Name: resurrection of dormant daphnia magna: protocol and applications
Uploaded: 2018-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications at JoVE.com

Bu eser NERC parlak nokta hibe (NE/N016777/1) tarafından desteklenmiştir. Sis Ltd, çevre bilimsel Hizmetleri, çevre değişikliği Araştırma Merkezi, University College London'dan örneklenmiş ve tortu çekirdek tarihli.

Aşağıdaki SOP Daphnia magna diriltmek için kullanılan iletişim kuralı, adım adım açıklamasını uyuyan yumurta, örnekleme, yalıtım ephippia tortu ve klonal kültürler ( kurulması, ayrıntılı bir açıklama da dahil olmak üzere sağlar. Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig1.jpg"> Şekil 1: adım adım kılavuzu diriliş Daphnia magna. Tortu doğal tatlı su ortamına(a)üzerinden bir piston corer (B) ile örneklenir. Tortu çekirdek (C) 1 veya 0.5 cm (D) artımlı katmanlar halinde dilimlenmiş. Tortu her katman bir örnek zip kilit torba (E) içinde karanlık ve soğuk koşullarda (4 ° C) depolanır. Tortu her tabakası ağırlığında ve jeolojik elekler (1 mm ve 125 µm kafes boyutları, F) kullanarak elenmiş. Beyaz arka plan tepsiler Daphnia magna ephippia (G) izole etmek için kullanılır. Decapsulated uyuyan yumurta (H) Petri yemekler için transfer ve damızlık ikna etmek için ışık ve sıcaklık uyaranlara maruz. Yavru isoclonal satırları oluşturmak üzere kavanozlar (Ben) ayırmak için transfer edilir. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
1. örnekleme tortu çekirdek
<ol><li>Göl ve göletler piston corer kullanarak üzerinden örnek tortu. Big Ben27bu protokolü kullanılan, yaklaşık 1.5 m uzunluğunda bir iç boru çapları, 14 cm. Big Ben ile bir çekirdek tüp bir piston bir ip ve çubuklar tüp tortu sürücüye bağlı bir corer kafa oluşur. Bir çekirdek alıcı çekirdek tüp zaman tam destek yardımları, tortu. Tortu Yükselt için bir çerçeve çekirdek tüp dik ve sabit tutar ve değiştirilmiş şişe jack pistonu yukarı ekstrüzyon sürecinde (ek Video 1) itmek için kullanılır.<ol>
<li>İçin sığ gölet az 1 m derinlemesine bir pleksiglas yerçekimi corer en fazla 6 cm çapında el ile tortu itti kullanın.</li>
		<li>Derin göl için (> 6 m Derinlik), Livingston piston soyucular28 veya tek sürücülü Griffith tortu soyucular bir bağlantılı duba tekne AIDS ile kullanın. Livingstone tipi sürücü çubuk piston corer yaklaşık 30 m kadar su derin birbirini izleyen bir metrelik götürmek-in yumuşak konsolide Gölü tortu toplamak için kullanılabilir. Livingstone sürücü çubuklar için standart polikarbonat borular bağlayan bir basit ama güçlü çekirdek kafa, tek sürücülü Griffith corer oluşur. Soyucular tortu çubuklar ile içine itilir ve bir piston tortu (Şekil 2) kurtarma için gerekli emiş gücü sağlar.</li>
		<li>Rahatsız edilmeden çekirdek, sürekli almak için vibracoring kullanın. Bu soyucular su derinlikleri çeşitli üzerinde çalışmak ve çekirdek örnekleri, tortu lithology bağlı olarak farklı uzunlukta alabilirsiniz. Vibracore baş aşağı ekli varil veya çekirdek tüp yoluyla aktarıldığı düşük genlik titreşim çökeller, sıvılaştırılmış çökeller nüfuz vibracore birimine bağlı çekirdek namlu etkinleştirme liquefies. Bazı vibracorers küçük, hafif ve taşınabilir, diğerleri yalnızca büyük gemilerin dağıtılabilir büyük ağır birimleri vardır. Soyucular seçim tortu lithology üzerinde bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdek yatay olarak 1 cm veya daha az düz metal yüzeylere (ek Video 1) kullanarak artımlı katmanlarında dilim. Burada kullanılan bir tortu soyucular ekstrüzyon, rahatsızlık sediman katmanların azaltılması, hidrostatik basıncı azaltmak için tasarlanmıştır. Diğer soyucular kullanıldığında, dış kabuğu her tortu katmanın katmanlar arasında kirlenme sınırlamak için bıçak bir çerez kesici tür kaldırılmış olabilir.</li>
	<li>Her bir ayrı örnekleme çanta (ek Video 1) tortu katmanda toplar ve karanlık ve soğuk (4 ° C) koşulları saklarız.</li>
	<li>Radyometrik tarihleme için tüm katmanlardan en az 5 g tortu toplamak. Radyometrik çıkıyor uzanan tahlil ayrıntılı bir açıklaması için oluşturulmuş protokol için varolan yayınlar12,13bakın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig2.jpg"> Şekil 2: yordam Asitleme piston karikatür. Piston corer, zayıf bir vakum oluşturur bir iç sürgülü mühür (piston) ile içi boş bir tüp. Piston tortu-su arabirimi dokunduğunda, ağırlığı iter ve çekirdek namlu tortu ve vakum girin ve sediman katmanların bozmadan tüp taşımak için özlü tortu neden olur. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
2. eleme sediman katmanların
<ol><li>Bir duyarlılık ölçeği kullanarak, her bir tortu katman ileride başvurmak için tartmak. Yüzey alanı ve ağırlık göl türler dansitesi hesaplamak için kullanın.</li>
