Bu 3D eş-kültür küresel sistem fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Potansiyel anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkili olacak ve in vivo çalışmalar öncesinde öngörülebilir bilgi sağlar. Bu sistem iki vasküler ata hücresi tarafından oluşturulan ortak kültür spheroids kullanır ve hücresel etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir, filizlenme, ve fizyolojik anjiyogenez tübüler olgunlaşma.
Eğer hasta hücrelerini eş-kültür sferoidleri oluşturmak için kullanabilirsek, bu sistemi kanser gibi anormal anjiyogenezle ilgili hastalıklar için kişiselleştirilmiş tedaviler geliştirmek için kullanabiliriz. Bu tisme sistemi anjiyogenez ve ilaç geliştirme çalışmalarının duyarlılığını ve verimliliğini artırabilir. ECFC'leri ve MSC'leri hücre kültürü eksplanında sırasıyla üç veya beş dakika boyunca %80 ila %90 eşzamanlı hücre kültürlerinden ayırmak için %05 tripsin-EDTA kullanarak başlayın.
Taze tam DMEM ortamı ile tripsin inaktive ve tek bir hücre süspansiyonoluşturmak için birkaç kez hücreleri pipet. Santrifüj ile hücreleri toplamak, serum içermeyen orta ile iki yıkAma takip. İkinci yıkamadan sonra, ECFC'leri mililitre başına altı hücreye kadar üç kez 10'a, MSC'leri ise iki kat 10'a, tek tek iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde orta konsantrasyonun milimetrebaşına altı hücresine seyreltin.
Santrifüj ile hücreleri pelet ve dikkatle her hücre örneğinden supernatant supernatant son 15-25 mikrolitre hariç tüm aspire. Daha sonra, floresan boya kitinden 250 mikrolitre dilüent C'deki her bir peleti yeniden askıya alın ve tam bir dağılım sağlamak için hücre süspansiyonlarını hafifçe pipetlendirin. ECFC tüpüne taze hazırlanmış 20 mikromolar PKH67 250 mikrolitre ekleyin.
MSC'lerin tüpüne 250 mikrolitre 12 mikromolar PKH26 ekleyin. Titreme ile oda sıcaklığında beş dakika sonra, ışıktan korunmuş, tüp başına FBS 0,5 mililitre bir dakikalık kuluçka ile boyama işlemini durdurun.
Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle supernatant kaldırmak, yıkama başına taze tam orta iki mililitre iki yıkama takip. Daha sonra 15 mililitrelik tüplerde ilgili ortamda hücreleri askıya. Küresel nesil için, ikinci yıkamadan sonra, ilk endotel hücre büyüme orta MV2 uygun konsantrasyonda hücre süspansiyonları seyreltmek 20% metil selüloz solüsyonu ve% 5 fetal sığır serum konsantrasyonu ile desteklenmektedir.
Sonra, sterilleştirilmiş polistiren dikdörtgen rezervuar içine her hücre süspansiyon ekleyin. 150 milimetrelik bir kültür plakasının kapağına yaklaşık 125 mikrolitrelik hücre damlacıkları eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Tüm hücreler eklendiğinde, kapağı 15 mililitre PBS içeren bir kabın altına ters çevirin ve plakaları 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Ertesi gün, çanak başına bir 50 mililitrelik tüp içine PBS beş mililitre ile kapsar durulayın. Kalan küresel leri toplamak için kapakları beş mililitre PBS ile durulayın ve spekütaitleri santrifüjle peletlayın. Son 100 ila 200 mikrolitre supernatant hariç tümünü dikkatlice atın ve tüplerin kalan süpernatantta serbestçe asılı kalması için tüpün duvarına hafifçe dokunun.
Orta konsantrasyonmili litre başına 100 sferoidler de sferoidler resuspend için her tüp için% 5 fetal sığır serum ve% 40 metil selüloz çözeltisi ile desteklenen endotel hücre büyüme orta MV2 uygun hacmi ekleyin. Küresel süspansiyonları hafifçe karıştırmak için üç ila beş milimetre çapında kesilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Küresel süspansiyon çözeltisini nötralize tip I kollajen jelile buz üzerinde bire bir oranında karıştırmak için yeni bir geniş uçlu, bir mililitrelik pipet kullanın.
Önceden ısıtılmış 24 kuyulu bir plakanın kuyularına her küresel askılı kollajen jel çözeltisinin 900 mikrolitresini ekleyin. Süspansiyonlar hücre kültürü kuluçka 30 dakika polimerize izin, endotel hücre büyüme orta MV2 100 mikrolitre ile küresel kaplamaönce ECFC sadece spheroids VEGF mililitre başına 50 nanogram ve orta SADECE MSC ve ECFC-plus-MS spoid kültürlere FBS ile takviye. Sonra bir hücre kültürü kuluçka yüklü bir gerçek zamanlı hücre kaydedici her plaka yerleştirin ve rasgele 24 saat boyunca her floresan etiketli spheroid her saat filizlenme oluşumunu izlemek için 10x büyütme beş ila 10 küresel odaklanmak.
Küresel filizlenmeyi ölçmek için görüntü dosyalarını ImageJ'e aktarın ve deney grubu başına rastgele seçilen beş küresel yıldızdan uygun floresan sinyali ifade eden filizlerin sayısını ve uzunluğunu ölçün. ECFC-plus-MSC küreseloidler için, filiz ve kümülatif filiz uzunluğu sayısı tüm zaman noktalarında ECFC sadece küresel olanlara göre önemli ölçüde daha yüksektir. MSCs sadece küresel ler filiz formu değil, sferoidler dışında MSC bireysel bir göç göstermektedir.
ECFC'nin yeşil floresan boya ve MSC ile kırmızı floresan boya ile etiketlemesi, ECFC-artı-MSC spheroids oluşturmak için birleştirilmeden önce, ECFC aracılı filiz yapılarının MFC'lerle kaplı olduğunu göstererek, filiz oluşumu sırasında kombine MSC'lerin perivasküler hücreler olarak işlev göremez, filiz kararlılığını ve dayanıklılığını iki vasküler hücre arasındaki sıkı ilişki ile artırır. Anjiyogenez inhibitörü ile ön tedavi edilen ECFC-plus-MSC spheroids, ECFC-plus-MSC küresel oidleri kontrol etmek le karşılaştırıldığında doza bağlı bir şekilde azalmış filiz sayısı ve kümülatif filiz uzunluğu göstermektedir. Paralel deneylerde, VEGF ile uyarılma takip inhibitör ile öntedavi ECFC-sadece sheroidler de bir azalma büyüme faktörü kaynaklı filiz sayısı ve doza bağımlı bir şekilde kümülatif filiz uzunluğu göstermektedir.
Ekfc artı-MSC küreseloidleri inhibe etmek için sadece ECFC'ye özgü küresel sfheroidlere göre daha yüksek bir anjiyogenez inhibitörü konsantrasyonuna ihtiyaç vardır. İnsan ksenogreft tümör fare modelinde hem kontrol ile tedavi edilen hayvanlara hem de düşük doz anjiyogenez inhibitörü ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla yüksek doz anjiyogenez inhibitörü ile tedavi edilen hayvanlarda tümör büyümesi anlamlı olarak inhibe edilmektedir. Yüksek dozda tedavi edilen farelerde bevacizumab plazma konsantrasyonu 568 artı veya mililitre başına eksi 40.62 mikrogram, ecfc artı-MSC sferoidler yerine ECFC-plus-MSC sferoidler kümülatif filiz uzunluğu inhibe için bevacizumab IC50 değerine daha yakın oldu ECFC-sadece sferoidler.
Bu, ECFC artı-MSC eş kültür küresel sisteminin bir hayvan çalışması öncesinde etkili plazma konsantrasyonlarını tahmin etmek için uygun olduğunu göstermektedir. Geniş uçlu, tek mL pipet kullanarak spheroids yavaşça onlar buz üzerinde kollajen jel iken karıştırmak için spheroids bütünlüğünü korumak için önemlidir. Bu sistemi, anjiyogenez sırasında hücre-matma çapraz konuşmayı araştırmak için bağışıklık hücreleri ve diğer hücre dışı matrisler gibi diğer hücre tiplerini tanıtmak için değiştirebiliriz.
