Name: resurrection of dormant daphnia magna: protocol and applications
Uploaded: 2018-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
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この作品は、NERC ハイライト グラント (NE/N016777/1) によって支えられました。Ensis 株式会社環境科学サービス、環境変化研究センター、大学大学ロンドン、サンプリングし、堆積物コアに日付を記入しました。

次の SOP は休眠卵、サンプリング、ephippia 沈殿物、およびクローンの文化 (の確立からの分離の詳細な説明を含むオオミジンコを復活させるためのプロトコルの説明をします図 1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig1.jpg"> 図 1: ステップ バイ ステップ ガイドの復活オオミジンコ。ピストンコアラー (B) と自然な淡水の生息地 (A) の堆積物をサンプリングするとします。1 または 0.5 cm (D) の増分の層の堆積物コア (C) をスライスします。堆積物の各レイヤーは、暗く、冷たい条件 (4 ° C) でサンプル zip ロック袋 (E) に格納されます。堆積物の各層は重さし、地質ふるい (1 mm と 125 μ m メッシュ サイズ、 F) を使ってふるわれました。白い背景のトレイは、オオミジンコephippia (G) を分離する使用されます。互換休眠卵 (H) は、ペトリ皿に転送され、ハッチングを誘導する光と温度の刺激にさらされています。孵化は、別の isoclonal ラインを確立する (私) の jar ファイルに転送されます。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
1 堆積物コアのサンプリング
<ol><li>サンプルから湖や池、ピストンコアラーによる堆積物。このプロトコルは、ビッグ ・ ベンの27を使用、内部管の直径の 14 cm。 ビッグ ・ ベンで長さ約 1.5 m のコアチューブは、ロープと棒が堆積物に管をドライブに接続されている、芯抜き器ヘッドのピストンで構成されています。コア キャッチャー エイズ コアチューブの場合のサポートの堆積物。堆積物を押し出すには、フレームワークのコア管を保持直立し、静止していると (補足のビデオ 1) 押出成形プロセス中に上向きピストンをプッシュする修正したボトルのジャックを使用します。<ol>
<li>水深 1 m 未満の浅い池堆積物に押されて手動で直径 6 cm 以上のプレキシ ガラス重力芯を使用します。</li>
		<li>深い湖の (> 深さ 6 m)、アンカー付きポンツーン ボートのエイズとリビングストン ピストン corers28またはシングル ドライブ グリフィス堆積物 corers を使用します。リビングストン型ドライブ棒ピストンコアラーは、連結の湖沼堆積物に連続 1 メートル ドライブ ソフトを収集する深い 30 m 程度までの水に使用できます。シングル ドライブ グリフィス ピストンコアラーはリビングストン ドライブ棒に標準ポリカーボネート チューブを接続する単純だが強力なコアの頭ので構成されます。Corers は、棒で土砂に押されて、ピストンが底質 (図 2) の回復に必要な吸引を提供します。</li>
		<li>連続取得、不撹乱コア vibracoring を使用します。これらの corers は様々 な水深で動作し、堆積物の岩相ごとに、異なる長さのコア試料を取得することができます。添付のバレルまたはコア管を介して vibracore 頭から転送される低振幅振動液化する堆積物、堆積に浸透する vibracore ユニットに接続されているコア バレルを有効にします。いくつかの vibracorers は、小型、軽量、ポータブル、他の大型船からのみ配置することができます大きなの重いユニットです。Corers は、堆積物の岩相によって決まります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 cm 以下 (補助ビデオ 1) 平らな金属面を使用して増分層のコアを水平方向にスライスします。土砂 corers ここで使用しているものは、押出、堆積層の妨害抑制で静水圧を減らすために設計されています。他の corers を使用すると、各堆積物層の外側の皮が層の間で汚染を制限するブレードのクッキー カッターの並べ替えと削除可能性があります。</li>
	<li>各堆積物層別サンプリング バッグ (補助ビデオ 1) を収集し、暗くて寒い (4 ° C) に状態を格納します。</li>
	<li>放射年代測定のすべてのレイヤーから土砂の 5 g の最小値を収集します。出会い系分析の詳細な説明のための確立されたプロトコルは、放射年代測定、既存出版物12,13を参照してください。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig2.jpg"> 図 2: プロシージャを掘削ピストンの漫画。ピストンコアラー、中空の管、内部摺動シール (ピストン) 弱い真空を生成します。ピストン触れる土砂水インターフェイスと、重量は、堆積物にコア バレルをプッシュし、真空を引き起こすと、入力管を沈殿物の層を乱すことがなく移動入りされている堆積物。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2. 沈殿物の層のふるい分け
<ol><li>精密スケールを使用して、将来の参考のため各堆積物層の重量を量る。湖で種の密度を計算するのに面積と重量を使用します。</li>
	<li>互いの上に積まれて 2 つの地質学的ふるいを使って各堆積物層をふるい。最初のふるいは 1 ミリメートルのメッシュ サイズがあるし、堆積物の残りの部分から粘土、大型無脊椎動物と粒子状物質、例えば種子、植物、昆虫を分離します。2 番目のふるいが 125 μ m のメッシュありD. 漫画ephippia と小さな粒子を (補助ビデオ 2) 堆積物の残りの部分から分離します。</li>
	<li>
125 μ m メッシュのふるいの上に収集された堆積物画分の小さい因数を白い背景トレイに転送します。堆積物の種類に応じて各時の堆積物の拡大または縮小の因数が譲渡すること。
	<ol>
<li>少量を追加 (最大 200 mL) サンプリング白トレイは再転送された土砂の一部を中断し、目を ephippia (図 3) のスポッティングを容易にする媒体の。堆積物を再懸濁しますに使用される媒体は、脱塩素水道水、ボーリング水、コンボ29、またはアダム媒体 (Aachener Daphnien)30することができます。以下、用語 '中' は、記載されているのいずれかまたはすべてのソリューションを参照する使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig3.jpg"> 図 3:オオミジンコephippium。カプセル化解除後すぐにミジンコ休眠卵。Ephippium (A)、(B)、内側の卵膜と休眠卵 (C).のとおりスケール バー = 500 μ m。
3. Ephippia と孵化のカプセル化解除
<ol><li>使い捨てパスツール ピペットやレーザーマイクロダイ セクション鉗子を使用して、転送ペトリ皿に個々 の ephippia は 10 mL の培地でいっぱい。土砂の層あたり少なくともペトリ皿を使用します。</li>
	<li>ステレオ顕微鏡、カプセル化の解除でキチン ケース (補助ビデオ 3) 強制的に開くレーザーマイクロダイ セクション鉗子を使用して各 ephippia。卵を妨害しないように注意を払って微妙、休憩卵の内膜を削除し、パスツール ピペットを使用して媒体でいっぱいペトリ皿に転送します。カプセル化解除増加D. マグナ;の孵化成功しかし、必要ない場合があります。 またはかもしれない他のミジンコ種より小さい ephippia を生産の挑戦。</li>
