Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação britânica do coração, Richard Bright VEGF pesquisa Trust e o MRC.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular, permitindo uma vasta quantidade de informações sobre o rim e função glomerular para ser obtido um único rato. Os passos críticos em cada método de permitam a análise detalhada de funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, incluindo avaliação de permeabilidade dos rins como um todo (uACR e plasma medições creatinina), a permeabilidade do glomérulos individuais (glomerular LpA / V eeu), exame das alterações estruturais (PAS, Trichrome azul e EM), a localização da proteína (IF) e expressão de gene glomerular (RT-PCR e mancha ocidental). Esses métodos são a chave para a avaliação completa da função glomerular em modelos do rato da doença renal.
Ao avaliar a permeabilidade da GFB, muitos estudos optou por usar a uACR ou 24h albumina excreção taxa convencional como uma medida eficaz de17,18. Embora estas técnicas permitem apreciar a permeabilidade GFB como um todo, não permite para avaliação da permeabilidade glomerular individual e variação entre glomérulos. Estudos anteriores descobriram medição de glomerular LpA / Vi para ser uma medida mais sensível de mudanças para a permeabilidade GFB5,9. Com efeito, nos resultados do representante demonstrados neste trabalho, com 14 semanas postar indução de VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b ratos têm um uACR significativamente menor em comparação com ratos VEGF-A KO; no entanto, este resultado não é reflectido no glomerular LpA / V medições, onde VEGF-A165b não impediu significativamente aumenta no GFB permeabilidade (Figura 1 e Figura 2)5. Isso mostra a importância do uso de múltiplos ensaios para avaliar tanto a permeabilidade do rim e a permeabilidade dos glomérulos individuais. Além disso, o glomerular LpA / V oncometric ensaio sugere que a permeabilidade dos glomérulos individuais do mesmo rim pode variar muito, especialmente na doença modela5,10, 19. uma limitação para medir o glomerular LpA / V,eu é que só pode ser realizada no ponto final experimental; assim, as medições regulares uACR são obrigadas a dar uma indicação do ponto final experimental.
Além de avaliar o fenótipo funcional, o método presente também incentiva a avaliação do fenótipo estrutural e ultraestrutural. Isso pode ser feito usando uma variedade de manchas como PAS, tricromo e manchas de prata; cada para avaliar diferentes aspectos da morfologia glomerular. Em modelos agudos da doença glomerular, que é frequentemente o caso em modelos do rato, é pode ser difícil de detectar qualquer anormalidade estrutural principal usando essas manchas, a menos que você é uma patologista treinada renal. Portanto, realizando EM sugere-se para avaliar a ultraestrutura da GFB, que permite a medição quantitativa de parâmetros como o GBM, fenestras endotelial tamanho e número e características de podocyte. Tais medidas exigem treinamento mínimo executar e permite que o investigador determinar as célula-tipos/estruturas afectadas em um modelo de doença. No exemplo mostrado nos resultados representativos, o mouse VEGF-A KO foi encontrado para ser um modelo leve de doença glomerular, assim, não há anormalidades estruturais principais estavam presentes após coloração PAS. No entanto, podocyte específicos VEGF-A KO induzir alterações para o GBM, podócitos e células endoteliais ao examinar a ultraestrutura glomerular5. Infelizmente, a preparação do rim EM descrito no presente método não permitem a detecção do glicocálix endotelial, que também é conhecido por ter efeitos significativos sobre a permeabilidade da GFB19. Para medir com precisão a profundidade de glicocálix, o rim deve ser perfundir-fixo com glutaraldeído 2,5% com 1% azul de Alcian por glicocálix endotelial rotulagem, conforme descrito em Sérgio et al.19.
Uma vez que o fenótipo funcional e estrutural foram avaliados, os padrões de expressão/ativação de genes diferentes e os caminhos então podem ser avaliados especificamente em glomérulos. Prévia avaliação ultra estrutural poderia dar algumas informações sobre a célula tipos/glomerular estruturas envolvidas, indicando se podocyte ou endoteliais específicas-genes/vias devem ser examinadas. Por exemplo, nos resultados representativos dos ratos VEGF-A KO, uma redução do número de fenestras endotelial foi observada (Figura 3D); Portanto, a expressão da proteína glomerular de um marcador endotelial, conhecido por ser envolvidas na via de VEGF-A foi examinada; VEGFR-2 (Figura 4B)5. Além da expressão de proteínas em glomérulos, sua localização também pode ser visualizada usando-se. Em um estudo realizado por Zhang et al.20, podocyte específicos superexpressão de GLUT1 foi confirmada nos podócitos por se co localizando o GLUT1 aumento com podocin.
Em comparação com métodos alternativos apresentados na literatura para avaliar a função glomerular, o uso do método descrito neste artigo para avaliar a função renal em modelos do rato da doença glomerular permite que o fenótipo glomerular ser completamente avaliada de múltiplos aspectos. Usando esse método, o pesquisador é capaz de determinar o fenótipo de rim do modelo e avaliar o mecanismo quanto por que desenvolve o fenótipo. Esta informação vital sobre o mecanismo da doença é necessária quando examinar o potenciais terapêuticas avenidas nesses modelos. Esse método pode ser facilmente aplicado para futuras investigações sobre função glomerular na avaliação dos fenótipos de doença e terapêutica potencial.
Em conclusão, este protocolo genérico e adaptável descreve um rim completo check-up para os modelos do rato da doença glomerular, permitindo uma vasta quantidade de informações sobre o rim e função glomerular para ser obtido um único rato. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

