Name: a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Biz içtenlikle Shigeo Kita onun değerli öneriler ve tartışma için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca John ve Sumire Eckstein el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür ederiz.

Not: Bu çalışmada kullanılan numuneler mikroorganizmaların hızla sıvı azot içinde propanla donmuş, Don % 2 Osmiyum tetroxide içeren aseton içinde değiştirilen ve epoksi reçine1,2,3gömülü olduğunu, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. destek film (Resim 1-3) hazırlanması
Not: Gümüş renkli Formvar destek film19cam üzerinde döküm yöntemi kullanılarak hazırlanır.
<ol><li>%1,5 100 mL ekleyin Formvar etilen ve için bir Formvar yapma aparatı (şekil 1). Yarım saniyeden Formvar çözüm cihazları üst sütununda bir cam slayt (76 x 26 x 1,3 mm) 'a' bir kauçuk top19kullanarak üzerinden hava ile çözüm basarak daldırma.<ol>
<li>Üçlü stopcock açarak ve basıncı azaltmak için 'b' havada serbest sütun çözümden drenaj. Gelen ve kuru havada cam kaymak dışarı cam slayt için bir film yüzeyinde biçiminde. Bir akkor lamba Formvar film kurutma hızlandırmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı (şekil 2a) ile cam slaytta filmin dört kenarları kapalı kazıma ve film ayrılması slayt20, kolaylaştırmak için slayda nefes su filmde kapalı cam kaymak içine çeker tarafından float sonra yavaş yavaş bir düşük yatay açı (yaklaşık 10 °, şekil 2b) su.</li>
	<li>(Çapı 4 mm) delikli alüminyum raf (30 x 25 x 3 mm) kullanarak su Formvar filmden kaldırsanız (şekil 3a). Formvar film ile raf bir desiccator kadar kullanmak (şekil 3b) tutmak.</li>
</ol>2. numune blok bir ultrasonik kesme bıçağı ve bir stereomicroscope (şekil 4) altında bir jilet 21 ile düzeltme
<ol><li>Hücre bloğu yüzeyinde bir ışık mikroskobu ile (şekil 4a) blok ucu gözlemleyerek emin olun.</li>
	<li>Chuck (blok sahibi) numune bloğunda mount ve chuck bir düzeltme sahne21 tarihinde (şekil 4b) bağlayabilirsiniz. Bu düzeltme aşamasında numune arkasından bir aydınlatma mekanizması vardır.</li>
	<li>Bir boyut için blok 0.7 mm x 1.0 mm (rakamlar 4 c, 5 d) kırpın. Epoksi reçine çok zor olduğundan, ilk bir ultrasonik kesme bıçağı kullanarak blok döşeme. Ultrasonik kesme bıçağı Yeni tanıtılan bir makinedir ve bloklar kolayca atılır. O zaman daha fazla bir tıraş bıçağı ile blok döşeme. (Bkz: şekil 5 d, şekil 8) kesme doğrultusunda işaretlemek için bir omuz kesti.</li>
</ol>3. microtome (şekil 5) kullanarak elmas bıçak ile numune caddenin kırparak
<ol><li>Numune caddenin chuck ultramicrotome numune sahibinin ayarlayın. Örnek yer 90° saat yönünün tersine seri ultrathin kesit olduğunda gerçek pozisyon karşı gerçekleştirilen (bkz şekil 5 d).</li>
	<li>Blok yüzeyini bir elmas kesme bıçak (bkz şekil 5 d) ile kesmek. Elmas bıçak kenarı örnek blok yüzüne paralel ayarla ve numune yüzeyi herhangi bir numune (şekil 5 d) kaybetmek en az miktarda kesti. Not: Bu adım numune yüzeyi düzeltmek için yapılır. Numune yüzeyi ince bölümünün parçası değişmeden kalır (Bu nedenle bu bölümü şekil 5 dbir ayna gibi parlıyor değil), bu yüzden örnek herhangi bir bölümünü seri kesit kaybetmemek için. Numune caddenin yüzeyinde maruz olmasıdır.</li>
	<li>Bir ayna (Mesa kesim, M) (şekil 5 c) numune blok kesme izlemek için bıçak sahnesinde yerini.</li>
	<li>(Bu Yakası, şekil 5 d, seri kesit içinde örnek olur) bıçak sahne soldaki (şekil 5a) 30 ° döndürerek kesme bıçağı kullanarak blok sol kenarına kesti.</li>
	<li>Bıçak Sahne Alanı'nda 30 ° (şekil 5b) sağa döndürerek (Bu seri kesit, şekil 5 diçinde örnek alt tarafında olur) numune sol kenarına gelen yaklaşık 100 µm blok surata kesti. Not: Numune yaklaşık 90 ince kısmından seri bölümleri kesilir x 1 mm boyutunda nm. Büyük ölçüde paralel olduklarını öyle ki numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için kullanılır. Bıçak kenarına paralel olmak numune yüzeyi ayarladıktan sonra büyük ölçüde bir tıraş bıçağı ile kaldırılacak. Microtome kullanarak örnek alt ve üst kenarlarında keserek, her iki örnek düz ve kırılmamış şerit bölümler almak gerekli olan düzgün ve tam olarak birbirlerine (şekil 5 d), paralel haline.</li>