	<li>温度管理デバイス (インキュベーター) または部屋でカプセル化解除される卵を完全なスペクトルの長い一日の日長ライト (16:8: 明暗) ・孵化を誘発する高温 (20 ± 1 ° C) を公開します。48 h と (4 つまでの数週間の間に孵化が発生します補足動画 4)。カプセル化解除を行わない場合、直接刺激 (長い日日長光 (16:8: 明暗) と高温 (20 ± 1 ° C)) を孵化する ephippia を公開します。</li>
</ol>4.オオミジンコの Isoclonal ラインの確立
<ol><li>ステップ 3.3 使い捨てパスツール ピペットを使用して媒体の 200 ml 瓶を分離するから個別D. マグナを移すことによって単一の孵化から isoclonal ラインを確立します。各個人は遺伝的に異なる、生殖の結果であります。</li>
	<li>Isoclonal ライン 10 ± 1 ° C、16:8: 明暗政権から成る在庫状況で無期限にはうんざり 0.2 mg C/Lクロレラまたは他の緑藻を (例えばイカダモ斜) の毎週を維持します。毎月第 3 週中を更新します。温度、供給体制、および種の在庫状況が異なります。</li>
</ol>5 主要な研究
注: 2 つの主要な研究の説明は、温暖化に対する進化的応答を評価するために使用される湖リング (デンマーク) の堆積のアーカイブから集団が復活D.magna (サブ) の提供です。(サブ) の 3 つの集団が次の時間帯から復活した: 1960 年-1970 年、1970-1985 と > 1999。D. マグナ孵化 11、58% (図 4) の間であった堆積アーカイブから成功。各期間から得られる子かめからランダムなサブセットは、ここで説明した 2 つの主要研究に選ばれました。これらの研究は、温度勾配に沿って異なる期間から復活 (サブ) 集団フィットネス リンク生活史形質 (5.1) の違いを示したかどうか、彼らは別の競争力のある能力 (5.2) を持っていたかどうかを評価するために設計されました。後地球温暖化への暴露。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig4.jpg"> 図 4: 孵化成功湖リングからサンプリングされた堆積アーカイブにします。主要な研究で使用される湖リングの堆積アーカイブに沿って成功した孵化の割合。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol><li>
共通の庭の実験
	<ol>
<li>株式文化から一般的な庭の状態に (サブ) 人口当り 10 孵化を転送: 16 ° C長日 (16:8: 明暗政権)0.8 mg C/Lクロレラ、毎日フィードし、更新中 1 日おき。少なくとも 2 つの世代 (約45 日) の共通の庭の状態で孵化を維持します。共通の庭の条件は母体の効果からの干渉を減らすし、孵化の間で複製を同期します。</li>
		<li>リリース時に 2 回目の雛の育房に、稚魚の 2 番目の雛がリリースされるまでメディアでいっぱい 500 mL 瓶に第二世代から大人の女性を転送します。</li>
		<li>24-48 h、100 mL 瓶媒体を充填し、次の実験条件にさらされる第二世代の 2 番目の雛から生まれた個々 稚魚をランダムに転送: 18 ° C (湖の現在温度) と (地球温暖化、温度 24 ° C予想 IPCC 26今後の 100 年のため) 16:8: 明暗政権とフィード毎日 0.8 mg Chlorellavulgarisの C/L。</li>
		<li>それぞれの実験動物の頭と尻尾の棘 (図 5) のベース間の距離として顕微鏡で成熟サイズを測定します。それぞれの動物を撮影し、その後適切なイメージ ソフトウェアを使用してそのサイズを分析します。</li>
		<li>満期年齢を測定: ひなの商工会議所で初めての卵が観察される日。</li>
		<li>死亡率の測定: 実験中に絶滅の個体数です。</li>
		<li>多産の測定: 最初と 2 番目のクローン再生でリリースの子孫の総数。</li>
		<li>オイラーの方程式 (1) を用いて、人口増加率を測定します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56637/56637eq1.jpg">(1) Lxが年齢xで生存の割合は、 bxは年齢xで生存する個人あたりの新生児の数生産し、r は内的自然増加率です。</li>
		<li>市販のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。ここでは、R31を使用して反応規範 (環境全体で単一遺伝子の形質発現) ggplot2 パッケージを使用して、各生活史形質を印刷します。生存時間解析 (R パッケージ rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf) 経由で人口当たりの死亡率を計算します。最後に、R31形質に及ぼす温度の影響 (個体差) の進化によって説明できるかどうかを評価するために、分散分析 (ANOVA,表 2) を実行可塑性 (治療への応答)、またはの進化可塑性 (人口 × 治療)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
競争実験
	<ol>
<li>株式文化から一般的な庭の状態に人口あたりの 10 の孵化を転送: 20 ° C、長い日長 (16:8: 明暗政権)、0.8 mg 、クロレラの C/L 毎日フィードし、更新中 1 日おき。(約45 日) 母性効果からの干渉を減らすために、少なくとも 2 世代の共通の庭の状態を維持します。</li>
		<li>各雛の第二世代の第 2 のひなから 10 動物/L の密度で、トリプリケートで実験メソコスム (20 L プラスチック水槽中でいっぱい) に 24 〜 48 時間の 5 少年をランダムに割り当てる</li>
		<li>24 ° c、16:8 L:D 政権メソコスムを公開し、毎日 0.8 mg C/L Chlorellavulgaris温度制御室または 4 週間の最小値のためのインキュベーター内のフィード (> 3 クローン世代)。</li>
		<li>ミジンコが自然の環境で発生可能性のある動態をシミュレートするために媒体の 10% を更新、毎週各のメソコスムを殺処分します。培地および各水族館 (この場合は 1.2 L) から動物の知られているボリュームを削除することによって、新鮮な媒体に選別ボリュームを置き換えることで殺処分を課します。実験動物 (10 日目) に成熟に達する後殺処分制度を開始します。</li>
		<li>第 4 週の終わりには、初期の接種と比較して遺伝的組成の変化を評価するために各メソコスムから 32 動物をサンプルします。<ol>
<li>マイクロ遠心チューブ用の個々 のミジンコを置き、パスツール ピペットの助けを借りて、余分な液体を除去します。</li>
			<li>フラッシュは、液体窒素、-80 ° C の店で個々 の管を凍結します。</li>
			<li>利用可能なプロトコルを使用して、製造元の指示に従って単一の個人からゲノム DNA を抽出します。</li>
			<li>雛あたり独特さし木の遺伝子型を提供するために十分な遺伝標識の番号を使用して抽出した DNA を増幅します。ここでは、単一マルチプレックス (M01,表 1) に配置された 8 サテライトは次の確立したプロトコル32,33を使用されました。</li>
			<li>遺伝子には、フラグメント ・ アナライザーの断片が増幅されます。</li>
			<li>商業または自由に利用できるソフトウェアの適切なサイズの標準を使用して、フラグメント解析を行います。</li>
			<li>説明33、および初期の接種と比較して実験の終わりに各遺伝子型の頻度計算としてのマイクロ サテライト マーカーのセットと遺伝子型、32 人による実験の終わりに遺伝的組成を評価します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig5.jpg"> 図 5: 大人の女性オオミジンコ。単為発生卵育房の大人女性オオミジンコ。頭と尻尾の背骨の付け根の間の距離は、動物のサイズを測定する使用されます。赤い線は、サイズ測定を示します。スケール バー = 500 μ m。