O uso de modelos murino para imitar a doença de rim humano está se tornando cada vez mais comum. Tais modelos murino incluem modelos espontâneos como espontaneamente hipertensos (SHR) de ratos1, estreptozotocina (STZ)-induzida ratos diabéticos e ratos2, e o db/db tipo II ratos diabéticos3, modelos geneticamente modificados tais como primário podocyte específicas focal segmentar glomerular esclerose (FSGS) modelos4, o específico das endotelial fator de crescimento vascular (VEGF-A) nocaute (KO VEGF-A) modelo5, e a síndrome de Alport modelos6e adquiriu modelos como o de nefrectomia 5/6,7 e o modelo de obstrução ureteral unilateral (UUO)8. A fim de avaliar os diferentes aspectos da função glomerular nestes modelos, várias técnicas estão disponíveis. O propósito deste trabalho método é demonstrar um completo check-up deve ser executada em modelos do rato da doença renal para avaliar plenamente a função glomerular.
A lógica por trás do uso deste método é que ele permite que o fenótipo glomerular ser completamente avaliada de múltiplos aspectos. Isso inclui avaliar a permeabilidade glomerular, a proteína e a água, o glomerulares anormalidades estruturais e mudanças na expressão/emenda de mRNAs e proteínas essenciais para a função glomerular normal. Usando esse método, o pesquisador é capaz de determinar o fenótipo de rim do modelo e avaliar o mecanismo quanto por que desenvolve o fenótipo. Esta é a informação vital sobre o mecanismo da doença, que é necessária, ao examinar o potenciais terapêuticas avenidas nesses modelos.
Na literatura, é uma ocorrência comum para ser apresentado com um modelo do rato da doença glomerular, onde o fenótipo é determinado por um aumento do nível de albumina na urina. No entanto, há evidências que sugerem que um único método para determinar a função glomerular não é sempre eficaz; apenas medir a taxa de excreção de albumina urinária ou a creatinina urinária de albumina (uACR) fornece informações sobre a função renal total e não de glomérulos individuais. Estudos anteriores demonstraram que a permeabilidade pode variar em diferentes glomérulos do mesmo rim5,9,10. Além disso, a avaliação da permeabilidade dos glomérulos individuais é uma maneira mais sensível de avaliação de função glomerular; a técnica de medir a permeabilidade de água glomerular individual (LpA / V eeu) tem demonstrado ser mais sensível às mudanças na função glomerular do que medir a uACR9. Este ensaio é benéfico em modelos do rato que são resistentes a proteinúria, tais como os de um fundo de c57BL/611. A vantagem do papel presente método é que ele examina a total permeabilidade renal de albumina, bem como a permeabilidade glomerular individual para água.
Exame de anormalidades estruturais glomerulares é muitas vezes avaliado por uma bateria de manchas, tais como ácido periódico Schiff (PAS), tricromo e manchas de prata. Estes permitem uma patologista renal treinada avaliar o nível de doença renal, através de um método de pontuação. Apesar de todos os bons métodos, alterações à macroestrutura glomerular não são sempre observados na lesão renal aguda modelos12. Este método propõe que além de realizar as técnicas de histologia renal descritas acima, a ultraestrutura glomerular também deve ser avaliada através de microscopia eletrônica (EM). Um glomérulo manchado pode parecer relativamente normal sob um microscópio de luz normal; no entanto, após avaliação com EM, pequenas mudanças na largura da membrana basal glomerular (MBG), apagamento de processo podocyte pé, fenestrações endoteliais e a cobertura do espaço sub-podocyte é analisado. Portanto, é vital que a ultraestrutura glomerular e a microestrutura é avaliado para determinar o mecanismo da disfunção glomerular.
Além de avaliar anormalidades glomerulares estruturais, alterações em mRNA e expressão de proteínas e de emenda, bem como ativação de proteína (por exemplo, a fosforilação), devem ser examinadas para elucidar ainda mais os mecanismos de doença glomerular. Quando se olha para uma doença glomerular, ou, por exemplo, quando KO/over-expressing um gene especificamente em células glomerulares, como por exemplo o podocyte específico VEGF-A KO rato5, é importante que as alterações da proteína e do mRNA são examinadas apenas dentro do células glomerulares e não o rim. Este protocolo descreve um método em que os glomérulos são isolados do córtex renal do mouse, e então o proteína/RNA são isolados. Isto permite a análise da desregulação da proteína/mRNA em glomérulos do modelo de doença.
Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular, permitindo uma vasta quantidade de informações sobre o rim e função glomerular para ser obtido um único rato. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