</ol>4. paralel olarak birbirine 21 karşılaştıkları böylece numune yüzeyi ve bıçak kenar ayarlama
<ol><li>Kesme bıçağı çıkarmak ve numune blok 90 ° saat yönünde döndür.</li>
	<li>Ultrathin bir parça bıçak bıçak Sahne Alanı'na ayarlayın.</li>
	<li>Her numune yüzeyi büyük bölümünü kullanarak diğer paralel karşılaştıkları numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlanır. Not: seri kesit, kesme yüz numune yüzeyi ve bıçak kenar bu bölüm yalnızca, özellikle dikey yönde kullanarak ayarlamak üzere çok küçük olduğu için örnek büyük kısmı ayarı için kullanılır. Böylece, örnek büyük bölümünü kullanarak ayarlamayı kolaylaştırır.</li>
</ol>5. yaymak neopren çözüm örnek blok (şekil 6)
<ol><li>Özgün konum olarak tam olarak aynı konumda numune chuck yerleştirmek için chuck ve microtome chuck sahibinin teyp uygulayın ve sınırında (şekil 6a) kesti.</li>
	<li>Numune chuck microtome çıkar ve stereomicroscope (şekil 6b) altında yerleştirin. Bir tıraş bıçağı ile numune büyük kısmını kesti, ince parça seri halinde hangi bölümlerden bırakarak elde edilir.</li>
	<li>Pasteur pipet kullanmadan, yaklaşık 1 µL % 0.5 neopren çözüm (şekil 6b) seri kesit için bölüm tarafı yapışkan yapmak için kullanılmak üzere numune bırak. Neopren çözüm ile tüm örnek kapak. Aşırı neopren çözüm hemen filtre kağıdı numune yerleştirilen bir parçası ile absorbe. Bir şerit bölümlerin almak seri halinde hücre bölümleri fotoğrafını çekmek esastır ve neopren tutkal bölümleri birbirine yapışmasını için çok yararlıdır.</li>
	<li>3-yarık Izgaralar hazırlamak (yırtmaçlı boyutları: Orta, 0.4 mm x 2.2 mm, her iki taraf 0.2 mm x 2.2 mm) (şekil 6 c) 60 ° ila Izgaralar tanıtıcısı bükme tarafından seri bölümleri seçmek için Izgaralar % 0.5 neopren çözüm ile tedavi ve Izgaralar tarafından hidrofilik yapma kızdırma deşarj22.</li>
</ol>6. yapım seri bölümler (Şekil 7-9)
<ol><li>Yer numune caddenin chuck içeri 5.1 (şekil 6a) olarak aynı konumda microtome bantlanmış parçaları hizalayarak. Bu blok yüz ve bıçak kenarı birbirine mükemmel paralel tutar. Sonra örnek yakın bıçak getir.</li>
	<li>Bıçak teknenin su ile doldurun.</li>
	<li>Microtome hava akımı (Şekil 7) önlemek için plastik bir kapak ile kapak. Not: Hava akımı ultrathin kesit ve sık sık bölümleri alımı sırasında sorunlara neden. Plastik kapak üç delik vardır: tek bir delik için dürbün lensler ve kapağı açıkken işlemi izin vermek silah diğer iki delik vardır. Ahşap kol dayama Izgaralar ile seri bölümleri alma gibi hassas iş yaparken silah yerleştirmek için kullanılır. Ahşap kol dayama operatörün el microtome için titreşim iletimi vermemek için microtome tablo (Şekil 7, oklar), farklı tablolarda yerleştirilir.</li>
	<li>200 nm bölüm kalınlığı (şekil 8) Numune kesme başlatın. 200 nm kalınlık ayarı numune yüzeyinin bıçak getirmekte zaman kazandıracak.</li>
	<li>İlk bölüm kestikten sonra bölüm kalınlığı 70 için ayarla nm (şekil 8).</li>
	<li>Seri bölüm sayısı (tam olarak, yaklaşık 1,8 mm; bölüm sayısı değişir bölümlerinin genişliğini bağlı olarak şerit ulaştığı sonra konuşma) 20 ulaştığında, bölüm kalınlığı 10 değerine ayarlayın kesmeye devam ederken nm (şekil 8). Not: microtome 10 nm-kalın kesitler kesemezsin beri yeni bölüm yok görünür ve daha önce kesme bölümleri bıçak kenarından ayrılmış olmak. El ile bir çift saç iplikçiklerinin kullanma bölümlerine ayırmak zorluk önlemek seri bölümleri seçmek için ayrılmış bölüm grupları (Şekil 9) almak önemlidir. Transmisyon elektron mikroskop görüş alanı 2.0 mm olduğu için bölümler en az 1.8 mm uzunluğunda olmalıdır.</li>
	<li>Bölüm kalınlığı 60'a ayarla nm (şekil 8). Makine önceki 10 nm kalınlığı eklediğinden bu 70 nm bölümler (şekil 8) üretecektir.</li>
	<li>Bölüm kalınlığı 70 için ayarla nm (şekil 8) ve kesim 1,8 mm uzun bölümler elde edilen kadar devam edin.</li>
