Name: incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Biz yararlı tartışmalar için Drs. Victoria Bautch ve Joshua Boucher teşekkür ederim ve standart boncuk en iyi duruma getirme konusunda tavsiye tahlil koşulları ve filizlenen bir tahlil Protokolü boyama, çimlenme. S.H.A. kısmen bir hibe--dan ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü altında tarafından desteklenen 5T32 GM007092 ödül.

1. gün:
1. geçici Transfection endotel hücrelerinin
<ol><li>İstenirse, geçici transfection, insan göbek damar endotel hücreleri (gen düzenleyici oligonucleotides (örneğin mikro RNA'lar veya küçük müdahale RNA (siRNA)) ve uygun lipofectamine reaktif göre kullanarak HUVEC) gerçekleştirmek prosedürü yerine getirin. Not: Bu protokol özel siRNA dizileri ve ticari transfection reaktifi (bkz: malzemeler tablo) ile ters transfections gerçekleştirme büyük başarı elde etti. Yazarlar diğer transfection protokolleri ve Kimyasalları bu tahlil ile test etmedim. Listelenen reaktifler kullanarak geriye doğru transfection için adımlar şunlardır:</li>
	<li>Liyofilize çift veya mikroRNA'lar nükleaz boş su 20 µM bir konsantrasyon, yeniden oluşturma.</li>
	<li>Transfection çözümleri aşağıdaki oranında olun: siRNA veya mikroRNA 9 µL ile 1 mL serum Ücretsiz medya.</li>
	<li>Çözüm tahrik ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya sağlar.</li>
	<li>Transfection reaktif 18 µL ekleyin ve kışkırtmak.</li>
	<li>20-40 dk, çözüm kışkırtmaktan için oda sıcaklığında her 10-15 dk kuluçka süresi için kuluçkaya çözüm izin verin.</li>
	<li>Transfection çözüm kuluçka iken, bir hücre dekolmanı çözümü (örneğin, Accutase) kullanarak HUVEC bağlantısını kesin. Bir T175 şişesi için 10 mL, fosfat tamponlu tuz (PBS), ile şişeye yıka ve hücre dekolmanı çözümü 5 mL ekleyin ve şişeye 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Komple medya 5 mL T175 şişeye ekleyin, hücre süspansiyon şişesi ve 3 dak için 1200 rpm'de santrifüj kaldırın.</li>
	<li>Bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet EGM2 mL başına 1 X 106 hücre yoğunluğu, resuspend. Not: Bu protokol endotel hücre büyüme standart büyüme faktörü kurşun kiti yanı sıra ek bir % 10 içeren orta (EGM2) kullanarak büyük bir başarı olmuştur FBS.</li>
	<li>Transfection çözüm kuluçka tamamladığında, 1 mL çözeltisi 10 cm plaka plaka ve HUVEC süspansiyon 1 mL üstüne ekleyin.</li>
	<li>Son hacim için 9 mL 10 cm tabak içinde getirmek için tam ortam bir ek 7 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücre yeterince hücre tahlil'sonraki adımlarında için kullanılabilir olduğundan emin olmak her transfection koşul için en az iki 10 cm tabak oluşturur. Not: Bu koşullar gen düzenleyici Oligonükleotid 20 son çalışma konsantrasyon içinde yol nM. Yazarlar bu koşullar % 60-80'i nakavt hedeflerine ilgi için gen ifadesinin neden bulduk. Diğer araştırmacılar transfection koşulları deneysel onların ihtiyaçlarına göre en iyi duruma getirmek gerekir.</li>
	<li>SiRNA kompleksleri ile taze komple medya medya 4-6 h mesaj ilavesi değişimi. Not: Bu protokol geçişi kullanarak geliştirilmiştir 1-2 HUVEC.</li>
</ol>2. gün
2. Microcarrier boncuk endotel hücreleri ile kaplanması
<ol><li>Microcarrier boncuk (örneğin, Cytodex 3) 60.000 boncuk/mL PBS ve basınçlı kap bir konsantrasyon, yeniden oluşturma. Not: microcarrier boncuk bir konsantrasyon yaklaşık 3 x 106 boncuk gram başına gelir. Sulandırmak boncuk boncuk boncuk yoğunluğu yaklaşık 60.000 boncuk/mL ile almak için PBS mL başına 20 mg oranında.</li>
	<li>Yuvarlak popolu Floresans aktif hücre sıralama (FACS) tüpler için istediğiniz sayıyı tam medya aliquot 1 mL.</li>
	<li>Microcarrier boncuk süspansiyon, 20 µL pipet (Boncuk çözüm de pipetting önce resuspended emin olmak için göz kulak) her tüpün içine. Not: Büyük olasılıkla olacak dramatik değişkenlik son çalışma konsantrasyon boncuk bir verilen microcarrier boncuk süspansiyon mevcut. Boncuk boncuk konsantrasyon çözüm büyük ölçüde değiştirebilir plastik ve cam kapları kenarlarına kolayca uygun. FACS tüp microcarrier boncuk süspansiyon, her toplu iş için eklenen boncuk çözüm en uygun hacmi ampirik olarak araştırmacı tarafından belirlenecektir gerekir. Burada gösterilen sayilar daha bir başlangıç noktası olarak hizmet etmek içindir. İdeal olarak, 10-20 boncuk 24 iyi plaka tahlil sonunda iyi başına fibrin jel içinde gömülü böylece koşulları optimize edilmelidir. Tahlil için boncuk numaraları duruma getirilmesi ile ilgili olarak aşağıda tartışma bölümünde daha fazla tartışma bakın.</li>