	<li>Birbiri üstüne yığılmış iki jeolojik elekler kullanarak her tortu katman elek. İlk elek bir kafes boyutu 1 mm ve kil, büyük omurgasızlar ve Partiküler madde, örneğin tohumlar, bitkiler ve böcekler, tortu kalan ayırır. İkinci elek 125 µm örgü vardır ve D. manga ephippia ve küçük partikül tortu (ek Video 2) kalan ayırır.</li>
	<li>
Küçük aliquots 125 µm mesh elek toplanan tortu fraksiyonunun bir beyaz arka plan tepsiye aktarın. Tortu türüne bağlı olarak, tortu, küçük veya büyük aliquots her zaman transfer edilebilir.
	<ol>
<li>Küçük birimleri ekleyin (ilâ 200 mL) orta transfer edilen tortu kesir yeniden askıya almak ve göz ephippia (şekil 3) lekelenme kolaylaştırmak için örnekleme beyaz tepsi için. Tortu resuspend için kullanılan orta dechlorinated musluk suyu, sondaj su, açılan29veya ADaM orta (Aachener Daphnien)30olabilir. Bundan sonra terim 'orta' ya da tüm listelenen çözümleri için başvurmak için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig3.jpg"> Şekil 3: Daphnia magna ephippium. Uyuyan Daphnia magna yumurta hemen sonra kapsülden çıkarma. Ephippium(a), (B) iç yumurta membran ve uyuyan yumurta (C). gösterilir Ölçek çubuğu 500 µm =.
3. Ephippia ve damızlık kapsülden çıkarma
<ol><li>Bir tek kullanımlık Pasteur pipet veya mikrodiseksiyon forseps kullanarak transfer bireysel ephippia Petri yemekler için orta 10 mL ile dolu. En az bir petri çökelti tabakası başına kullanın.</li>
	<li>Stereo mikroskop, decapsulate altında mikrodiseksiyon forseps açık zorlayarak kitin durum (ek Video 3) kullanarak her ephippia. Dinlenme yumurta iç zarı ince kaldırmak için değil yumurta bozabilir ve Petri kabına aktarmak için dikkat ile Pasteur pipet kullanarak ortam dolu. Kapsülden çıkarma D. magna; tarama başarı ancak artırır, bu gerekli olmayabilir veya daha küçük ephippia üreten diğer Daphnia türler için zor olabilir.</li>
	<li>Decapsulated yumurta tam spektrum uzun gün photoperiod ışık (16:8 ışık: karanlık) ve damızlık ikna etmek için yüksek sıcaklık (20 ± 1 ° C) için bir ısı kontrollü aygıt (kuluçka) veya oda içinde maruz. 48 h ve (en fazla dört; birkaç hafta arasında damızlık olur Takıma giren Video 4). Kapsülden çıkarma yokluğunda, doğrudan uyaranlara (uzun gün photoperiod ışık (16:8 ışık: karanlık) ve yüksek sıcaklık (20 ± 1 ° C)) çıkım için ephippia ortaya çıkarmak.</li>
</ol>4. Daphnia magna Isoclonal satırları oluşturma
<ol><li>Tek yavru satırlarından isoclonal adım 3.3 200 mL tek kullanımlık Pasteur pipet kullanarak orta ile dolu kavanoz ayırmak için bireysel D. magna aktararak kurmak. Her bireyin genetik olarak cinsel rekombinasyon sonucu olarak farklıdır.</li>
	<li>İsoclonal satırları süresiz olarak hisse senedi koşullarında oluşan 10 ± 1 ° C, 16:8 ışık: karanlık rejimi, haftalık 0.2 mg C/M Chlorella vulgaris veya diğer yeşil algler (örneğin, Scenedesmus obliquus) ile beslenen korumak. Orta üçüncü haftada yenilemek. Hisse senedi koşullarında beslenme rejimleri ve türler sıcaklık ile değişebilir.</li>
</ol>5. anahtar çalışmalar
Not: Hangi dirilen D.magna içinde (alt) tortul Arşiv veri gruplarından Gölü halka (Danimarka) ısınma için evrimsel yanıtı değerlendirmek için kullanılan iki temel çalışmalar için bir açıklama sağlanmıştır. Üç (alt) nüfus aşağıdaki süreler yeniden canlandırmak: 1960-1970, 1970-1985, ve > 1999. 11 ile %58 (şekil 4) arasında değişmekteydi tortul Arşivi'nden başarı kuluçkalık D. magna . Her timeperiod elde edilen yavru rastgele bir alt burada açıklanan iki anahtar çalışmalar için seçildi. Bu çalışmalar (alt) nüfus dönemleri boyunca sıcaklık değişimi üzerinden yeniden canlandırmak fitness bağlı yaşam öyküsü özellikleri (5.1) farklılıkları gösterdi ve onlar farklı rekabetçi yetenek (5.2) vardı değerlendirmek için tasarlanmıştır ısınmaya maruz kaldıktan sonra.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig4.jpg"> Şekil 4: başarı Gölü yüzüğünden örneklenmiş bir tortul arşivindeki kuluçkalık. Göl anahtar çalışmalarda kullanılan yüzük tortul Arşiv boyunca başarılı yavru oranı. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>
Ortak Bahçe deneyler
	<ol>
<li>On yavru (alt) nüfus başına hisse senedi kültürleri ortak Bahçe koşulları için transfer: 16 ° C; uzun photoperiod (16:8 ışık: karanlık rejimi); Her gün 0,8 mg C/L Chlorella vulgarisile besleme ve orta iki günde yenilemek. En az iki kuşak (ca. 45 gün) için ortak Bahçe koşullarında yavru korumak. Ortak Bahçe koşulları anne etkisi müdahalelerden azaltmak ve üreme yavru arasında eşitleyin.</li>