	<li>Beş 1.8 mm uzun bölümler (Şekil 9) elde edilen kadar 6,6-6.8 yineleyin. Biz genellikle beş bölüm grupları mevcuttur beş örnek sahipleri transmisyon elektron mikroskobu bizim laboratuarımızda, ancak beş sınırı değil yapmak.</li>
</ol>7. alarak seri bölümler (şekil 10-12)
<ol><li>'Bölüm-holding loop'23 yerleştirin (döngü iç çapı: 5.0 mm) (şekil 10a) üçüncü bölüm grubu (şekil 10b) üzerinde. Not: Uygun sırada fotoğraf çekmek için onların kesit sırasına göre bölümler almak gereklidir. Bıçak teknede beş bölüm grupları olduğundan, ancak, bu kez hangi grupları olan kafa karıştırıcı alır. Üçüncü grup üzerinde döngü yerleştirerek, iki grup işleci yakın olduğunu ortaya çıkıyor ve operatör üzerinden uzak iki ilk ve ikinci dördüncü ve beşinci gruplarının (şekil 10b) vardır. Bu-ecek önlemek sipariş karıştırma.</li>
	<li>'Su yüzeyi yükselterek loop'23 yerleştirin (WSRL, döngü iç çap: 4.0 mm) (şekil 11a) (şekil 11b) bıçak sahnede. Alt bir mıknatıs ile donatılmış WSRL sıkıca bıçak sahnede stand.<ol>
<li>WSRL döngü sadece seri bölümler onun mili ve kolu hareket ettirerek yerleştirin. Böylece döngü bölümleri çevreleyen su yüzeyine WSRL döngü indirin.</li>
		<li>Böylece su yüzeyi yüzey gerilimi (rakamlar 11 c-d) tarafından arttıracak vidayı aşağı doğru çevirerek döngü bastır. Bölümü döngünün ortasına doğru taşımak, su tepe üzerinde konumlandırın ve bir saç strand21kullanarak bölümü yönünü ayarlayın.</li>
		<li>Bölüm grupları ile bir çıplak yarık-cımbız tarafından düzenlenen ve su yüzeyine (Şekil 11 d) paralel tutulan GRID, dokunarak seçin. İlk olarak, grid dokunmak değil su bölümleri tam olarak ızgara (Şekil 11 d) ortasına yerleştirmek için bölümler için önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bölümleri ile birlikte küçük bir damla su ile Izgaralar Formvar destek film16 üzerinde (şekil 12) yerleştirin ve aşırı su filtre kağıdı kullanarak kaldırın. Not: bölümler membran (bölümler) membran (destek film) doğrudan dokunuyor çünkü bir destek film ile kullanılması çekildiği zaman destek film kırışıklıklar genellikle bir sorundur. Destek filmde kırışıklar çıkıyor sorun Formvar destek film16üzerinde küçük bir damla su ile birlikte bir bölümü taşıyan kılavuz yerleştirerek önemli ölçüde azalır.</li>
</ol>8. bölüm16,24 (şekil 13) Boyama
<ol><li>Sonra bölümleri tamamen kurutulur, Formvar filmin Izgaralar çevresinde gözyaşı ve bölümleri taşıyan ızgaraları kaldırmak.</li>
	<li>Doğru sırada (şekil 13) Boyama tüp16 oluk Izgaralar ayarlayın ve uranyl asetat ve kurşun sitrat24bölümlerle leke. Not: Bir oluk 0.6 mm derin 's tüp uzun ekseni boyunca kesilmiş bir tıraş bıçağı ile. Tüp doğrudan ızgaraları kullanımı boyama ve yıkama işlemi16sırasında gerekli olmadığından cımbız, kullanırken destek filmlerin yanlışlıkla kırılma önlemek için yararlıdır.</li>
</ol>9. gözlem seri bölümler (Şekil 14)
<ol><li>Numune tutucu eksenine dikey kılavuz slit uzun ekseninin yönlendirme 5 Izgaralar çok numune tutucu (şekil 14a), doğru sırayla ayarlayın. 'Kılavuz-fixers' tutamaçları dokunmatik değil çünkü Izgaralar kolları (ok uçları) kesilecek, yok.</li>
	<li>Izgaralar 'kılavuz-fixers ile' (şekil 14b) düzeltmek ve numune tutucu transmisyon elektron mikroskobu yerleştirin. Not: Hedef hücre Fotoğraf çekmeden önce tüm hücre bölümleri (iyi fiksasyon ile hayır kirlenme ile iyi durumda ilginç mikroorganizmaların veya hücreleri bulmak için,şekil 15) düşük büyütme görüntüleri almak yararlıdır.</li>
	<li>Yüksek büyütmede tüm hücre bölümlerde hedef hücreleri resimlerini çekmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada sunulan yöntem hiçbir pahalı ekipman gerektirir. Sadece bir alüminyum raf (şekil 3), üç-yarık Izgaralar (şekil 6 c), bölüm-holding döngüler (şekil 10a), su yüzeyi yükselterek döngü (şekil 11a) ve boyama tüp (şekil 13) gerektirir. Mevcut yöntemin birçok özellikleri vardır. Numune büyük bölümünü birbirine paralel karşılaştıkları numu...