<table><tbody><tr><td>Metabolic Cages</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Substrate solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Sulphuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater stabilisation solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% precast protein gel</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Sample buffer</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot cell</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris running buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Blood Collection tubes</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Needle</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Glass Vial</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tissue Molds</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Surgical Disection Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td><td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sieves</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>e.g. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Cell Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF Substrate for Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Light Miscroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysis Software</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

O uso de modelos murino para imitar a doença de rim humano está se tornando cada vez mais comum. Nossa pesquisa enfoca a avaliação da função glomerular na nefropatia diabética e podocyte específicos VEGF-A mata-mata ratos; Portanto, este protocolo descreve o rim completo check-up usado em nosso laboratório para avaliar estes modelos do rato da doença glomerular, permitindo uma vasta quantidade de informações sobre o rim e função glomerular para ser obtido um único rato. Em comparação com métodos alternativos apresentados na literatura para avaliar a função glomerular, o uso do método descrito neste artigo permite que o fenótipo glomerular ser completamente avaliada de múltiplos aspectos. Usando esse método, o pesquisador pode determinar o fenótipo de rim do modelo e avaliar o mecanismo quanto por que desenvolve o fenótipo. Esta informação vital sobre o mecanismo da doença é necessária quando examinar o potenciais terapêuticas avenidas nesses modelos. Os métodos permitem avaliação funcional detalhada da barreira de filtração glomerular através da medição da creatinina urinária de albumina e permeabilidade de água glomerular individual, bem como exame estrutural e ultra-estruturais usando o ácido periódico-Schiff mancha e microscopia eletrônica. Além disso, análise da desregulação de genes no nível de mRNA e proteína permite análise mecanicista da função glomerular. Este protocolo descreve os métodos genéricos mas adaptávelas que podem ser aplicados a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Urina foi coletada usando gaiolas metabólicas do tipo selvagem (WT), inducible podocyte específicos VEGF-A nocaute (KO VEGF-A) e VEGF-A KO X Neph-VEGF165b ratos (os ratos VEGF-A KO que excesso expressam a isoforma de b humano VEGF-A165nos podócitos em um forma constitutiva). Sobre medição de creatinina a albumina urinária em semanas 0, 4, 10 e 14 após a indução de doxiciclina de VEGF-A KO, KO VEGF-A ratos desenvolveram albuminúria progressiva por 10 semanas em comparação com controles de littermate WT. Os valores absolutos pode ser vistos na Figura 2Ae o normalizado para a linha de base de cada valores do mouse na Figura 2B. No entanto, albuminúria em não observado nos ratos b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (Figura 2), indicando o VEGF-A165b é protetora no modelo de albuminúria5.
O glomerular LpAVeu foi medido em glomérulos individuais peneirados de WT, VEGF-A KO e rins de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165. Um exemplo de como um glomérulo é detectado e o encolhimento observado quando perifused com 8% BSA é mostrado na Figura 3A. Este encolhimento é usado para determinar o glomerular LpA / V para cada glomérulo (Figura 3B). Camundongos KO de VEGF-A tinham um significativamente aumento glomerular LpA / V com 14 semanas pós indução VEGF-KO, em comparação com glomérulos de controle do WT. Embora menor em camundongos de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165, o aumento glomerular LpA / V, não foi impedido por excesso de expressão de VEGF-A165b às 14 semanas5.