		<li>İkinci damızlık damızlık odasına serbest bırakılmasıyla yetişkin kadın gençlere ikinci damızlık bırakana orta ile dolu 500 mL kavanoz için ikinci nesilden aktarın.</li>
		<li>Rastgele 24-48 h, orta ile dolu ve aşağıdaki deneysel koşullar için maruz 100 mL kavanoz ikinci nesil kuluçka ikinci dünyaya bireysel gençlere aktarım: 18 ° C (göl geçerli sıcaklık) ve (ısınma, sıcaklığı 24 ° C IPCC 26 tarafından yaklaşan 100 yıldır tahmini), 16:8 ışık: karanlık rejimi ve besleme günlük 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris.</li>
		<li>Her deneysel hayvan üzerinde baş ve omurganın kuyruk (şekil 5) arasındaki mesafe olarak bir stereomicroscope ile Vadesinde boyutunu ölçmek. Her hayvan fotoğraf ve daha sonra boyutuna uygun görüntü yazılımı kullanarak çözümleyebilirsiniz.</li>
		<li>Olgunluk yaşta ölçmek: içinde yumurta ilk defa kuluçka odasında günü kutlanan.</li>
		<li>Ölüm ölçmek: deney sırasında soyu tükenmiş sayisi.</li>
		<li>Verimlilik ölçmek: birinci ve ikinci klonal üreme yayımlanan yavru toplam sayısı.</li>
		<li>Euler denklem (1) kullanarak tahmini nüfus artış hızı tedbir: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56637/56637eq1.jpg">(1) Lx yaş xhayatta kalma oranı, bx Yenidoğan Bebeklerin sayısı yaş xhayatta kalan tek tek başına üretilen ve r iç doğal artış oranıdır nerede.</li>
		<li>Piyasada bulunan yazılım kullanarak istatistiksel çözümleme gerçekleştirme. Burada, R31 tepki normları (ortamlar arasında tek bir genotip fenotipik ifade) ggplot2 paketi kullanarak her hayat Tarih özelliği için çizmek için kullanın. Mortalite oranları Sağkalım analizi (R paket rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf) üzerinden başına hesaplayın. Son olarak, sıcaklık etkisi özellikleri (nüfus arasında farklılıklar), evrim tarafından açıklanabilir olup olmadığını değerlendirmek için R31 yılında bir Varyans analizi (ANOVA, Tablo 2) gerçekleştirmek plastisite (tedaviye yanıt) veya evrimi plastisite (nüfus tedavi x).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yarışma deneme
	<ol>
<li>Nüfus başına on yavru hisse senedi kültürleri ortak Bahçe koşulları için transfer: 20 ° C, uzun photoperiod (16:8 ışık: karanlık rejimi), günlük 0,8 mg C/L Chlorella vulgaris, yem ve orta iki günde yenilemek. Ortak Bahçe koşulları müdahalelerden anne etkileri azaltmak en az iki kuşak (ca. 45 gün) için korumak.</li>
		<li>Rastgele beş gençlere 24-48 h 10 hayvanlar/L. yoğunluğu, triplicates içinde deneysel mesocosms 20 L (plastik aquaria), orta ile dolu her yavru ikinci nesil ikinci damızlık atama</li>
		<li>24 ° c, 16:8 L:D rejimi, mesocosms ortaya çıkarmak ve günlük 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris ısı kontrollü odası veya en az dört hafta için kuluçka makinesi ile besleme (> 3 klonal nesiller).</li>
		<li>Her mesocosm haftalık, Daphnia Doğal ortamında karşılaşabileceğiniz bir nüfus dinamik benzetimi yapmak için orta yüzde 10'u yenileme itlaf. Bilinen hacmi orta ve her akvaryum (Bu durumda 1.2 L) hayvanlardan kaldırma ve toplandılar birim ile taze orta yerine itlaf empoze. Deneysel hayvan olgunluğa (10 gün) sonra culling rejimi başlatın.</li>
		<li>Dördüncü haftanın sonunda, vardiya ile karşılaştırıldığında ilk inoculum genotypic bileşiminde değerlendirmek için her mesocosm 32 hayvanlardan örnek.<ol>
<li>Bireysel Daphnia microcentrifuge tüplerde yerleştirin ve aşırı sıvı Pasteur pipet yardımıyla kaldırın.</li>
			<li>Flaş dondurma bireysel tüpler sıvı azot ve-80 ° C'de store</li>
			<li>Genomik DNA kullanılabilir iletişim kurallarını kullanarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek tek bireylerin ayıklayın.</li>
			<li>Ayıklanan DNA genetik işaretler civciv başına benzersiz bir multilocus genotip sağlamak için yeterli sayıda kullanarak yükseltmek. Burada, tek bir multiplex (M01, Tablo 1) düzenlenmiş 8 mikrosatelit kurulan iletişim kuralları32,33takip kullanılmıştır.</li>
			<li>Genotip bir parçası analyzer parçaları güçlendirilmiş.</li>
			<li>Parça analizi uygun boyutu standart kullanarak ticari veya serbestçe elde edilebilir ile a bilgisayar yazılımı yapmak.</li>
			<li>Genotypic düzenleme microsatellite loci bir dizi deney Genotipleme 32 bireyler tarafından sonunda açıklanan33ve deney ile karşılaştırıldığında ilk inoculum sonunda her genotip sıklığı hesaplama olarak değerlendirmek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig5.jpg"> Şekil 5: yetişkin kadın Daphnia magna. Yetişkin kadın Daphnia magna parthenogenetic yumurta kuluçka odasında. Baş ve kuyruk omurganın arasındaki mesafe hayvan boyutunu ölçmek için kullanılır. Kırmızı çizgiler, boyut ölçümleri gösteriyor. Ölçek çubuğu 500 µm =.