Hücreleri ve hücre bileşenleri üç boyutlu en elektron mikroskobik düzeyde çalışmaya uygun seri ultrathin parça tekniği vazgeçilmezdir. Biz Milli direk vücutta hücre döngüsünün Maya hücreleri dinamikleri okudu ve hücre döngüsü ve çoğaltma1,2,3, saat onların ultrastructure morfolojik değişiklikler ortaya 4,5. 2006'da, biz 'structure' birleştirerek yeni bir kelime 'structome' icat ve '-ome' ve 'nicel ve üç boyutlu yapısal bilgi elektron mikroskobik düzeyde bütün bir hücrenin' 6,7olarak tanımlanır.
Seri ultrathin parça tekniği gerektiren structome analiz, bu Maya hücre Saccharomyces cerevisiae ve Exophiala kemiğin yaklaşık 200.000 ribozomlara7,8, bir vardı bulundu Escherichia coli hücre 26.000 ribozomlara9, Mycobacterium tüberküloz hücre 1,700 ribozomlara10 vardı ve Myojin sarmal bakterilerin vardı sadece 300 ribozomlara11. Bu bilgiler sadece büyüme oranı her organizma, aynı zamanda tür9tanımlaması tahmininde yararlı olur.
Ayrıca, structome analiz yeni bir organizma keşfi yol açtı; Kapalı hücre yapısı vardı bir ara bu12,13,14,15prokaryot ve Ökaryotlar arasında Japonya sahillerine, derin deniz Parakaryon myojinensis bulundu. Şu anda, seri ultrathin parça tekniği master için uzun bir süre süreceğini zor olarak kabul edilir. Bu çalışmada, hangi içinde kimse seri ultrathin zorlanmadan kesit yerine güvenilir bir yöntem geliştirdik.

<table><tbody><tr><td>Formvar making apparatus</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td><td>-</td><td>76 x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>Aluminum rack with 4-mm holes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED illumination for stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td></tr><tr><td>LED illumination for trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Ultrasonic trimming blade</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Diamond knife for trimming</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Section-holding loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Transmission electron microscope</td></tr></tbody></table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Hücreleri ve hücre bileşenleri transmisyon elektron mikroskobu yüksek büyütmede üç boyutlu gözlem ultrathin bölümlerini seri: numune hazırlama gerektirir. Seri ultrathin bölümler hazırlama çok zor olarak kabul edilir, uygun yöntemi kullanılırsa oldukça kolay olsa da. Bu yazıda, güvenli bir şekilde mikroorganizmaların seri ultrathin bölümler elde etmek için bir adım adım yordam göstereceğiz. Bu yöntem anahtar noktaları vardır: 1) numune büyük bölümünü kullanmak ve böylece birbirine; paralel numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için 2) seri grupları bölümlerde kesme ve saç iplikçiklerinin dibinde bir çift yarık Izgaralar üzerine seri bölümler bir grup alınırken kullanma bölümlerine ayırmak zorluk önlemek için; 3) bir 'bölüm-holding loop' kullanın ve bölüm grupları sipariş kadar karıştırma önlemek için; 4) bölümleri su tepe üzerinde konumlandırılmış ve ızgara önce onları Izgaralar üzerinde istediğiniz konuma yerleştirmek için dokundukları olduğunu emin olun ve bir 'su yüzeyi yükselterek loop' kullanmak için; 5) destek film bir alüminyum raf kullanabilir ve Izgaralar bölümleri kurtarmak için ve destek film kırışıklıklar önlemek için kolaylaştırmak için; ve 6) Boyama bir tüp kullanın ve destek filmleri cımbızla yanlışlıkla kesmemek için. Bu yeni yöntem zorluk olmadan seri ultrathin bölümler elde sağlar. Yönteminin Otomatik teyp toplama ultramicrotome yöntemi ve seri blok-yüz veya elektron mikroskobu tarama odaklı iyon ışını kullanarak elde edilemez 3D yüksek çözünürlükte mikroorganizmaların hücre yapıları analiz olanak sağlar.

Bu protokol için üç-yarık Izgaralar seri bölümleri seçmek için kullanılmıştır. Izgaralar nikel veya bakır yapılmıştır. Seri bölümleri orta slit yerleştirilir. Her iki tarafta yırtmaçlı kılavuzla aldığın zaman bölümleri görüntülemek gereklidir. Izgaralar seri bölümleri ile paralel (Şekil 11 d) cımbızla almaya devam etmek, kolu bükülmüş (şekil 6 c, sağ). Küçük bir kolu ciddi sorunlara n...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.

Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

14.1K Görüntüleme.  Chiba University. Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.

Video: A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Biyokimya

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Biyomühendislik

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biyoloji

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Nörobilim

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Elektron Mikroskopisinde Biyolojik Örneklerin İyi Ultrayapısal Korunması için Sandviç Dondurma Cihazı Kullanılarak Hızlı Dondurma

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...