Coloração de PAS de seções de córtex renal 14 semanas após a indução de VEGF-A KO não revelaram qualquer anormalidade estrutural glomerular nos VEGF-A KO ou VEGF-A X Neph-VEGF-A165b ratos (Figura 4A). No entanto, após a análise da ultraestrutura glomerular através EM, ratos VEGF-A KO tinham desenvolvido uma maior largura GBM, diminuiu o número de fenestras endoteliais, diminuição da cobertura SPS e aumentou a média podocyte fenda de largura (Figura 4-4F ). O pé de média podocyte processo de largura e número de fendas permanecido inalterado (Figura 3B e 3 G). Excesso de expressão de VEGF-A165b nos ratos VEGF-A KO impediu as alterações para o GBM e fenda de largura (Figura 4 e 4F). No entanto, VEGF-A165b não teve efeito sobre o número de fenestras alterados e SPS cobertura (Figura 4 e 4E)5.
RT-PCR, realizada na RNA extraído de glomérulos peneirados revelou que a humana VEGF-165b mRNA só está presente nos ratos VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (Figura 5A). Quando extrair proteína de glomérulos peneirados e avaliar os níveis de proteínas através da mancha ocidental, a expressão da proteína glomerular de VEGFR-2 foi encontrada para ser diminuída em camundongos VEGF-A KO, que foi impedido por excesso de expressão de VEGF-A165b ( Figura 5B e C 5)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figura 1. Diagramática configurar o equipamento de permeabilidade glomerular (LpA). (A) o glomérulo é capturado em (B) a micropipeta dentro de um suporte usando sucção, que é fixada em um monte de estabilidade. (C) microslide retangular. (D) 4 X objetivo um microscópio com uma câmera de vídeo. (E) solução a 1% BSA aquecido a 37 ° C. (F) solução a 8% BSA aquecido a 37 ° C. (G) controle remoto toque rolamento de duas linhas que contêm perifusate, que permite a troca rápida de perifusate. (H) rota de perifusate em direção a microslide, que então banha o glomérulo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figura 2. Creatinina de albumina urinária. (A) os valores uACR em semanas 0, 4, 10 e 14 após a indução de VEGF-A KO em ratos de b165WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Neph-VEGF-A. (B) os mesmos valores de uACR normalizados para o valor de base (semana 0) de cada rato individual. A uACR aumentou significativamente em camundongos VEGF-A KO em semanas 10 e 14 em comparação com controles de littermate WT, que foi impedida nos ratos b VEGF-A X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05; ANOVA de duas vias, correção para comparação entre pares; n = 4-12 ratos por ponto de tempo; barras de erro: erro padrão da média [SEM]). Esta figura foi modificada de Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figura 3. Medição da permeabilidade de água glomerular. (A) o glomérulo é apanhado sobre a micropipeta através de sucção; o perifusate é mudado de 1% de BSA (Ai) para 8% BSA (todos), e encolhimento glomerular é observado. (B) as medições realizadas antes e após o interruptor de BSA 8% são usadas para determinar o glomerular LpA / V eeu. (C) ratos VEGF-A KO desenvolvem um aumento glomerular LpA / V com 14 semanas pós indução de VEGF-A KO comparados aos controles do WT. Isto não foi significativamente impedido em ratos de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05; One-way ANOVA, correção de Bonferroni para comparação entre pares; n = ratos de 4-9, 15-30 glomérulos; barras de erro: SEM). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figura 4. Análise estrutural glomerular. (A) coloração PAS do córtex renal não indicaram quaisquer anormalidades estruturais nos glomérulos dos ratos de b165WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Neph-VEGF-A (Ai - iii). EM revelou anormalidades ultra-estruturais em glomérulos VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) o FPW média não se alterou entre grupos. (C) o GBM aumentou em glomérulos VEGF-A KO, que foi impedido por VEGF-A165b (D) o número de fenestras diminuiu em glomérulos VEGF-A KO, que permaneceu inalterados por VEGF-A165b. cobertura do SPS (E) foi diminuído em glomérulos VEGF-A KO, que também permaneceram inalterados por VEGF-A165b (F) a cortar a largura média foi aumentada em glomérulos VEGF-A KO, que foi impedido por VEGF-A165b (G) o número de fenda foi inalterado entre os três grupos (* p < 0,05; One-way ANOVA, correção de Bonferroni para comparação entre pares; n = 3 ratos, 9 glomérulos; barras de erro: SEM). Esta figura foi modificada de Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figura 5. expressão do mRNA e proteína de marcadores. (A) RT-PCR mostrou que a expressão humana VEGF-A165b mRNA só era evidente em glomérulos peneirados de ratos de b165VEGF-A KO X Neph-VEGF-A. (B) mancha ocidental indicou que expressão da proteína de VEGFR-2 foi para baixo-regulado em glomérulos VEGF-A KO, o que foi evitado em glomérulos de b VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05; One-way ANOVA, correção de Bonferroni para comparação entre pares; n = 3 - 6 ratos; barras de erro: SEM). Esta figura foi modificada de Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K visualizações.  University of Exeter. Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