Yazarlar ifşa yoktur

Nedeniyle yüksek ısı iletkenliği su, temiz su ekosistemleri küresel karşısında karasal ekosistemler daha biyolojik çeşitlilik kaybı daha yüksek risk altındadır34ısınma. Bu, bu nedenle, bu ekosistemleri içinde kilit taşı tür yanıt anlamak ve termal stres hayatta kalmak için başa çıkma mekanizmaları belirlemek için önemlidir. Bu mekanizmalar, türler ve topluluk düzeyde anlayış nasıl tür küresel ısınma tarafından etkilenen ve nasıl bireysel türler üzerinde etkisi diğer trophic seviyelere basamaklandırır tahmin yardımcı olabilir. Sonuçta, küresel ısınma yanıt-e doğru mekanizmaları anlama yok olma azaltmak için düzeltme stratejilerini tanımlamasını sağlar.
Burada sunulan örnek çalışmalar D. magna cevaben sıcaklık artışı pervasively plastisite'hayat Tarih özellikleri tarafından aracılık ettiği ve yanıt-e doğru sıcaklık artışı yalnız açık fitness maliyeti, empoze etmez göstermek en az olarak nüfus burada okudu. ' Hayat Tarih özellikleri yüksek plastisite ısınma varlığında (alt) örneğin alınma olasılığını rakip yeteneklerine önemli olmayan farklılıklar tarafından desteklenmektedir. Ancak, birden fazla nüfus üzerinde uzun vadeli rekabet deneyler bu bulgular genelleştirmek gerekli olabilir.
Uyuyan aşamaları dirilişi adaptasyon mekanizmaları ve yörüngeleri ile saat10bir tür evrim çalışmaya benzeri görülmemiş bir kaynak sağlar. Plankton tür bir hızlı oluşturma süresi (yaklaşık 2 hafta) ve bir üst headtohead kendi alt öğelerin karşı rekabet etmek veya çeşitli geçmiş Amerika'dan başlar evrim ' yeniden ' sağlayan uyuyan aşamaları, canlılığı yararlanın. Diriliş ekoloji aslında belirli bir evrimsel sonuca bazı önceki olayda şarta olup araştırma sağlar. Evrim genetik unsurları kimlik laboratuvar deneyleri için 'atalarının lines' donmuş ve resüsite mikroorganizmaların onların Gelişmiş alt6ile karşılaştırmalı analizi için kullanma içinde şu anda mümkün değildir. Ancak, bir laboratuvar organizmalar ile çalışmanın ana sınırlamaları 'atalarının devlet' zaten değiştirdi bir temel olmasıdır. Uyuyan aşamaları çalışma örneklerin zaman herhangi bir stres olay (örneğin, bozulmamış çevre koşulları) öncesine ve çeşitli son durumları için bozulmamış çevre koşullarından evrimsel yörüngeleri ölçmek için örnekleme sağlar Modern zamanlara kadar. Son yıllarda, bugünkü nüfusu14 genetik katkıda bulunmuştur son demografik ve edinilmiş süreçleri önemli anlayışlar dirilen veya hala atıl plankton aşamaları DNA polimorfizmi çalışmanın sağlamıştır , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri daha yüksek erişilebilirlik ile genom ve dirilen veya hala atıl etap transcriptome sıralı ve genetik değişiklik sayısını ve türünü birikmiş nüfus üzerinde gelişen süre ölçülür.
Diriliş burada sunulan SOP iki düzeyde multi-omics alanında önemli uygulamaları vardır. Multi-omics teknolojileri dirilen numuneler, moleküler öğeleri ayrıntılı bir analizini çevresel seçim basınç adaptif yanıt katılan izin uygulanabilir. Buna ek olarak, omics teknolojileri decapsulated ama hala atıl aşamaları için uygulanabilir. Şimdiye kadar yüksek işlem hacmi sıralama teknolojilerinin uygulanması aşamalarında istirahat için giriş malzeme büyük miktarda ihtiyaç tarafından sınırlıdır. Bu sınırlamalar kaldırdı37davranıyorsun. Giriş malzeme ve nanofluidics devam eden düşürücü gereksinimleri ile tüm genom sıralama (WGS) Şimdi mümkün olduğunca az 1 ng veya malzeme38başlayan bir kaç pg. Tüm genom amplifikasyon (WGA) ve tüm transcriptome güçlendirme (WTA) teknikleri, DNA ve RNA doku, çok küçük tutarlar üzerinden zenginleştirme sağlayan kullanımı metagenomics39,40 ve tıp devrim yarattı 41araştırma. Decapsulated uyuyan yumurta için uygulanan bu teknolojiler uyuyan aşamaları canlılığı ve Genişletilmiş zaman dönemleri (örneğin, yüzyıllar) soruşturma ile ilgili sınırlamaları aşan etkinleştirin.
Omurgasız topluluklar dinlenme aşamaları üreten dirilişi topluluk geçmişleri bilinen doğal manzara değişimler ya da çevresel değişiklikler çökeller orsoils2analizleri anlaşılmaktadır hizalamasını sağlar. Topluluk değişiklikleri yanıt olarak çevresel değişimin analizi bize yeteneği önemli sonuçlara yol nüfus sebat43at, trofik etkileşimleri44 Eko-evrimsel yorumlarından42 ölçmek için sağlar , toplum derleme45ve ekosistem işlevleri ve Hizmetleri46değişimler. Son olarak, çevresel değişimin biyolojik yanıt hakkında doğru Öngörüler biyolojik çeşitlilik47korunması rehberlik olağanüstü vardır. Geçerli tahmin modelleri bu açıdan yanlış olduklarından onlar hesap önemli biyolojik mekanizmaları demografi, dağılma, evrim ve tür etkileşimleri gibi içine almayın. Nasıl bu işlemlerin zaman içinde değişim anlama ve tahmin modelleme içinde bir rahip olarak bu bilgileri kullanarak tür tahmin yeteneğimizi artıracak ve topluluk sebat karşısında çevre değiştirmek2.
Burada sunulan SOP uygulama zorlukları değildir. Uyuyan aşamaları resurrecting birincil sınırlaması örnekleme için özel ekipman ihtiyacı var. Ayrıca, tortu klonal kültürlerin kurulması için eleme üzerinden tüm süreci önemli bir uygulamalı zaman gerektirir.
Burada sunulan SOP adımlardan bazıları diğer Daphnia türler için kolayca transfer edilebilir. Bunlar: örnekleme, klonal hatları ve deneysel tasarım kurulması. Ancak, SOP diğer adımları daha fazla en iyi duruma getirme türü altında eğitim için özel olarak tasarlanmış gereken. Kapsülden çıkarma kez tarama başarı geliştirmek için D. magna numuneler için uygulanır. Ancak, bu yaklaşım küçük örnekler için uygun olmayabilir. Uyaranlara yumurtadan da türler48 ve conspecific numune49arasında değişebilir. Bu nedenle, SOP çıkım adımlardan geçici bir optimizasyon uygulamaları diğer kabuklular için önce gerekli olabilir. Önceki sonuçları49doğrultusunda tarama başarıdır Gölü yüzük (tortul Arşiv genelinde %30,5) üzerinden yeniden canlandırmak D. magna nüfusunun iken başarı kuluçkalık tortu, türler koruma durumu ile değişir 50,51ve tortu48coğrafi kökeni. Giriş ve ilerleme diapause aşamalarında düzenleyen mekanizmalar gelecekteki çalışmaları farklı türler için özel olarak tasarlanmış en iyi damızlık uyaranlara tanımlamak için gereklidir.
Son olarak, bilgi eğitim sisteminin arka plan, özellikle ilgi zamanla, türlerin varlığı tavsiye. Bu tarihi yazmak yolu ile elde edilebilir. Tarihsel kayıtlar mevcut değilse, yalnızca en son tarih bilgileri sağlayabilir, ancak örnekleme ve göl tortu çekirdek örnekleme önce yüzey kat eleme, önerilir.