	<li>Transfected HUVEC 24 s yazı transfection hücre dekolmanı çözümü aşağıdaki gibi kullanarak bağlantısını kesin:<ol>
<li>Hücreleri PBS, 5 mL ile her 10 cm tabak yıkama ve hücre dekolmanı çözümü 2 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
		<li>1 X 106 hücre/mL tam medyada bir konsantrasyon hücreleri resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre süspansiyon (Yani 1 X 106 HUVEC) 1 mL boncuk içeren her FACS tüp ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça FACS tüpler her 20 dk boyunca 4 37 ° C (3,4 adıma devam değilse) veya 2.5-3 h h (3.2 adıma devam eğer) tahrik. Not: Bu süre ve sıklıkta ajitasyon ampirik olarak belirledi tahlil çimlenme temel boncuk optimize önceki araştırmacılar tarafından. 4 Ajitasyon diğer frekansları ve boncuk kaplama adım sürelerini yazarlar tarafından sınanmamıştır.</li>
</ol>3. perisitlerden HUVEC kaplı Microcarrier boncuk üzerinde sıralı kaplama
<ol><li>Hücre dekolmanı çözümü (tripsin) aşağıdaki gibi kullanarak 10T1/2 hücreleri (perisitlerden) ayırma başlar:<ol>
<li>PBS, 10 mL ile T175 şişeye yıka o zaman tripsin 5 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>2 X 105 hücreleri/0.5 mL tam medyada bir konsantrasyon, 10T1/2 resuspend. Not: Hücreler Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) üzerinden satın alındı. Not: Kültür 10T1/2 hücre içinde en az gerekli orta (MEM) penisilin streptomisin %10 FBS ve % 1 ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tantanacı boncuk + HUVEC çözüm, 2.5-3 h sonra boncuk ve serbest yüzer HUVEC tüp altına yerleşmek izin vermek için 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>0.5 mL tam medya P1000 pipet kullanarak her tüpünden kaldırın ve 2 x 105 10T1/2 0.5 mL hacminde tam medyada her FACs tüp ekleyin. Hücre ve boncuk çözüm tahrik ve 37 ° C'de kuluçkaya devam Boncuk 4 h toplam için heyecanlı kadar her 20 dk kışkırtmak devam edin. Not: 5 HUVEC oranı: boncuk üzerinde 1 pericyte uygun pericyte kapsama damarlarının korumak için önemlidir. Not: Aşağıdaki alternatif adımlar yerine protokol bu noktada izlenebilir:</li>
	<li>Boncuk ve HUVEC sadece 4 h için tahrik.</li>
	<li>HUVEC kaplama microcarrier boncuk 4 h tamamlandıktan sonra son kez tüpler kışkırtmak, 30-60 s bekleyin sonra derhal 1,5-1,75 mL çözeltisi FACS tüpünden kaldırın. Not: Bu çoğu medya birçok serbest yüzer HUVEC kaldırılacak iken yerleşmek için boncuk için yeterli zaman izin vermelidir.<ol>
<li>2 X 105 10T1/2 tam medya ekleyin ve FACS hacmi getirmek 2 mL tüp.</li>
		<li>Yavaşça FACS tüpler her 20 dakikada bir ek saat için tahrik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tantanacı tamamlandıktan sonra yavaşça tüpler son kez kışkırtmak ve hemen tüm çözüm (2 mL) kaldırın ve 6 cm plakasına ekleyin. Komple medya bir ek 3 mL her plakasına eklemek ve tabakları da 37 ° C kuluçka makinesine gecede yerleştirin.</li>
</ol>3. gün
4. Fibrin jel çözümleri hazırlanması
<ol><li>Çalışma çözümleri konsantrasyonu 1 mg/mL PBS, aprotinin ve Trombin 50 adet/mL, hazır olun. Not: Bu çözümlerin her biri büyük bir hisse senedi yapılan ve en az bir yıl için 4 ° C'de depolanan.</li>
	<li>Fibrinojen taze bir çözüm 2 mg/mL konsantrasyonu olun. Çözüm heyecanlı FACS tüp başına 2.5 mL için yeterli bir çözüm yapmak.<ol>
<li>Çözüm çözüm gitmek fibrinojen izin vermek üzere 10 dk 37 ° C su banyosunda ısıtın.</li>
		<li>37,5 µL aprotinin çözüm başına 1 mL fibrinojen çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Steril-filtre çözümü ve oda sıcaklığında kenara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. boncuk jel implantasyon için hazırlanması
<ol><li>Tüm boncuk endotel hücreleri tarafından yeterince kaplı olduğunu emin olmak için 20 X objektif kullanma mikroskop altında microcarrier kaplı boncuk içeren yemekler inceleyin.</li>
	<li>Şiddetle onları 6 cm plaka ayırmak ve çözüm bir tüpün içine yerleştirmek için hücre kaplama çözüm pipette. Plaka 2 X ek kez komple medya ve plaka şeklinde olması gereken tüm kalıntı boncuk toplamak için tüp transferi ile yıkayın.<ol>
<li>Hava kabarcıkları tanıtımı önlemek ve p1000 pipet endotel hücre kaplı boncuk kesme stresi en aza indirmek için kullanın.</li>