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Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Medicina

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renal Isquemia Reperfusão: um modelo do rato de lesão e regeneração

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Biologia

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface glomeruli provide a unique opportunity to investigate physiological and pathophysiological processes using intravital 2-photon microscopy. Quantification of glomerular capillary blood flow and vasoconstriction and dilatation in response to drugs, permeability, and inflammation are just some of the processes that can be studied. In addition, transgenic rats, i.e., podocytes labeled with fluorescent dyes and other molecular biomarker approaches, provide increased resolution to directly monitor and quantify protein-protein interactions and the effects of specific molecular alterations.
In mice, which lack surface glomeruli after four weeks of age, unilateral ureteral obstruction (UUO) for several weeks has been used to induce surface glomeruli. As this induction model does not allow for baseline studies, we quantified the effects of UUO on glomerular processes in the UUO model in Munich Wistar Fr&#246;mter (MWF) rats, which have surface glomeruli under physiologic conditions. The UUO model for five weeks or more induced significant alterations to gross renal morphology, the peritubular and glomerular microvasculature, as well as the structure and function of tubular epithelia. Glomerular and peritubular red blood cell (RBC) flow decreased significantly (p &#60; 0.01), probably due to the significant increase in the adherence of white blood cells (WBCs) within glomerular and peritubular capillaries. The glomerular sieving coefficient of albumin increased from 0.015 &#177; 0.002 in untreated MWFs to 0.045 &#177; 0.05 in 5-week-old UUO MWF rats. Twelve weeks of UUO resulted in further increases in surface glomerular density and glomerular sieving coefficient (GSC) for albumin. Fluorescent albumin filtered across the glomeruli was not reabsorbed by the proximal tubules. These data suggest that using UUO to induce surface glomeruli limits the ability to study and interpret normal glomerular processes and disease alterations.

Here, we present a protocol using 2-photon microscopy in Munich Wistar Fromter rats with surface glomeruli to quantifythe effects of prolonged ureteral obstruction on glomerular dynamics and function.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

Um modelo murino de disfunção da mão relacionada ao acesso para hemodiálise

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Marcação fluorescente de glomérulos em rins de camundongos limpos para microscopia

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

Autor em destaque: Auxiliando a pesquisa em biologia renal rotulando glomérulos em tecidos limpos 

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.

Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...