著者がある何も開示するには

水の高熱伝導による淡水生態系、生物多様性損失に直面してグローバル生態系よりもリスクが高い地球温暖化34。したがって、これらの生態系のキーストーン種の応答を理解し、熱応力を生き残るために対処するメカニズムを識別するために重要です。種や群集レベルでのこれらのメカニズムの解明はどのように種は地球温暖化により影響を受けるし、どのように個々 の種に及ぼす影響は他の栄養レベルにカスケードを予測を助けることができます。最終的には、地球温暖化への応答のメカニズムを理解することにより、絶滅を軽減するための改善戦略の同定。
ここで紹介する事例を示すD. マグナの温度上昇に対する反応の媒介行き渡って生活史形質の可塑性と温度上昇だけでレスポンスの明確な適応コストを課すことはありません少なくとも、人口はここで学んだ。生活史形質の高い可塑性は、地球温暖化の存在下で (サブ) 集団の競争能力の非有意差によってサポートされます。ただし、複数の個体群の長期的な競争実験これらの調査結果を一般化する必要があります。
休眠ステージの復活は、時間10種の進化の軌跡と適応メカニズムを研究する前例のないリソースを提供します。動物プランクトン種急速な生成時間 (約 2 週間) や先祖、子孫に対して headtohead を競争または 'リプレイ' 過去のさまざまな状態から始まる進化を可能にする休止状態段階の生存の恩恵します。復活生態は本質的に特定の進化の結果はいくつかの事前のイベント次第であるかどうかの調査を実行できます。進化の遺伝的要素の id は、現在の進化した子孫6との比較分析のための微生物を '先祖ライン' を凍結し、蘇生を用いた室内実験で可能です。生物実験室での作業の主な制限の 1 つは '先祖の状態が既にシフトのベースラインであること。休止状態段階の研究により、供試体から任意のストレス事象 (例えば、自然のままの環境条件) 時から、過去のさまざまな状態を乱さない環境条件から進化の軌道を測定するためのサンプリングまで現代。近年、復活または休止状態のまま動物プランクトンの段階で DNA 多型の研究は現代の人口14の遺伝子構造に貢献した過去の人口統計学および適応プロセスに重要な洞察を提供して,16,25,33,35,36. ゲノムとトランスクリプトーム復活または休止状態のままステージの高スループット シーケンス テクノロジーの高いアクセシビリティを指定してを配置できます、上個体群の進化における蓄積型と遺伝の変更の数時間を測定します。
復活紹介 SOP マルチ オミックスの分野で重要なアプリケーションを 2 つのレベルに。マルチ オミックス技術は、環境選択圧に適応応答に関与する分子素子の網羅的解析をできるように復活の標本に適用できます。また、オミックス技術はまだ休止状態段階ですが互換に適用できます。これまでのところ、休眠期に高スループット シーケンス テクノロジーのアプリケーションは入力材料の大きい量の条件によって制限されており。これらの制限は、リフト37をされています。入力素材と流体素子の進歩の低下の要件に全ゲノム配列 (WGS) が少しとして 1 から可能になりました ng または材料38を開始いくつかの pg。全ゲノム増幅 (WGA) と全トランスクリプトーム増幅 (WTA) 技術、組織の非常に少量からの RNA そして DNA の濃縮の有効化の使用はメタゲノミクス39,40医療に革命をもたらしました41を研究します。互換休眠卵に適用されるこれらの技術は、休眠中の段階の生存率および拡張の期間 (例えば世紀) の調査に関連する制限の超過を有効にします。
無脊椎動物群集の休憩の段階の生産の復活によりコミュニティ歴史自然の風景で知られている変更や堆積物中の orsoils2の解析からみた環境変遷の配置です。コミュニティ環境変動への応答の変化の分析は、人口永続化43, 栄養相互作用44 に実質的な影響を持つ環境進化フィードバック42を定量化する能力を提供してくれます、コミュニティ アセンブリ45、および生態系の機能・ サービスの46に変更。最後に、環境変化に対する生体の応答について正確な予測が重要47生物多様性の保護を導くためです。アカウント人口統計学、散布、進化、種の相互作用など重要な生物学的メカニズムを考慮されていませんので、現在の予測モデルはこの点で正確ではありません。これらのプロセスの変更を理解し、事前の予測モデルとしてこの情報を使用して種を予測する能力を向上させる、環境に直面してコミュニティの永続化の変更2。
ここで紹介する SOP のアプリケーション課題があります。休眠ステージの復活の主な制限は、サンプリングのための特殊な装置の必要性です。さらに、土砂ふるいクローン文化の確立から、プロセス全体は、手にかなりの時間を必要があります。
ここで示した SOP 手順の一部は容易に他のミジンコ種に譲渡です。これらは、: サンプリング、系統と実験的なデザインの確立。ただし、SOP の他の手順はさらに調査の下で種に合わせた最適化を必要があります。カプセル化解除多くの場合、孵化の成功を改善するD. マグナ標本に適用されます。ただし、このアプローチより少量の試料に適したかもしれません。種48および同種試料49の間では、孵化刺激によっても異なります。したがって、SOP の孵化手順のアドホック最適化アプリケーションその他の甲殻類を前に必要があります。D. マグナの人口湖リング (堆積アーカイブ全体では 30.5%) から復活の孵化成功は以前の結果49に沿って、しながら孵化成功堆積物、種の保存状態によって異なります50,51及び土砂48の地理的な起源。エントリと休眠の段階を経て進行するようすを調節するメカニズムの今後の課題が異なる種に合わせた最適な孵化刺激を識別するために必要です。
最後に、背景的知識の学習システムの特に時間をかけて興味の種の存在はことをお勧めします。これは、歴史的な記録で実現できます。史料が利用できない場合をサンプリングし、コアの採取前に湖の堆積物の表面層のスクリーニングがお勧め、それは最も最近の歴史にだけ情報を提供可能性があります。

長期的な研究は生態学的・進化的プロセス、自然と種に対応し、環境変化1中に保持する方法の評価を理解するために重要です。これは、エコ進化のプロセス世代にわたって起こる長い時間スパンで環境の変化が発生するためです。さらに、長期的な研究は、環境の変化2自然の生態系の進化的応答を予測する予測モデリングの精度を向上させるキーの実証的データを提供します。これらのモデルの精度は、生物多様性と生態系サービスを維持するために管理と保全戦略の実装に不可欠です。
長期的な研究が主研究室5,6で伝達できます短い世代時間を種に限られているいくつかの例外的な場合 (例えば、ガラパゴス ダーウィンのフィンチの3や藻類の4)、除く,7,8します。 したがって、進化のダイナミクスを支えるプロセスのとらえどころのないままです。時間のサンプルへのアクセスに関連するロジスティックの問題のため実証データより頻繁に一時的なコンテキストの空間よりも検討していると推測、または空間データからモデル化される時空間エコ進化の過程。このアプローチは、' 時空 ' 置換9、進化のダイナミクスを研究する際に代理として空間を採用するというと呼ばれます。'時空' 置換の主な制限は、同じ人口の変動と異なる空間スケールでの適応の料金は異なることしたがって、空間と時間の交換に基づく推論バイアス10にあります。
時間をかけて自然の生態系の進化のダイナミクスを研究する強力な代替手段は、生産休止状態段階11種の生態学的、遺伝的変化の分析です。これらの休止状態の段階が正確に日付がつく成層フォーム生物アーカイブに蓄積し、paleolimnologically12,13を特徴とします。重要なは、これらの休止状態の段階は蘇生し、環境の変化に彼らの進化的応答を直接測定できる、実験室で使用できます。人口推移は、フィットネスの変更、環境の変更14,15,16のステップで進化する遺伝子の機能を研究する現代進化した子孫競んだことができます。
休止状態の段階では卵の銀行など、種、嚢胞、胞子。復活の生態学の分野が正式にされている後半 1980 年代の17、および研究の一握りに戻って休眠卵の蘇生日付に関する最初の研究は、初期の 1990 年代18,19でこの手法を適用しているがKerfoot と 1999年20で同僚の精液の紙によって設立。この実習は、淡水種17,21,22paleolimnological 再建を中心に適用されています。ただし、わいろはまだ利用できません。ここでは、孵化からクローン培養の確立に堆積物のサンプリングから、動物プランクトン種ミジンコ休眠卵に適用復活プロトコルの手順を追って説明が提供されます。ミジンコの他の種に容易に譲渡することは、SOP の手順だけでなく、さらなる最適化が必要な手順を説明します。
ミジンコは、淡水動物プランクトンに共生性生息地23の大半に存在です。ミジンコ種、どちらか偏無性または循環的な parthenogens です。D. マグナは24好ましい環境条件の下でクローンを再現した循環的な parthenogen です。環境条件が悪化すると、男性の生産が発生し、有性生殖の組換えは、ephippium と呼ばれるキチン ケースによって環境から保護されて休眠状態に入る受精卵の形成に 。これらの休眠卵の孵化良好な環境条件を返すときの割合。ただし、休眠卵の銀行の大きい割合に決してハッチ、したがって生物学的アーカイブを時間をかけて構築するチャンスがあります。休止状態の段階は湖や池の堆積物で埋まったままし、長期にわたる進化ダイナミクスの研究を復活することができます。D. マグナの休眠卵は有性生殖の組換えの結果なので25種の自然な遺伝的多様性をうまく表現しています。また、彼らクローン生殖実験室で使用して管理できます。これらの特徴は、自然な遺伝的多様性を維持しながら、同質のモデル生物のユニークな利点を提供します。
2 主要な研究は、時間をかけて環境選択圧が発生して直接D. マグナの同じ人口の歴史的および現代の子孫を比較することの利点を実証する掲載されています。D. マグナ標本湖リング (デンマーク)、浅いから復活した (5 m 深さ; 表面 22 ha) 混合の池は、時間の経過とともに平均温度と熱波の発生の増加を経験しています。D. マグナ(サブ) 集団 (1960-2005 年) の 60 年にわたるこの時空間勾配に沿って復活し、温度が温暖化に対する進化的応答比較検討しました。一般的な庭の実験の最初の研究で今後 100 年間の気候変動の政府間のパネルの予測に沿って、+6 ° C の温度の増加への応答でフィットネス リンク生活史形質の変化を調べた26. メソコスム実験だった 3 つの競争力を測るため 2 番目の研究では、温暖化の下で (サブ) 集団。組み合わせてこれらの実験を示す唯一のストレスとして地球温暖化の存在下ですべての生活史特性と人口可塑性の高いレベルを示す等しい競争力のある能力を持っています。ここで学んだ単一応力をかけない重要なフィットネス コスト少なくとも人口が温暖化が示唆されました。

<table><tbody><tr><td>sampling bags</td><td>Fisher Scientific</td><td>11542783</td><td>Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89&amp;micro;m thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand</td></tr><tr><td>piston corer</td><td>ENSIS ltd</td><td>na</td><td>Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC</td></tr><tr><td>precision scale</td><td>Veritas-M124A</td><td>TLP-50</td><td>Analytical Balance</td></tr><tr><td>geological sieve</td><td>UKGE limited</td><td>SV7521</td><td>200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh</td></tr><tr><td>geological sieve</td><td>UKGE limited</td><td>SV7525</td><td>200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh</td></tr><tr><td>white sampling tray</td><td>nhbs</td><td>http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509</td><td>Standard mulipurpose lab trays</td></tr><tr><td>pasteur pipette</td><td>Globe Scientific inc.</td><td>138020B</td><td>Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL</td></tr><tr><td>stereo microscope</td><td>nikon</td><td>smz800</td><td>Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit</td></tr><tr><td>petri dish</td><td>EduLab</td><td>153-533</td><td>Sterile 90mm diameter plastic petri dish</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>compak</td><td>Round Jam Jars 4oz</td><td>100 mL jars</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>compak</td><td>Atum Jars/ Bonta Jar 10oz</td><td>200 mL jars</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>bottlecompanysouth</td><td>500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid</td><td>500 mL jars</td></tr><tr><td>statistical software R</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td>na</td><td>Free online GNU&amp;nbsp; language and environment for statistical computing and graphics</td></tr><tr><td>microdissection forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>41122405</td><td>Fine point stainless steel forceps for microdissections</td></tr><tr><td>image software</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td><td>na</td><td>Open source ImageJ image processing toolkit written in Java</td></tr><tr><td>mesocosm</td><td>amazon</td><td>na</td><td>Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter</td></tr><tr><td>mirocentrifuge tubes</td><td>Sigma_Aldrick - Merck</td><td>Z606340</td><td>premium microcentrifuge tubes 1.5 mL</td></tr><tr><td>AGENCOURT DNAdvance</td><td>Beckman Coulter</td><td>A48705</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>size standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td>LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers</td></tr><tr><td>ABI3032 sequencer</td><td>ABI</td><td>na</td><td>Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing</td></tr></tbody></table>

resurrection of dormant daphnia magna: protocol and applications

長期的な研究は、長期にわたる発生するエコ進化プロセスの識別を有効にします。さらに、今後の環境変化に自然の生態系の進化的応答を予測する予測モデリングに使用可能性がありますキーの実証的データを提供します。ただし、いくつかの例外的な場合を除き長期的研究が不足している時間のサンプルへのアクセスに関連付けられているロジスティックの難しさのためです。ダイナミクスよく野生の自然個体群の進化を再構築する優れた研究と実験室または制御メソコスム実験が研究されています。
復活したり、復活休眠オオミジンコ、水生生態系の広範な動物プランクトン キーストーン種の新式の縦断的データ収集を劇的に向上する標準操作手順 (SOP) を提供するここでは、自然のシステム。復活の生態学の分野は、にもかかわらず、最初の試みは 1980 年代後半に戻って休眠動物プランクトンの卵の日付を孵化で Kerfoot および同僚によって 1999 年に定義されました。以来 Kerfoot の精液のペーパー、動物プランクトン種を復活させる方法論はますます頻繁応用された、直接の知識の伝達を介してのみ研究所の間で伝達されるが。ここで、SOP は説明した休眠オオミジンコを復活の実践手順プロトコルを提供する卵。
2 主要な研究は、提供するのフィットネス応答復活するミジンコ集団で測定地球温暖化、同じ設定で歴史と近代的な人口を勉強する能力を生かしてします。最後に、復活または休止状態のままステージに次世代シーケンス技術のアプリケーションを説明します。これらの技術は、プロセスと時間をかけて選択圧力の変化を経験している集団に適用した場合の進化のメカニズムを解剖を前例のない電力を供給します。

長期的な実証的データは自然集団の永続性と進化ダイナミクスの理解に重要です。このようなデータ ロジスティック困難時間サンプルおよびデータ コレクションに長期的なコミットの要求へのアクセスに関連付けられているため取得する一般的に挑戦しています。2 主要な研究紹介、淡水生態系における中央 zooplankter の温度に応答の実証的証拠は進化の倍以上提供されています。これは、一般的な実験設定の環境ストレスに対する歴史的な人口および彼らの現代子孫の応答を研究する機会を提供する層状休眠卵の銀行を使用して有効です。
共通の庭の実験 一般的な庭の実験は、すべての生活史特性が温度に対応することを示した (図 6と図 7)。分散分析では、すべての (サブ) 人口がある応答性の高い死亡率を除いて気温可塑性 (表 2) を経由する対応を明らかにしました。大幅増加の 3 分の 2 の人口増加率 (表 2) でのみ観察された進化的変化 ((サブ) 集団間違い) の証拠 (サブ) 人口 24 の ° c (図 6)。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig6.jpg"> 図 6: 一般的な庭実験。共通の庭および現在温度の政体 (18 ° C) と比べて (24 ° C) を温暖化温度の下で各 (サブ) 人口の生活史形質 (産卵数、サイズ、および成熟年齢) および人口増加率 (r) の反応基準が表示されます。人口増加率は 'r' は、オイラー方程式 (1) を使用して計算されます。信頼区間が表示されます。(サブ) の集団が色分け: 青 (i): 1960 年-1970 年;(グリーン ii): 1970-1985 年;(iii) 赤: > 1999。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig7.jpg"> 図 7: 死亡。(サブ) の人口当たりの死亡率 (1960 年-1970 年; 1970-1985 年; > 1999) 現代温度の政体 (18 ° C) と比較すると地球温暖化 (24 ° C) の下に表示されます。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
メソコスム実験 地球温暖化で 24 ° C、3 つの周波数で表される選択の 4 週間後 (サブ) 人口が大幅に変更していない (χ2 = 0.55、P = 0.76) に比べて初期接種 (図 8)。メソコスム実験接種 30 遺伝子の中で大半が選択 (図 9) の 4 週間後確認されました。具体的には、接種の遺伝子型の 70% が回復、ポアソンの 32 個人のサンプル各遺伝子型の少なくとも 1 つの代表を回復期待と互換性があります。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig8.jpg"> 図 8: 競争実験 - 人口の周波数。人口平均中央値と四分位数 (25thと 75th) が 3 つ表示されます (初期の等しい周波数に比べてメソコスム競争実験 (24 ° C) での選択の 4 週間後D.マグナ (サブ) 集団開始)。(サブ) 集団は、図 6に示すように、色分けです。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig9.jpg"> 図 9: 競争実験 - 遺伝子型頻度。遺伝子型頻度-地球温暖化 (24 ° c) 遺伝子型 (点線) の初期の等しい周波数と比較すると露出の 4 週間後平均中央値と四分位数 (25thと 75th) が表示されます。X 軸の名前が (サブ) 人口当たりグループ化接種遺伝子型 ID (青、1960 年-1970 年; 赤、緑、1970-1985 > 1999)。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/56637fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>軌跡</td>
			<td>、</td>
			<td>サイズの範囲 (bp)</td>
			<td colspan="2">プライマー (5' 3')</td>
			<td>染料ラベル</td>
			<td>モチーフを繰り返す</td>
			<td>Tm</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B008</td>
			<td rowspan="2">HQ234154</td>
			<td rowspan="2">150-170</td>
			<td colspan="2">F: TGGGATCACAACGTTACACAA</td>
			<td rowspan="2">ヴィック</td>
			<td rowspan="2">(TC)9
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B030</td>
			<td rowspan="2">HQ234160</td>
			<td rowspan="2">154-172</td>
			<td colspan="2">F: CCAGCACACAAAGACGAA</td>
			<td rowspan="2">ペット</td>
			<td rowspan="2">(ジョージア州)11
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B045</td>
			<td rowspan="2">HQ234168</td>
			<td rowspan="2">118-126</td>
			<td colspan="2">F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC</td>
			<td rowspan="2">ネッド</td>
			<td rowspan="2">(TG)8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B050</td>
			<td rowspan="2">HQ234170</td>
			<td rowspan="2">234-248</td>
			<td colspan="2">F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC</td>
			<td rowspan="2">6FAM</td>
			<td rowspan="2">(GAA)6
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B064</td>
			<td rowspan="2">HQ234172</td>
			<td rowspan="2">135-151</td>
			<td colspan="2">F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA</td>
			<td rowspan="2">6FAM</td>
			<td rowspan="2">(TC)8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B074</td>
			<td rowspan="2">HQ234174</td>
			<td rowspan="2">196-204</td>
			<td colspan="2">F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT</td>
			<td rowspan="2">ネッド</td>
			<td rowspan="2">(GT)9
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B096</td>
			<td rowspan="2">HQ234181</td>
			<td rowspan="2">234-240</td>
			<td colspan="2">F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA</td>
			<td rowspan="2">ヴィック</td>
			<td rowspan="2">(AC)15
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TTGAACCACGTCGAGGATTT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B107</td>
			<td rowspan="2">HQ234184</td>
			<td rowspan="2">250-274</td>
			<td colspan="2">F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA</td>
			<td rowspan="2">ペット</td>
			<td rowspan="2">(CT)8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: マイクロ サテライト マルチプレックス。NCBI の加盟数 (AN)、多重情報、PCR のプライマー シーケンス、PCR サイズ範囲、繰り返しのモチーフ、前方のプライマーおよびアニーリングの温度 (Tm) は、表示されるラベルに使用される染料。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">ポップの成長率 (r)</td>
			<td>Df</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">進化 (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>30.309</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">可塑性 (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>531.546</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol。可塑性 (ポップ x 温度)</td>
			<td>2</td>
			<td>65.137</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">死亡率</td>
			<td>Df</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">進化 (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>2.234</td>
			<td>0.1162</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">可塑性 (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>2.679</td>
			<td>0.1071</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol。可塑性 (ポップ x 温度)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.8657</td>
			<td>0.164</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">産卵数</td>
			<td>Df</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">進化 (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.8852</td>
			<td>0.1633</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">可塑性 (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>6.8934</td>
			<td>0.0117</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol。可塑性 (ポップ x 温度)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.6511</td>
			<td>0.203</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">満期時のサイズ</td>
			<td>Df</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">進化 (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.211</td>
			<td>0.8106</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">可塑性 (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>11.1361</td>
			<td>0.0017</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol。可塑性 (ポップ x 温度)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.6586</td>
			<td>0.5225</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">満期年齢します。</td>
			<td>Df</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">進化 (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.7811</td>
			<td>0.4637</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">可塑性 (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>8.0764</td>
			<td>0.0066</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol。可塑性 (ポップ x 温度)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.088</td>
			<td>0.9159</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 分散分析(ANOVA).分散分析の生活史形質と温暖化にさらされている復活 (サブ) 人口の人口増加率の推移は進化的適応 (集団)、可塑性 (温) で説明したかどうかをテストし、相互作用の用語 (可塑性の進化形)。重要なp-値 (p< 0.05) が太字で表示されます。
補助ビデオ 1: 堆積物コアのサンプリングします。ビッグ ・ ベンの芯抜き器の使用が表示されます。ビッグ ・ ベンは、内部管直径 14 cm で長さ約 1.5 m のコア管です。ロープと棒が堆積物に管をドライブに接続されている、芯抜き器ヘッドのピストンで構成されています。中心のキャッチャーを使用して、小型船舶から展開されているコアチューブをサポートします。ピストンは重力の圧力によって堆積物にプッシュ ダウンされます。フレームワークを使用して、ピストンを上方にプッシュする修正したボトル ジャッキを使用して遂行押出プロセス中に炉心管をサポートします。各堆積物層が平らな金属表面に収集され、長期保管のための透明なサンプリング バッグに転送 [暗く、冷たい (4 ° C) の条件]。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video1_Sampling.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補助ビデオ 2: 堆積物のふるい分け。堆積物のふるい分けに必要な機器は精密スケール、白いサンプリング トレイおよび地質ふるいです。各堆積層から少なくとも 5 g は、放射年代測定の保持されます。堆積物の残りの部分を使用して、ephippia を分離します。堆積物は 2 つの地質学的ふるい、1 つは 1 mm、125 μ m メッシュ サイズは、互いの上に積まれて 2 番目をふるわれました。媒体は、粘土、大型無脊椎動物および粒子状物質を分離する 1 mm メッシュのふるいに注がれています。培地 125 μ m メッシュの 2 番目のふるいの上に注がれるD. マグナephippia と小さな粒子状物質を分離します。堆積物の因数は、白いサンプリング トレイに転送されます。D. マグナephippia ホワイト バック グラウンド トレイに目で斑点を付けられます。各レイヤーから Ephippia は、独立したペトリ皿に収集されます。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video2_Sieving_sediment.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補助ビデオ 3: カプセル化解除します。、顕微鏡下D. マグナephippia はキチン ケースの背骨に圧力を適用することによってレーザーマイクロダイ セクション鉗子で開かれます。内側の卵膜が削除され繊細なパスツール ピペット 10 ml 中のシャーレに転送卵をゆっくり休んでいます。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video3_Decapsulation.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補助ビデオ 4: 孵化します。長い日長と 20 ° C への暴露, 後胚発生を 48 時間と数週間の間再開します。開発が完了したら、胚は卵の殻から抜け出すし、中で自由に泳ぐ。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video4_Hatching.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications at JoVE.com

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

長期的な研究は、進化の過程と適応のメカニズムを理解することに不可欠です。一般的に、これらの研究は、研究者の人生の時間を超えてのコミットメントを必要があります。ここでは、強力な方法、自然における縦断的データを生成する最新のデータ収集を劇的に進むことを説明します。

休眠復活オオミジンコ: プロトコルおよびアプリケーション

Long-term studies enable the identification of eco-evolutionary processes that occur over extended time periods. In addition, they provide key empirical ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

18.2K ビュー.  University of Birmingham. 長期的な研究は、進化の過程と適応のメカニズムを理解することに不可欠です。一般的に、これらの研究は、研究者の人生の時間を超えてのコミットメントを必要があります。ここでは、強力な方法、自然における縦断的データを生成する最新のデータ収集を劇的に進むことを説明します。

ビデオ: Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal behavior questions. The protocol described here provides a simple, reproducible, and controlled method to manipulate DO to study behavioral response in aquatic organisms resulting from hypoxic and anoxic conditions. While performing degasification of water with nitrogen is commonly used in laboratory settings, no explicit method for ecological (aquatic) application exists in the literature, and this protocol is the first to describe a protocol to degasify water to observe organismal response. This technique and protocol were developed for direct application for aquatic macroinvertebrates; however, small fish, amphibians, and other aquatic vertebrates could be easily substituted. It allows for easy manipulation of DO levels ranging from 2 mg/L to 11 mg/L with stability for up to a 5 min animal-observation period. Beyond a 5 min observation period water temperatures began to rise, and at 10 min DO levels became too unstable to maintain. The protocol is scalable to the study organism, reproducible, and reliable, allowing for rapid implementation into introductory teaching labs and high-level research applications. The expected results of this technique should relate dissolved oxygen changes to behavioral responses of organisms.

This article describes a simple and reproducible protocol to manipulate dissolved oxygen conditions in a laboratory setting for animal behavior studies. This protocol may be used in both teaching and research laboratory settings to evaluate organismal response of macroinvertebrates, fishes, or amphibians to changes in dissolved oxygen concentration.

動物の行動観察のための溶存酸素を操作するための単純なアプローチ

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

環境学

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a series of basic techniques are described to enable observations of the reproductive behavior of a wild-caught gobiid fish, as a model, kept in an aquarium. The method focuses on three steps: collection, transport, and observations of reproductive ecology of a substrate spawner. Essential aspects of live fish collection and transport are (1) preventing injury to the fish, and (2) careful acclimation to the aquarium. Preventing harm through injuries such as scratches or a sudden change of water pressure is imperative when collecting live fish, as any physical damage is likely to negatively affect the survival and later behavior of the fish. Careful acclimation to aquaria decreases the incidence death and mitigates the shock of transport. Observations during captive rearing include (1) the identification of individual fish and (2) monitoring spawned eggs without negative effects to the fish or eggs, thereby enabling detailed investigation of the study species' reproductive ecology. The subcutaneous injection of a visible implant elastomer (VIE) tag is a precise method for the subsequent identification of individual fish, and it can be used with a wide size range of fish, with minimal influence on their survival and behavior. If the study species is a substrate spawner that deposits adhesive eggs, an artificial nest site constructed from polyvinyl chloride (PVC) pipe with the addition of a removable waterproof sheet will facilitate counting and monitoring the eggs, lessening the investigator's influence on the nest-holding and egg-guarding behavior of the fish. Although this basic method entails techniques that are seldom mentioned in detail in research articles, they are fundamental for undertaking experiments that require the captive rearing of a wild fish.

A series of basic methods to enable the study of the reproductive ecology of fish kept in aquaria are described. These are useful protocols for collecting fish using SCUBA, transporting live fish, and observing the reproductive behavior of wild-caught fish kept in aquaria.

アクアリアにおける魚類の生殖生態に関する基礎的研究

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a ...

行動学

ショウジョウバエ株の長期保存のためのPGCの凍結保存

Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and phenotypic changes. Development of an alternative method for long-term preservation without such changes is therefore imperative. Despite previous successful attempts, cryopreservation of Drosophila embryos is still not of practical use because of low reproducibility. Here, we describe a protocol for primordial germ cell (PGC) cryopreservation and strain revival via transplantation of cryopreserved PGCs into agametic Drosophila melanogaster (D. melanogaster) host embryos. PGCs are highly permeable to cryoprotective agents (CPAs), and developmental and morphological variation among strains is less problematic than in embryo cryopreservation. In this method, PGCs are collected from approximately 30 donor embryos, loaded into a needle after CPA treatment, and then cryopreserved in liquid nitrogen. To produce donor-derived gametes, the cryopreserved PGCs in a needle are thawed and then deposited into approximately 15&#160;agametic host embryos. A frequency of at least 15% fertile flies was achieved with this protocol, and the number of progeny per fertile couple was always more than enough to revive the original strain (the average progeny number being 77.2 &#177; 7.1), indicating the ability of cryopreserved PGCs to become germline stem cells. The average number of fertile flies per needle was 1.1 &#177; 0.2, and 9 out of 26 needles produced two or more fertile progeny. It was found that 11 needles are enough to produce 6 or more progeny, in which at least one female and one male are likely included. The agametic host makes it possible to revive the strain quickly by simply crossing newly emerged female and male flies. In addition, PGCs have the potential to be used in genetic engineering applications, such as genome editing.

著者スポットライト:PGC凍結保存 – ショウジョウバエ株の長期保存に向けた代替アプローチ 

A long-term preservation method for Drosophila strains as an alternative to the frequent transfer of adult flies to fresh food vials is highly desirable. This protocol describes the cryopreservation of Drosophila primordial germ cells and strain revival via their transplantation to agametic host embryos.

ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and ...

遺伝学

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

生物学

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ<emジャポニカ> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

の透過方法<em&gt;ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための&gt;胚

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes are controlled by the complex interplay between NSC intrinsic genetic programs with NSC extrinsic factors, local and systemic. In the genetic model organism, Drosophila melanogaster, NSCs, known as neuroblasts (NBs), switch from quiescence to proliferation during the embryonic to larval transition. During this time, larvae emerge from their eggshells and begin crawling, seeking out dietary nutrients. In response to animal feeding, the fat body, an endocrine organ with lipid storage capacity, produces a signal, which is released systemically into the circulating hemolymph. In response to the fat body-derived signal (FBDS), Drosophila insulin-like peptides (Dilps) are produced and released from brain neurosecretory neurons and glia, leading to downstream activation of PI3-kinase growth signaling in NBs and their glial and tracheal niche. Although this is the current model for how NBs switch from quiescence to proliferation, the nature of the FBDS extrinsic cue remains elusive. To better understand how NB extrinsic systemic cues regulate exit from quiescence, a method was developed to culture early larval brains in vitro before animal feeding. With this method, exogenous factors can be supplied to the culture media and NB exit from quiescence assayed. We found that exogenous insulin is sufficient to reactivate NBs from quiescence in whole-brain explants. Because this method is well-suited for large-scale screens, we aim to identify additional extrinsic cues that regulate NB quiescence versus proliferation decisions. Because the genes and pathways that regulate NSC proliferation decisions are evolutionarily conserved, results from this assay could provide insight into improving regenerative therapies in the clinic.

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

A method to reactivate quiescent neural stem cells in cultured Drosophila brain explants has been established. Using this method, the role of systemic signals can be uncoupled from tissue-intrinsic signals in the regulation of neural stem cell quiescence, entry and exit.

ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

休眠復活オオミジンコ: プロトコルおよびアプリケーション

要約

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この動画の章

動物の行動観察のための溶存酸素を操作するための単純なアプローチ

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

アクアリアにおける魚類の生殖生態に関する基礎的研究

ショウジョウバエ株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウジョウバエ株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウジョウバエ株の原始生殖細胞凍結保存と復活

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ Dugesia

の透過方法

ショウジョウバエ脳外植における神経幹細胞の再活性化

休眠復活オオミジンコ: プロトコルおよびアプリケーション

要約

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動物の行動観察のための溶存酸素を操作するための単純なアプローチ

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

アクアリアにおける魚類の生殖生態に関する基礎的研究

ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ Dugesia

の透過方法

ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化

ショウジョウバエ株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウジョウバエ株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウジョウバエ株の原始生殖細胞凍結保存と復活

ショウジョウバエ脳外植における神経幹細胞の再活性化