		<li>SiRNA devirme verimliliği endotel hücrelerinde değerlendirirken, adım 2, gerektiğinde salt HUVEC kaplı boncuk bir plaka var emin olun. O zaman bu adımda (5.2), boncuk bağlantısını kesin ve HUVEC plaka RNA izolasyon ve qPCR çözümleme bağlı kalan toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boncuk çözüm tüp altına yerleşmek için izin vermek için 3 dakika bekleyin.</li>
	<li>P1000 pipet ucu kullanarak boncuk Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın (vakum aspiratör kullanmayın).</li>
	<li>Her tüpün tam medya 1 mL ekleyin ve boncuk resuspend.</li>
	<li>Boncuk altına yerleşmek izin vermek için 30-60 s bekle. Sonra büyük bir kısmını mümkün P1000 pipet boncuk Pelet bozmadan kullanmakla süpernatant kaldırın. Yanlışlıkla boncuk Pelet kaldırma olasılığı büyük ölçüde artırılır bir vakum aspiratör kullanmayın.</li>
	<li>5.5 veya 5.6 iki ek kez arasındaki adımları yineleyin. Daha fazla 6 cm plaka mümkün olduğunca çok fazla HUVEC kaplı boncuk FACS tüpünde yüzen hücreleri daha hızlı bir şekilde yerleşmek kaldırılırken değil ayırdıktan serbest yüzer HUVEC kaldırmak için hedeftir.</li>
	<li>1 mL tam medya için boncuk ekleyin.</li>
</ol>6. katıştırma Fibrin jel boncuklar kaplı
<ol><li>P1000 pipet kullanarak her FACS tüp boncuk Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın.</li>
	<li>Boncuk 2.5 mL fibrinojen çözüm resuspend.</li>
	<li>Her şey bir 24-şey cam popolu tabak istenen içine Trombin çözüm 13 µL pipet. Kaplama cam popolu bir tabak içinde filizi en uygun görüntüleme etkinleştirmek için gereklidir. Not: birden fazla 5-10 dk önce bir sonraki adım için iyi oturan Trombin bırakmayın.</li>
	<li>Her şey için 0.5 mL boncuk/fibrinojen çözeltisi ekleyin.<ol>
<li>Her zaman çözüm pipetting önce de boncuk çözüm resuspend emin olun.</li>
		<li>Dikkatle doğrudan kuyuda zaten mevcut Trombin pipet için dikkatli. Yavaş yavaş aşağı yukarı 2 - 3 kez için pipet herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici çözüm, iyice karıştırın.</li>
		<li>Pipet ucu kuyular arasında değiştirdiğinizden emin olun.</li>
		<li>Taşımak ya da herhangi bir hareket jel oluşumu engel olabilecek gibi pıhtılaşma, ilk fibrin sırasında herhangi bir noktada plaka rahatsız değil dikkatli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mahalle için oda sıcaklığında 30 dk içinde oturan plaka bırakın.</li>
	<li>Dikkatle plaka 37 ° C kuluçka jel tamamen kuvvetlendirmek izin vermek ek bir 1,5-2 h için transfer</li>
</ol>7. fibroblastlar Fibrin jel üstüne kaplama
<ol><li>Son 30 jel güçlendirilerek, min sırasında Normal insan akciğer fibroblastlar (NHLF) aşağıdaki şekilde bağlantısını kesin:<ol>
<li>Hücreleri bir T175 şişesi PBS, 10 mL ile yıkayın sonra hücre dekolmanı çözümü 5 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>20.000 hücre/mL tam medyada bir konsantrasyon, NHLF resuspend. Not: NHLF hücreleri ile Dulbecco modifiye kartal orta (%10 FBS ve % 1 ile DMEM) kültürlü penisilin streptomisin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NHLF hücre Süspansiyon Jel her şey üzerine 1 mL plaka ve kuluçka makinesine koyun.</li>
	<li>Komple medya tahlil süresince her gün değiştirin.</li>
</ol>8. fibrin jel boncuk implantasyon 2-7 gün boyunca çimlenme izleyin. Çimlenme için gereken sürenin uzunluğu HUVEC geçit ve çok sayısına bağlı olacaktır.
9. fiksasyon tahlil çimlenme
<ol><li>Bir kez yeterli çimlenme tedavi grupları arasındaki fenotipik farkı belirlemek, Bütün wells PBS 2 mL ile bir kez yıkamak için oluştu.</li>
	<li>Her şey için hücre dekolmanı çözümü 0.5 mL ekleyin ve 5 min için 37 ° C kuluçka plaka yerleştirin.</li>
	<li>Plaka da kuluçka kaldır ve plaka tarafında dokunun. Not: Bu adımın amacı olabildiğince fazla fibrin jel antikor penetrasyon jel gibi görüntüleme jel içine kolaylaştırmak mümkün olduğunca üst üste büyüyen NHLF hücrelerinin kaldırmaktır. Hücre dekolmanı çözümü toplam kuluçka zamanla NHLF kaldırma optimize etmek için ayarlanması gerekebilir. Araştırmacılar hücre dekolmanı çözümü jel nüfuz ve endotel yapıları içinde engellemeden başlar gibi jel aşırı süreler için kuluçkaya değil için uyardı.</li>
	<li>Bir kez NHLF hücreleri yeterli miktarda çıkarmak, hücre dekolmanı çözümü 1 mL tam medya ile gidermek.</li>
	<li>Müstakil NHLF ve bir vakum aspiratör kullanarak medya Aspire edin ve wells bir kez PBS 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Her şey için PBS içinde 300 µL % 2 paraformaldehyde çözüm ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>% 2 paraformaldehyde çözümü kaldırmak ve her biri de 3 kez PBS 1 mL 3 dakika oda sıcaklığında yıkayın. Not: Lütfen % 2 paraformaldehyde çözüm çevre sağlığı ve güvenliği (EHS) yönergeleri doğrultusunda uygun şekilde atın.<ol>
<li>Her şey ve 4 ° C'de hazır kadar leke veya lahanası resim depolamak için PBS 1 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. tahlil çimlenme boyama
<ol><li>Triton-X 100 her PBS'iyi ve 30-45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya % 0,5 300 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir vakum aspiratör kullanarak, Triton-X100 kaldırın ve 3 kez her 5 min için PBS içinde yıkayın.</li>
	<li>Her jel çözüm engelleme 500 µL ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Engelleme çözüm aşağıdaki bileşenlerden oluşur: %1 sığır serum albumin (BSA), %5 FBS, % 0,1 ara-20 ve % 1 Anti-serum (ikincil antikorlar türetildiği aynı tür) PBS içinde.</li>
	<li>Engelleme çözüm her kuyudan kaldırın ve her şey için birincil antikor içeren boyama çözümün 300 µL ekleyin. Not: Boyama çözüm engelleme çözüm olarak, ancak mevcut anti-serum aynıdır. Yazarlar, 1: 200 1: 400 için dilutions birincil antikorlar ile kuluçka başarıya sahiptir.</li>
	<li>4 ° C'de 24 h için çözüm boyama içinde birincil antikorlar kuluçkaya</li>
	<li>Birincil antikor çözüm Aspire edin ve 3 kez TBS içinde % 0.5 ara 20 dk her oda sıcaklığında hafif sallanan ile yıkayın. Üçüncü yıkama sonra taze yıkama arabellek ile tekrar yerine ve gecede 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2 h için çözüm boyama içinde seyreltilmiş floresan antikor ikincil 1: 1000 ile kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor boyama çözümü kaldırmak ve 5 kez 20 dk için her oda sıcaklığında hafif sallanan ile % 0.5 arayı içeren TBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS nükleer leke sulandırmak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Bu protokol PBS seyreltilmiş Höchst 1:10000 ile büyük bir başarı olmuştur. Not: Görüntüleme önce nükleer boyama çözümü kaldırmak için gerek yoktur.</li>
	<li>Görüntü en uygun floresan sinyal yakalamak için boyama tamamlama bir kaç gün içinde.</li>
</ol>11. tahlil Quantification çimlenme
<ol><li>Filizi yansıma sonra görüntü dosyaları ImageJ almak ve Brüksel lahanası saymak için sayma aracı veya Filiz uzunlukları ölçmek için Çizgi aracını kullanın. Not: Lahanası endotel çıkıntılar uzunluğu sıfırdan büyük veya eşit hangi onlar çimlenme boncuk çapı olarak tanımlanır. 11 Filiz uzunluğu Filiz Filiz ucuna boncuk kapalı çıkıntılı başlar noktadan mesafe olarak ölçülebilir. Ortalama uzunluğu boncuk başına Filiz ve filizi boncuk başına ortalama sayısı angiogenez çimlenme gen damping fenotipik etkiler değerlendirmek için yararlı ölçümlerdir. Tedavi grubu başına en az bir filiz içeren boncuk ortalama sayısı da bir ölçü olarak çimlenme sağlamlık değerlendirmek için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders.">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li><li>Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurorestorative+therapies+for+stroke:+underlying+mechanisms+and+translation+to+the+clinic.">Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic.</a> Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis.">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).</li><li>Sims, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericyte--a+review.">The pericyte--a review.</a> Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Tattersall, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+endothelial+interaction+with+macrophages+and+pericytes+demonstrates+Notch+signaling+function+in+the+vascular+microenvironment.">In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment.</a> Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+angiogenesis+and+its+assays.">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li><li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis.">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı için karmaşık aşamaları ve araştırmacı ayrıntılı mekanik soruşturma yapma genetik ve görüntüleme yaklaşımlar istihdam sağlayarak angiogenez çimlenme heterotypic hücresel etkileşimlerin karakterize bir yöntem sunuyor. Tahlil gerçekleştirirken, verimli endotel kaplama boncuk boncuk sırasında ajitasyon adımlar yer alır gereklidir. Zavallı endotel kaplama boncuklar bir golf topu gibi pütürlü yüzeyi jel implantasyon öncesinde ertesi sabah olması ve bunun yerine tamamen d...