Uzun vadeli çalışmalar doğada ve ne tür yanıt ve çevresel değişimin1sırasında kalıcı değerlendirirken ekolojik ve evrimsel süreçleri anlamak için kritik öneme sahiptir. Eko-evrimsel süreçleri nesiller boyunca oldu ve uzun zaman açıklıklı üzerinde ortamındaki değişiklikler meydana olmasıdır. Ayrıca, uzun vadeli çalışmalar evrimsel doğal ekosistemlerin yanıt-e doğru çevre değişiklikleri2tahmin etmek için akıllı modelleme doğruluğunun geliştirilmesine önemli ampirik veriler sağlar. Bu modeller doğruluğunu biyolojik çeşitlilik ve ekosistem hizmetleri korumak için yönetimi ve koruma stratejileri uygulamak için çok önemlidir.
Birkaç istisnai durumlar (örneğin, Galapagos Darwin ispinozları3 ve yosun4), uzun vadeli çalışmalar büyük ölçüde türe laboratuvar5,6 ' türetilebilecek kısa oluşturma süresi ile sınırlıdır , 7 , 8. bu nedenle, evrimsel dynamics destek süreçleri zor kalır. Zamansal örnekleri erişme ile ilgili lojistik zorluklar nedeniyle ampirik veri daha sık olarak bir uzamsal-zamansal bir bağlamda incelendiği ve zamansal Eko-evrimsel süreçleri anlaşılmaktadır veya uzamsal verilerden modellenmiştir. Bu yaklaşım 'uzay-için-zaman' ikame9sayede alanı zamansal evrimsel dynamics eğitim için bir vekil olarak kabul edilen, olarak bilinir. 'Uzay-için-zaman' ikame ana sınırlandırılması kayma farklı ölçeklerde uyum oranları aynı nüfus zamansal değişim farklı olduğunu; Bu nedenle, yedek zaman alanı olan temel çıkarımlar önyargılı10vardır.
Zaman içinde doğal ekosistemler evrimsel dinamiklerini eğitim sağlayan güçlü bir alternatif uyuyan aşamaları11üreten türlerin ekolojik ve genetik değişimler analizidir. Uyuyan bu aşamaların doğru tarihli olabilir tabakalı form biyolojik arşive birikir ve12,13paleolimnologically ile karakterizedir. Önemlisi, bu uyuyan aşamaları resüsite ve nerede çevre değişim evrimsel onların yanıt doğrudan ölçülebilir laboratuvar deneylerinde kullanılan. Tarihsel nüfus fitness değişiklikleri ve adım çevresel değişimin14,15,16ile gelişen genlerin fonksiyonun çalışmaya modern gelişmiş torunları karşı yarıştı.
Uyuyan aşamaları dahil tohumları, kistler, sporlar ve bankalar yumurta. Her ne kadar geç 1980'lerde17ve çalışmalar bir avuç geri yaşama uyuyan yumurta tarihleri üzerinde ilk çalışmalar erken 1990'larda18,19Bu teknikte uygulamış, diriliş ekoloji alanında resmen olmuştur Kerfoot ve iş arkadaşları 199920seminal kağıt tarafından kuruldu. Bu uygulama içinde ağırlıklı olarak rekonstrüksiyonlar paleolimnological tatlı türler17,21,22uygulanmıştır. Ancak, bir SOP henüz kullanılabilir değil. Burada, plankton türlerinin Daphnia magna uyuyan yumurta uygulanan diriliş protokolü, adım adım açıklamasını, yavru üzerinden klonal kültürler kurulması için tortu örnekleme üzerinden sağlanır. Daphniadiğer türler için kolayca transfer edilebilir SOP adımlardan yanı sıra ek optimizasyon, gerektirebilir adımları ele alınmıştır.
Daphnia tatlı su zooplankters lotic habitatları23 çoğunda mevcut vardır. Daphnia türü ya da zorunlu aseksüel veya döngüsel parthenogens bulunmaktadır. D. magna clonally uygun çevre koşulları24altında üretir döngüsel bir parthenogen var. Çevre koşullarının bozulmasına, erkek üretim oluşur ve cinsel rekombinasyon uyuşukluk çevreden ephippium denilen bir kitin durumunda tarafından korunan bir devlet girin döllenmiş yumurta oluşumu yol açar. Bir kısmı atıl bu yumurta yumurtadan uygun çevre koşulları döndüğünüzde. Ancak, uyuyan yumurta banka büyük bir kısmı hiç yumurtadan ve böylece biyolojik Arşivler kurmak zaman içinde oluşturmak için bir şansı var. Uyuyan aşamaları göller ve göletler tortu gömülü kalır ve evrimsel dinamikler çalışma için uzun süreler içinde yeniden canlandırmak. D. magna uyuyan yumurta cinsel rekombinasyon sonucudur çünkü türler25doğal genetik çeşitliliğin iyi bir temsil vardır. Ayrıca, laboratuvarda klonal üreme yoluyla korunabilir. Bu özellikleri doğal genetik çeşitlilik koruyarak isogenic canlılar, benzersiz avantaj sağlarlar.
İki önemli çalışmalar çevre seçimi basınç zaman içinde yaşıyor doğrudan karşılaştırma D. magna aynı nüfus tarihi ve modern torunları avantajları göstermek için sunulmaktadır. D. magna numuneler Gölü yüzüğünden (Danimarka), sığ bir yeniden canlandırmak (5 m Derinlik; yüzey 22 ha) Zaman içinde ortalama sıcaklık ve ısı dalgaları oluşumu bir artış yaşanmıştır karışık gölet. D. magna (alt) nüfus 60 yıl (1960-2005) kapsayan bu zamansal degrade yeniden canlandırmak ve evrimsel yanıt-e doğru sıcaklık ısınma araştırmak için okudu. Ortak bir bahçe deneyi ilk çalışmada,'hayat Tarih fitness bağlantılı özellikleri değişiklikleri yanıt predictions Hükümetlerarası Panel iklim değişikliği için yaklaşan 100 yıl doğrultusunda 6 ° c sıcaklık artışı olarak ölçüldü 26. ikinci çalışmada, mesocosm deney üç rekabetçi yeteneklerini ölçmek için kullanılan ısınma altında (alt) nüfus. Kombine bu deneyler huzurunda, sadece stres ısınma tüm yaşam öyküsü özellikleri ve nüfus plastisite yüksek düzeyde göstermek ve eşit rekabet yetenekleri olduğunu göstermektedir. Bu bulgular tavsiye ederim tek bir stres önemli fitness maliyeti, en azından kalabalıkta empoze etmez gibi ısınma burada okudu.

<table><tbody><tr><td>sampling bags</td><td>Fisher Scientific</td><td>11542783</td><td>Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89&amp;micro;m thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand</td></tr><tr><td>piston corer</td><td>ENSIS ltd</td><td>na</td><td>Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC</td></tr><tr><td>precision scale</td><td>Veritas-M124A</td><td>TLP-50</td><td>Analytical Balance</td></tr><tr><td>geological sieve</td><td>UKGE limited</td><td>SV7521</td><td>200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh</td></tr><tr><td>geological sieve</td><td>UKGE limited</td><td>SV7525</td><td>200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh</td></tr><tr><td>white sampling tray</td><td>nhbs</td><td>http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509</td><td>Standard mulipurpose lab trays</td></tr><tr><td>pasteur pipette</td><td>Globe Scientific inc.</td><td>138020B</td><td>Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL</td></tr><tr><td>stereo microscope</td><td>nikon</td><td>smz800</td><td>Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit</td></tr><tr><td>petri dish</td><td>EduLab</td><td>153-533</td><td>Sterile 90mm diameter plastic petri dish</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>compak</td><td>Round Jam Jars 4oz</td><td>100 mL jars</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>compak</td><td>Atum Jars/ Bonta Jar 10oz</td><td>200 mL jars</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>bottlecompanysouth</td><td>500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid</td><td>500 mL jars</td></tr><tr><td>statistical software R</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td>na</td><td>Free online GNU&amp;nbsp; language and environment for statistical computing and graphics</td></tr><tr><td>microdissection forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>41122405</td><td>Fine point stainless steel forceps for microdissections</td></tr><tr><td>image software</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td><td>na</td><td>Open source ImageJ image processing toolkit written in Java</td></tr><tr><td>mesocosm</td><td>amazon</td><td>na</td><td>Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter</td></tr><tr><td>mirocentrifuge tubes</td><td>Sigma_Aldrick - Merck</td><td>Z606340</td><td>premium microcentrifuge tubes 1.5 mL</td></tr><tr><td>AGENCOURT DNAdvance</td><td>Beckman Coulter</td><td>A48705</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>size standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td>LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers</td></tr><tr><td>ABI3032 sequencer</td><td>ABI</td><td>na</td><td>Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing</td></tr></tbody></table>

resurrection of dormant daphnia magna: protocol and applications

Uzun vadeli çalışmalar uzun süreler içinde oluşan Eko-evrimsel süreçleri tanımlaması etkinleştirin. Buna ek olarak, onlar akıllı modelleme evrimsel doğal ekosistemlerin yanıt-e doğru gelecekteki çevresel değişiklikler tahmin etmek için kullanılan önemli ampirik veri sağlar. Ancak, birkaç istisnai durumlar, uzun vadeli çalışmalar zamansal örnekleri erişme ile ilgili lojistik zorluklar nedeniyle azdır. Zamansal dinamiği sık vahşi doğal nüfus evrimi yeniden olağanüstü çalışmaları ile laboratuvar veya kontrollü mesocosm deneyler incelenmektedir.
Burada, Standart prosedür (SOP) canlandırmak veya önemli ölçüde state-of--art boyuna veri koleksiyonunda ilerlemek için uyuyan Daphnia magna, sucul ekosistemler, bir yaygın plankton kilittaşı türler diriltmek için sağlanmıştır. doğal sistemlerin. İlk diapausing plankton yumurta tarihe geri 1980'lerin kuluçkalık çalışır halde diriliş ekoloji alanında Kerfoot ve iş arkadaşları tarafından 1999 yılında tanımlanmıştır. Kerfoot'ın seminal gazeteden beri plankton türler resurrecting metodoloji giderek daha sık, doğrudan bilgi transferi yoluyla sadece laboratuvarlar arasında yayılır rağmen uygulanmıştır. Burada, bir SOP uyuyan Daphnia magna resurrecting uygulaması üzerinde adım adım bir protokol sağlayan anlatılan yumurta.
Hangi fitness tepki Daphnia magna nüfus için yeniden canlandırmak olarak ısınma ölçülür, iki anahtar çalışma tarihi ve modern nüfus aynı ayarları çalışma yeteneği üzerinde sermaye sağlanmaktadır. Son olarak, sonraki nesil sıralama teknolojileri uygulamaya canlandı veya hala atıl aşamaları ele alınmıştır. Bu teknolojiler süreçleri ve seçim basınç değişiklikleri zaman içinde yaşamış nüfus uyguladıysanız evrim mekanizmaları dissekan benzeri görülmemiş güç sağlar.

Uzun vadeli ampirik veri anlama evrimsel dinamikler ve sebat doğal nüfus için kritik öneme sahiptir. Bu gibi veriler geçici örnekleri ve veri toplama için uzun vadeli taahhütte bulunmadan şartı erişme ile ilgili lojistik zorluklar nedeniyle elde etmek için genellikle zor. Burada sunulan iki önemli çalışmalarda temiz su ekosistemleri içinde merkezi bir zooplankter sıcaklığını yanıt ampirik kanıtlar üzerinde evrimsel kez sağlanır. Bu tarihsel nüfus ve modern torunları cevaben ortak deneysel ayarlarında çevresel stres çalışma fırsatı sağlar katmanlı uyuyan yumurta bankalar kullanılarak etkinleştirilir.
Ortak Bahçe deney Tüm yaşam öyküsü özellikleri sıcaklık için yanıt ortak Bahçe deneme gösterdi (şekil 6 ve Şekil 7). ANOVA çözümleme tüm (alt) örneğin alınma olasılığını yanıt vermeyen ölüm dışında yanıt sıcaklığa plastisite (Tablo 2), üzerinden ortaya. Evrimsel değişiklikler ((alt) nüfus arasındaki farklar) kanıtı iki üç önemli ölçüde artış sadece nüfus artış hızı (Tablo 2), içinde gözlenen (alt) nüfus 24 ° c (şekil 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig6.jpg"> Şekil 6: ortak Bahçe deney. Reaksiyon normları yaşam öyküsü özellikleri (verimlilik, boyutu ve yaş Vadesinde) ve nüfus artış hızı (r) için ortak Bahçe ve geçerli sıcaklık rejimi (18 ° C) ile karşılaştırıldığında (24 ° C) ısınma sıcaklık altında her (alt) nüfus için gösterilir. Nüfus artış hızı 'r' (1) Eulerian Denklem kullanılarak hesaplanır. Güven aralıkları gösterilmiştir. (Sub) nüfus are renk kodlu: (i) mavi: 1960-1970; (ii) yeşil: 1970-1985; (iii) kırmızı: > 1999. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig7.jpg"> Şekil 7: ölüm. Mortalite oranları (alt) nüfus başına (1960-1970; 1970-1985; > 1999) ısınma (24 ° C altında) modern sıcaklık rejimleri (18 ° C) ile karşılaştırıldığında gösterilir. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Mesocosm deneyi Seçimin dört hafta sonra temsil 24 ° C, frekans üç ısınma tarafından (alt) nüfus değişmedi (χ2 0,55, P = 0,76 =) ile karşılaştırıldığında ilk inoculum (şekil 8). Mesocosm deneyde aşısını 30 genotip arasında çoğunluk seçim (Şekil 9) dört hafta sonra tespit edilmiştir. Özellikle, %70 inoculated genotip kurtarılan, her bir örnek 32 bireylerin genotip en az bir temsilcisi kurtarma Poissonian beklenti ile uyumlu idi.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig8.jpg"> Şekil 8: yarışma deneme - nüfus sıklığı. Nüfus ortalama medyan ve Dörttebirlikler (25inci ve 75inci), üç için gösterilen D. magna (alt) nüfus mesocosm rekabet deneyler (24 ° C), bir başlangıç eşit frekansta (karşılaştırıldığında seçimde dört hafta sonra başlangıç). (Sub) nüfus renk şekil 6' da gösterildiği gibi kodlarına sahiptir. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig9.jpg"> Şekil 9: yarışma deneme - genotip sıklığı. Genotip Frekanslar — ortalama medyan ve Dörttebirlikler (25inci ve 75inci), ısınma (24 ° C) ile karşılaştırıldığında genotip (noktalı çizgi) bir başlangıç eşit sıklığını maruz dört hafta sonra gösterilir. X ekseni üzerinde isimleri (alt) nüfus gruplandırılmış aşısını genotip kimliği (mavi, 1960-1970; yeşil, 1970-1985; kırmızı, > 1999). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Odağı</td>
			<td>BİR</td>
			<td>Boyut aralığı (bp)</td>
			<td colspan="2">Astar (5' - 3')</td>
			<td>Boya etiket</td>
			<td>Tekrar motifi</td>
			<td>TM</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B008</td>
			<td rowspan="2">HQ234154</td>
			<td rowspan="2">150-170</td>
			<td colspan="2">F: TGGGATCACAACGTTACACAA</td>
			<td rowspan="2">VIC</td>
			<td rowspan="2">(TC) 9
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B030</td>
			<td rowspan="2">HQ234160</td>
			<td rowspan="2">154-172</td>
			<td colspan="2">F: CCAGCACACAAAGACGAA</td>
			<td rowspan="2">EVDE BESLENEN HAYVAN</td>
			<td rowspan="2">(GA) 11
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: ACCATTTCTCTCCCCCAACT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B045</td>
			<td rowspan="2">HQ234168</td>
			<td rowspan="2">118-126</td>
			<td colspan="2">F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC</td>
			<td rowspan="2">NED</td>
			<td rowspan="2">(TG) 8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B050</td>
			<td rowspan="2">HQ234170</td>
			<td rowspan="2">234-248</td>
			<td colspan="2">F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC</td>
			<td rowspan="2">6FAM</td>
			<td rowspan="2">(GAA) 6
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: TATGGCGTGGAATGTTTCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B064</td>
			<td rowspan="2">HQ234172</td>
			<td rowspan="2">135-151</td>
			<td colspan="2">F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA</td>
			<td rowspan="2">6FAM</td>
			<td rowspan="2">(TC) 8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: CAAACGCGTTCGATTAAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B074</td>
			<td rowspan="2">HQ234174</td>
			<td rowspan="2">196-204</td>
			<td colspan="2">F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT</td>
			<td rowspan="2">NED</td>
			<td rowspan="2">(GT) 9
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B096</td>
			<td rowspan="2">HQ234181</td>
			<td rowspan="2">234-240</td>
			<td colspan="2">F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA</td>
			<td rowspan="2">VIC</td>
			<td rowspan="2">(AC) 15
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: TTGAACCACGTCGAGGATTT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B107</td>
			<td rowspan="2">HQ234184</td>
			<td rowspan="2">250-274</td>
			<td colspan="2">F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA</td>
			<td rowspan="2">EVDE BESLENEN HAYVAN</td>
			<td rowspan="2">(CT) 8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">BİLGİ: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Microsatellite multiplex. NCBI katılım numarası (AN), çok katmanlı bilgi, PCR astar dizileri, PCR boyutu aralığı, tekrar motifi, ileri astar ve tavlama sıcaklığı (Tm) gösterilen etiket için kullanılan boya.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Pop büyüme oranı (r)</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evrim (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>30.309</td>
			<td>< 0,001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plastisite (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>531.546</td>
			<td>< 0,001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plastisite (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>65.137</td>
			<td>< 0,001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mortalite</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evrim (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>2.234</td>
			<td>0.1162</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plastisite (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>2.679</td>
			<td>0.1071</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plastisite (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.8657</td>
			<td>0.164</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Verimlilik</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evrim (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.8852</td>
			<td>0.1633</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plastisite (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>6.8934</td>
			<td>0.0117</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plastisite (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.6511</td>
			<td>0,203</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Vadesinde boyutu</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evrim (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>0,211</td>
			<td>0.8106</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plastisite (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>11.1361</td>
			<td>0.0017</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plastisite (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.6586</td>
			<td>0.5225</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Vade sonunda yaş</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evrim (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.7811</td>
			<td>0.4637</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plastisite (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>8.0764</td>
			<td>0.0066</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plastisite (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.088</td>
			<td>0.9159</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Varyans analizi (ANOVA). Hayat Tarih özellikleri ve nüfus artış hızı ısınmaya maruz dirilen (alt) örneğin alınma olasılığını değişiklikler evrimsel adaptasyon (nüfus), plastisite (sıcaklık tedavi), tarafından açıklanmıştır mi test Varyans analizi ve onların etkileşim dönem (plastisite evrimi). Önemli p-değerleri (p< 0,05) kalın olarak gösterilir.
Ek Video 1: tortu çekirdek örnekleme. Big Ben corer kullanımı gösterilmiştir. Big Ben 14 cm bir iç tüp çapı yaklaşık 1,5 m uzunluğunda bir çekirdek boru var. Bir ip ve çubuklar tüp tortu sürücüye bağlı bir corer kafa, bir piston oluşur. Bir çekirdek alıcı küçük bir gemi dağıtılan çekirdek tüp desteklemek için kullanılır. Piston yerçekimi basıncı ile tortu aşağı itti. Bir çerçeve çekirdek tüp pistonu yukarı doğru iter bir değiştirilmiş şişe jack kullanarak yapılan ekstrüzyon işlemi sırasında desteklemek için kullanılır. Her tortu katmanı düz metal bir yüzeye dokunarak toplanan ve uzun süreli depolama için şeffaf örnekleme çanta transfer [karanlık ve soğuk (4 ° C) koşulları]. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video1_Sampling.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek Video 2: Sediment eleme. Sediment eleme için gerekli duyarlılık ölçeği, beyaz örnekleme tepsiler ve jeolojik elekler cihazıdır. Her tortu katmandan en az 5 g radyometrik flört için korunur. Tortu kalan ephippia izole etmek için kullanılır. Tortu ile iki jeolojik elekler, 1 mm ile bir ve ikinci birbiri üstüne yığılmış 125 µm Kafes boyutu ile elenmiş. Orta kil, büyük omurgasızlar ve Partiküler madde ayırmak için 1 mm mesh elek dökülür. 125 µm fileli ikinci elek üzerine döküp orta D. magna ephippia ve küçük partikül madde ayırır. Tortu aliquots sonra bir beyaz örnekleme tepsiye aktarılır. D. magna ephippia göz beyaz arka plan tepsisinde tarafından farkedildi. Ephippia her katmandan ayrı Petri yemeklerinde toplanır. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video2_Sieving_sediment.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek Video 3: kapsülden çıkarma. Bir stereomicroscope altında D. magna ephippia açılan mikrodiseksiyon Forseps ile kitin durumda omurga üzerinde basınç uygulayarak. İç yumurta membran ince kaldırılır ve yumurta hafifçe dinlenme Pasteur pipet ile orta 10 mL içeren bir Petri kabına aktarılır. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video3_Decapsulation.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek Video 4: çıkım. Uzun photoperiod ve 20 ° C maruz kaldıktan sonra embriyo gelişimi 48 h ile birkaç hafta arasında devam eder. Geliştirme tamamlandığında, embriyo yumurta kabuğu'arın ve serbestçe ortamda yüz. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video4_Hatching.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications at JoVE.com

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

Uzun vadeli çalışmalar evrim süreci ve adaptasyon mekanizmaları anlamak için gerekli. Genel olarak, bu çalışmalar araştırmacıların ömür boyu ötesinde taahhütleri gerektirir. Burada, güçlü bir yöntem büyük ölçüde doğal sistemlerinde boyuna verileri oluşturmak için state-of--art veri toplama gelişmeler açıklanmıştır.

Diriliş uyuyan Daphnia magna: Protokolü ve uygulamaları

Long-term studies enable the identification of eco-evolutionary processes that occur over extended time periods. In addition, they provide key empirical ...

resurrection-of-dormant-daphnia-magna-protocol-and-applications

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

18.2K Görüntüleme.  University of Birmingham. Uzun vadeli çalışmalar evrim süreci ve adaptasyon mekanizmaları anlamak için gerekli. Genel olarak, bu çalışmalar araştırmacıların ömür boyu ötesinde taahhütleri gerektirir. Burada, güçlü bir yöntem büyük ölçüde doğal sistemlerinde boyuna verileri oluşturmak için state-of--art veri toplama gelişmeler açıklanmıştır.

Video: Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal behavior questions. The protocol described here provides a simple, reproducible, and controlled method to manipulate DO to study behavioral response in aquatic organisms resulting from hypoxic and anoxic conditions. While performing degasification of water with nitrogen is commonly used in laboratory settings, no explicit method for ecological (aquatic) application exists in the literature, and this protocol is the first to describe a protocol to degasify water to observe organismal response. This technique and protocol were developed for direct application for aquatic macroinvertebrates; however, small fish, amphibians, and other aquatic vertebrates could be easily substituted. It allows for easy manipulation of DO levels ranging from 2 mg/L to 11 mg/L with stability for up to a 5 min animal-observation period. Beyond a 5 min observation period water temperatures began to rise, and at 10 min DO levels became too unstable to maintain. The protocol is scalable to the study organism, reproducible, and reliable, allowing for rapid implementation into introductory teaching labs and high-level research applications. The expected results of this technique should relate dissolved oxygen changes to behavioral responses of organisms.

This article describes a simple and reproducible protocol to manipulate dissolved oxygen conditions in a laboratory setting for animal behavior studies. This protocol may be used in both teaching and research laboratory settings to evaluate organismal response of macroinvertebrates, fishes, or amphibians to changes in dissolved oxygen concentration.

Basit Yaklaşım Hayvan Davranışı Gözlemleri Çözünmüş Oksijen işlemek için

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

Çevre

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Deniz bir Model - olarak Barnacle Balanus improvisus kültür ve gen ekspresyonu

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a series of basic techniques are described to enable observations of the reproductive behavior of a wild-caught gobiid fish, as a model, kept in an aquarium. The method focuses on three steps: collection, transport, and observations of reproductive ecology of a substrate spawner. Essential aspects of live fish collection and transport are (1) preventing injury to the fish, and (2) careful acclimation to the aquarium. Preventing harm through injuries such as scratches or a sudden change of water pressure is imperative when collecting live fish, as any physical damage is likely to negatively affect the survival and later behavior of the fish. Careful acclimation to aquaria decreases the incidence death and mitigates the shock of transport. Observations during captive rearing include (1) the identification of individual fish and (2) monitoring spawned eggs without negative effects to the fish or eggs, thereby enabling detailed investigation of the study species' reproductive ecology. The subcutaneous injection of a visible implant elastomer (VIE) tag is a precise method for the subsequent identification of individual fish, and it can be used with a wide size range of fish, with minimal influence on their survival and behavior. If the study species is a substrate spawner that deposits adhesive eggs, an artificial nest site constructed from polyvinyl chloride (PVC) pipe with the addition of a removable waterproof sheet will facilitate counting and monitoring the eggs, lessening the investigator's influence on the nest-holding and egg-guarding behavior of the fish. Although this basic method entails techniques that are seldom mentioned in detail in research articles, they are fundamental for undertaking experiments that require the captive rearing of a wild fish.

A series of basic methods to enable the study of the reproductive ecology of fish kept in aquaria are described. These are useful protocols for collecting fish using SCUBA, transporting live fish, and observing the reproductive behavior of wild-caught fish kept in aquaria.

Akvaryumda Balıkların Üreme Ekolojisi Araştırmaları İçin Temel Yöntemler

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a ...

Davranış

Drosophila suşlarının uzun süreli korunması için PGC'lerin dondurularak saklanması

Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and phenotypic changes. Development of an alternative method for long-term preservation without such changes is therefore imperative. Despite previous successful attempts, cryopreservation of Drosophila embryos is still not of practical use because of low reproducibility. Here, we describe a protocol for primordial germ cell (PGC) cryopreservation and strain revival via transplantation of cryopreserved PGCs into agametic Drosophila melanogaster (D. melanogaster) host embryos. PGCs are highly permeable to cryoprotective agents (CPAs), and developmental and morphological variation among strains is less problematic than in embryo cryopreservation. In this method, PGCs are collected from approximately 30 donor embryos, loaded into a needle after CPA treatment, and then cryopreserved in liquid nitrogen. To produce donor-derived gametes, the cryopreserved PGCs in a needle are thawed and then deposited into approximately 15&#160;agametic host embryos. A frequency of at least 15% fertile flies was achieved with this protocol, and the number of progeny per fertile couple was always more than enough to revive the original strain (the average progeny number being 77.2 &#177; 7.1), indicating the ability of cryopreserved PGCs to become germline stem cells. The average number of fertile flies per needle was 1.1 &#177; 0.2, and 9 out of 26 needles produced two or more fertile progeny. It was found that 11 needles are enough to produce 6 or more progeny, in which at least one female and one male are likely included. The agametic host makes it possible to revive the strain quickly by simply crossing newly emerged female and male flies. In addition, PGCs have the potential to be used in genetic engineering applications, such as genome editing.

Yazar Spotlight: PGC Kriyoprezervasyon – Drosophila Suşlarının Uzun Süreli Korunmasına Yönelik Alternatif Bir Yaklaşım 

A long-term preservation method for Drosophila strains as an alternative to the frequent transfer of adult flies to fresh food vials is highly desirable. This protocol describes the cryopreservation of Drosophila primordial germ cells and strain revival via their transplantation to agametic host embryos.

İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and ...

Genetik

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biyoloji

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes are controlled by the complex interplay between NSC intrinsic genetic programs with NSC extrinsic factors, local and systemic. In the genetic model organism, Drosophila melanogaster, NSCs, known as neuroblasts (NBs), switch from quiescence to proliferation during the embryonic to larval transition. During this time, larvae emerge from their eggshells and begin crawling, seeking out dietary nutrients. In response to animal feeding, the fat body, an endocrine organ with lipid storage capacity, produces a signal, which is released systemically into the circulating hemolymph. In response to the fat body-derived signal (FBDS), Drosophila insulin-like peptides (Dilps) are produced and released from brain neurosecretory neurons and glia, leading to downstream activation of PI3-kinase growth signaling in NBs and their glial and tracheal niche. Although this is the current model for how NBs switch from quiescence to proliferation, the nature of the FBDS extrinsic cue remains elusive. To better understand how NB extrinsic systemic cues regulate exit from quiescence, a method was developed to culture early larval brains in vitro before animal feeding. With this method, exogenous factors can be supplied to the culture media and NB exit from quiescence assayed. We found that exogenous insulin is sufficient to reactivate NBs from quiescence in whole-brain explants. Because this method is well-suited for large-scale screens, we aim to identify additional extrinsic cues that regulate NB quiescence versus proliferation decisions. Because the genes and pathways that regulate NSC proliferation decisions are evolutionarily conserved, results from this assay could provide insight into improving regenerative therapies in the clinic.

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

A method to reactivate quiescent neural stem cells in cultured Drosophila brain explants has been established. Using this method, the role of systemic signals can be uncoupled from tissue-intrinsic signals in the regulation of neural stem cell quiescence, entry and exit.

Kültürlü Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonu

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

Diriliş uyuyan Daphnia magna: Protokolü ve uygulamaları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Basit Yaklaşım Hayvan Davranışı Gözlemleri Çözünmüş Oksijen işlemek için

Deniz bir Model - olarak Barnacle Balanus improvisus kültür ve gen ekspresyonu

Akvaryumda Balıkların Üreme Ekolojisi Araştırmaları İçin Temel Yöntemler

İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması

İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması

İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin Dugesia

Geçirgenliği için bir yöntem

Kültürlü Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonu