; 0.05 in 5-week-old UUO MWF rats. Twelve weeks of UUO resulted in further increases in surface glomerular density and glomerular sieving coefficient (GSC) for albumin. Fluorescent albumin filtered across the glomeruli was not reabsorbed by the proximal tubules. These data suggest that using UUO to induce surface glomeruli limits the ability to study and interpret normal glomerular processes and disease alterations.

Here, we present a protocol using 2-photon microscopy in Munich Wistar Fromter rats with surface glomeruli to quantifythe effects of prolonged ureteral obstruction on glomerular dynamics and function.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

Hemodiyaliz Erişimi ile İlişkili El Disfonksiyonunun Bir Murine Modeli

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Mikroskopi için Temizlenmiş Fare Böbreklerinde Glomerüllerin Floresan Etiketlenmesi

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

Yazar Spotlight: Temizlenmiş Dokularda Glomerülleri Etiketleyerek Böbrek Biyolojisi Araştırmalarına Yardımcı Olmak 

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.

Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...