Angiogenez uygun embriyo ve yara iyileşmesi için hayati önem taşımaktadır ve bu da kanser ilerleme1 ve koroner arter hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda hastalıklarda kilit rolü oynar. 2 , 3 daha iyi anlamak nasıl angiogenez normal gelişim sırasında oluşur ve nasıl patolojik bağlamlarda yeniden sahip roman, etkili tedavi gelişimi için önemlidir. Önemli aşamaları ve hücre tipleri angiogenez vivo içinde içinde yer alan özetlemek sadık vitro modelleri araştırmacılar daha iyi angiogenez sürüş moleküler mekanizmaları karakterize ve yeni keşifler yapmak için izin vermek için gerekir endotel yönetmelikte.
Nakatsu ve Hughes angiogenez çimlenme, çok bilinen aşamaları uğrar göstermiştir filizlenen bir boncuk tahlil optimize. 4 , 5 burada sunulan yöntemin amacı parakrin ve juxtracrine rollerinin çimlenme endotel hücre duvar hücrelerinin içinde dahil edilebilir Nakatsu ve Hughes tarafından perictyes tahlil içine dahil ederek optimize tahlil üzerine inşa etmektir roman angiogenez çalışmalar. Perisitlerden kendi içinde damar membran gömülü nedeniyle endotel hücreleri ile fiziksel temas korumak hücreleri kapatmak gibi onların rol tarafından tanımlanan duvar hücrelerdir. 6 perisitlerden ve endotel hücreleri karmaşık çapraz-hadis yollar çentik dahil olmak üzere sinyal aracılığıyla sinyal, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ ve diğer pek çok meşgul. 7 , 8 fare modelleri bu sinyal yollar eksik embriyogenez, zavallı vasküler remodeling için önde gelen damarlara ve işlevsel olmayan damarlara geliştirme zavallı pericyte kapsama göstermektedir. 7 Ayrıca, önemli ama oftentimes altında takdir perisitlerden patolojik angiogenez rolü vardır. Örneğin, bir benzersiz tümör damarlara damarları daha olgunlaşmamış, sızan ve zavallı pericyte kapsamı nedeniyle işlevsiz özelliğidir. 9 perisitlerden olup önemli ölçüde tümör kan damarlarının fenotip etkileri ve yanıt anjiogenik ve antitümör tedaviler önemli bir arabulucu olduğunu önerilmiştir. 9 böylece, vitro deneyleri perisitlerden rolü dahil olmak üzere daha eksiksiz endotel Yönetmeliğin önemli mekanizmalar yakalamak için anahtardır.
Şu anda angiogenez çalışmaya istihdam birçok vitro ve ex vivo deneyleri olmakla birlikte, her göz önünde bulundurulacak eksiklikler bulunmaktadır. Endotel proliferasyon ve endotel geçiş deneyleri, gibi bazı aşırı Basitleştirilmiş ve odak üzerinde doku kültürü plastik yalıtılmış bir ortamda bir endotel fonksiyonları üzerine. 10 Matrigel tüp oluşumu tahlil,10 ama bu deneyleri hala oversimplified ve daha fazla göç ve de novo vasküler endotel hücreleri yeteneği üzerinde odaklanmak gibi diğer deneyleri bir daha fazla 3 boyutlu (3D) ayarı, ortaya yapıları, önceden varolan damarlara çimlenme aksine. Ayrıca, bu deneyleri hiçbiri duvar hücre tipleri dahil. Perisitlerden ana organ mevcut dahil ex vivo modeli yüzük aort tahlil gibi ama bu modellerin genetik manipülasyon olduğunu çok daha nakavt veya transgenik fare modelleri üreten gerekliliği nedeniyle zor yollar ilgi. Endotel çimlenme, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve 3D matris bile anastomoz ve Lümen oluşumunda modelleri çünkü tahlil çimlenme boncuk idealdir. 4 tahlil Sadakatle çimlenme, hala doğrudan genetik değişiklik endotel hücreleri veya daha kontrollü bir ortamda perisitlerden için izin verirken birçok farklı aşamalarında mekanik değerlendirmesini sağlar. Çimlenme boncuk içeren fibrin pıhtısı kolayca sabit, lekeli ve çimlenme farklı aşamalarında görüntüsü; Bu lahanası da çimlenme, gerçek zamanlı görüntüleme gerçekleştirmek için canlı bir görüntüleme odasında yerleştirilebilir. Burada sunulan metodoloji angiogenez derinlik fenotipleme ile temel mekanizmaları ve anjiogenezi sırasında aktif yollar ayrıntılı analizi eğitimi için idealdir.

<table><tbody><tr><td>Sterile Pipette tips</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>HUVEC Media</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11095114</td><td>10T1/2 Media</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>NHLF Media</td></tr><tr><td>Tissue culture-grade PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Magnesium and calcium free</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>For lifting HUVEC</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>For lifting 10T 1/2 and NHLF</td></tr><tr><td>Customs siRNAs</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>10T 1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 3 microcarrier beads</td><td>Sigma</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>t9549</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>a3428</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Tubes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture incubator and hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well glass bottom plates</td><td>MatTek</td><td>P24G1.513F</td><td>Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.</td></tr><tr><td>Sterile Filtration Device</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay

Angiogenez önceden varolan damarlara yeni gemileri büyüme ve oküler ve kardiyovasküler hastalıklar ve embriyo ve geliştirme, yara iyileşmesi, tümör büyüme ve metastaz, gibi birçok biyolojik süreçleri önemli bir bileşenidir. Biyoloji angiogenez özetlemek etkili vitro modelleri uygun şekilde bu işlem çalışma ve sonuçta hedeflenebilir düzenleme mekanizmaları için yeni tedavi stratejileri belirlemek için gereklidir. Boncuk angiogenez tahlil daha önce birden fazla aşamalarında endotel çimlenme özetlemek için göstermiş olduğu tüp bebek. Ancak, bu testin bir sınırlama bir olmaması, endotel – duvar hücre etkileşimleri, endotel hücre moleküler ve fenotipik Yönetmeliği anahtarıdır vivoişlev. Burada verilen protokol duvar hücreleri birleşme boncuk angiogenez tahlil içine bir metodoloji sunar ve sıkı Derneği endotel hücreleri ve perisitlerden çimlenme içinde vitrosırasında gösterir. Protokol Ayrıca siRNA endotel hücrelerinde mekanik çalışmaları için kullanarak hedef genlerin etkili susturulması için bir metodoloji ayrıntıları. Özet olarak, bu iletişim kuralı daha uygun farklı hücre tipleri angiogenez çimlenme dahil modelleri ve terapötik değerlendirme ve roman keşfi için daha fizyolojik-alakalı bir platform sağlayan bir vitro tahlil sağlar angiogenez düzenleme mekanizmaları.

Bu iletişim kuralı iki hücre türleri in vitro sıkı bir Derneği için izin verir ve perisitlerden varlığı çimlenme (şekil 1A, B) oluşumunu tamamlar. Sağlayan protokol Ayrıca etkili susturmak (örneğin RNA müdahale yoluyla) bir genin bir hücre tipi faiz (özellikle de endotel hücreleri VEGFA) veya perisitlerden PDGFRβ gibi7,12 ilgi tahlil sırasınd...

Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

incorporating-pericytes-into-an-endothelial-cell-bead-sprouting-assay

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.9K Görüntüleme.  University of North Carolina at Chapel Hill. Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Video: Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Biyoloji

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Gelişim Biyolojisi

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Biyomühendislik

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Tıp

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Çizik Yara Migrasyonu ve Sferoid Filizlenme Deneyleri Kullanılarak Anjiyogenez Çalışması

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A detailed understanding of the underlying molecular mechanisms and reliable screening models are essential for targeting diseases effectively and developing new therapeutic options. Several in vitro assays have been developed to model angiogenesis, capitalizing on the opportunities a controlled environment provides to elucidate angiogenic drivers at a molecular level and screen for therapeutic targets.
This study presents workflows for investigating angiogenesis in vitro using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We detail a scratch wound migration assay utilizing a live cell imaging system measuring endothelial cell migration in a 2D setting and the spheroid sprouting assay assessing endothelial cell sprouting in a 3D setting provided by a collagen matrix. Additionally, we outline strategies for sample preparation to enable further molecular analyses such as transcriptomics, particularly in the 3D setting, including RNA extraction as well as immunocytochemistry. Altogether, this framework offers scientists a reliable and versatile toolset to pursue their scientific inquiries in in vitro angiogenesis assays.

Yazar Spotlight: Test Geliştirmedeki Zorluklar ve Yenilikler Yoluyla Anjiyogenezin İncelenmesi

This study presents the two-dimensional (2D) scratch wound migration assay and the three-dimensional (3D) spheroid sprouting assay, along with their respective downstream analysis methods, including RNA extraction and immunocytochemistry, as suitable assays to study angiogenesis in vitro.

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi