Wir danken herzlichst Shigeo Kita für seine wertvollen Anregungen und Diskussionen. Wir danken auch John und Sumire Eckstein für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.

Hinweis: Die Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, Mikroorganismen, schnell mit Propan in flüssigem Stickstoff eingefroren substituierte in Aceton, enthält 2 % Osmium ausgefällt und eingebettet in Epoxy Harz1,2,3Einfrieren, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. Vorbereitung der Trägerfolie (Abbildung 1-3)
Hinweis: Silberne Formvar Trägerfolie wird mit der auf Gußglas Methode19zubereitet.
<ol><li>100 mL 1,5 % zugeben Formvar in Ethylen Paraquatdichlorid zu einer Formvar-Herstellung-Apparatur (Abbildung 1). Tauchen Sie die Hälfte einer Glas-Folie (76 x 26 x 1,3 mm) in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Geräts durch Drücken der Lösung mit Luft durch "a" mit einem Rubber Ball19.<ol>
<li>Lassen Sie die Lösung aus der Spalte durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gerät genommen und trockene Luft zu bilden einen Film auf der Oberfläche der Folie Glas. Verwenden Sie eine weißglühende Lampe zur Beschleunigung der Trocknung des Formvar Films.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem die vier Kanten des Films auf dem Objektträger mit einer Rasierklinge (Abbildung 2a) abschaben, und atmen auf der Folie, die Trennung des Films aus der Folie20, zu erleichtern die Folie auf dem Wasser zu schweben, durch Eintauchen der Objektträger in der das Wasser langsam in einem niedrigen horizontalen Winkel (ca. 10°, Abb. 2 b).</li>
	<li>Schöpfe die Formvar Film aus dem Wasser mit einem Alu-Rack (30 x 25 x 3 mm) mit Löcher (4 mm Durchmesser) (Abb. 3a). Halten Sie das Gestell mit dem Formvar Film in den Exsikkator gestellt bis zur Verwendung (Abb. 3 b).</li>
</ol>2. Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge 21 unter einem Stereomikroskop (Abbildung 4)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass gibt es Zellen auf der Oberfläche des Blocks durch die Beobachtung der Spitze des Blocks mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 4a).</li>
	<li>Montieren des Probe-Blocks in das Spannfutter (Block-Halter), und das Futter auf ein trimmen Bühne21 (Abbildung 4 b). Diese trimmen-Etappe hat einen Beleuchtung-Mechanismus von der Rückseite der Probe.</li>
	<li>Schneiden Sie den Block auf eine Größe von 0,7 mm x 1,0 mm (Abb. 4 c, 5d). Da das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie die Blöcke zuerst mit einem Ultraschall trimmen Klinge. Die Ultraschall trimmen Klinge ist eine neu eingeführte Maschine, und die Blöcke sind leicht getrimmt. Dann schneiden Sie den Block weiter mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie eine Schulter markieren die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 5 d, Abbildung 8).</li>
</ol>(3) trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit dem Mikrotom (Abbildung 5)
<ol><li>Inmitten des Probe Blocks Chuck Probenhalter für die regungsloses. Legen Sie die Probe 90° gegen den Uhrzeigersinn gegen die tatsächliche Position, wenn serielle ultradünnen Schnitt durchgeführt (siehe Abbildung 5-d).</li>
	<li>Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamant Trimmmesser (siehe Abbildung 5 d). Diamant Messerschneide parallel zur Fläche Probe-Block gesetzt, und schneiden Sie den Mindestbetrag der Probenoberfläche um nicht zu verlieren, jede Probe (Abb. 5D). Hinweis: Dieser Schritt ist getan, um die Probenoberfläche zu glätten. Der Teil der Probenoberfläche schlanke Teil intakt (daher dieser Teil ist nicht glänzend wie ein Spiegel, Abbildung 5 d), um keinen Teil der Probe für serielle Schnitt verlieren. Und zwar deshalb, weil das Muster auf der Oberfläche des Blocks ausgesetzt ist.</li>
	<li>Setzen Sie einen Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Bühne Messer zum Schneiden von der Probe-Block (Abbildung 5 c) überwachen.</li>
	<li>Schneiden Sie den linken Rand (Dies wird die Oberseite, Abbildung 5 d, der Probe im seriellen Schnitt) des Blocks mit Trimmmesser durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach links (Abb. 5a).</li>
	<li>Schneiden Sie die Block-Fläche an etwa 100 µm vom linken Rand der Probe (Dies wird die Unterseite der Probe in seriellen Schnitt, Abbildung 5 d) durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach rechts (Abb. 5 b). Hinweis: Die Schnittserien schneidet sie aus dem schlanken Teil der Probe von etwa 90 nm x ca. 1 mm groß. Der Großteil wird zur Probenoberfläche und der Messerschneide anpassen, so dass sie parallel sind. Nach dem Einstellen der Probenoberfläche parallel zur Messerschneide sein, wird der große Teil mit einer Rasierklinge entfernt. Von oberen und unteren Rand der Probe mit dem Mikrotom schneiden, werden beide Seiten der Probe glatt und genau parallel zueinander (Abb. 5D), die ist notwendig, um gerade und ununterbrochene Band Abschnitte.</li>
</ol>4. anpassen der Probe Oberfläche und Messer Kante, so dass sie Parallel zu einander 21 Gesicht
<ol><li>Entfernen Sie das Schneidmesser, und drehen Sie den Probe Block 90° im Uhrzeigersinn.</li>
	<li>Legen Sie eine ultradünne Stationspunkte Messer auf der Messer-Bühne.</li>
	<li>Einstellen Sie die Probenoberfläche und der Messerschneide so, dass sie Parallel zueinander mit dem Großteil der Probenoberfläche konfrontiert. Hinweis: Der Großteil der Probe wird zur Einstellung verwendet, denn das Schneiden Gesicht des seriellen Schnitt so klein ist, macht es schwierig, Probe Oberfläche und Messer Rand mit diesen Teil nur, vor allem in vertikaler Richtung anpassen. So macht mit dem großen Teil der Probe Anpassung leicht.</li>
</ol>5. Verbreitung Neopren-Lösung auf die Probe-Block (Abbildung 6)
<ol><li>Um die Probe Futter an genau der gleichen Position wie die ursprüngliche Position zu platzieren, bringen Sie Klebeband auf das Futter und Futter Inhaber Mikrotom und schneiden Sie an der Grenze (Abb. 6a).</li>
	<li>Nehmen Sie das Präparat Chuck aus Mikrotom, und legen Sie es unter dem Stereomikroskop (Abb. 6 b). Schneiden Sie den Großteil der Probe mit einer Rasierklinge, indem man die schlanken Teil, unter dem Schnittserien erhältlich sind.</li>
	<li>Mit einer Pasteurpipette, fallen Sie ca. 1 µL 0,5 % Neopren Lösung (Abb. 6 b) auf die Probe, für serielle Schnitt verwendet werden, um den Abschnitt Seiten Klebstoff zu machen. Decken Sie die gesamte Probe mit Neopren-Lösung. Absorbieren Sie überschüssige Neopren Lösung sofort mit einem Stück Filterpapier in der Nähe der Probekörpers. Eine Band der Abschnitte ist essentiell für die Bilder von seriellen Zellteile und Neoprenkleber ist sehr nützlich für die Abschnitte zusammenkleben.</li>
	<li>3-Schlitz-Netze vorzubereiten (Größe der Schlitze: Mitte, 0,4 mm x 2,2 mm, beide Seiten 0,2 mm x 2,2 mm) (Abbildung 6 c) für die Abholung Schnittserien durch Biegen des Griffs der Netze 60°, behandeln die Netze mit 0,5 % Neopren-Lösung, und machen die Netze von hydrophilen Leuchten Sie Entlastung22.</li>
</ol>6. Herstellung Serienschnitte (Abbildung 7-9)
<ol><li>Ort der Probe Block Futter zurück in das Mikrotom an der gleichen Position wie 5.1 (Abb. 6a) durch Ausrichten der aufgezeichneten Teile. Dies hält die Block-Gesicht und die Messerschneide vollkommen parallel zueinander. Dann bringen Sie das Messer in der Nähe der Probe.</li>
	<li>Füllen Sie das Messer-Boot mit Wasser.</li>
	<li>Decken Sie das Mikrotom mit einer Kunststoff-Abdeckung, Luftstrom (Abbildung 7) zu verhindern. Hinweis: Luftstrom während der ultradünnen schneiden und Abruf der Abschnitte oft Probleme verursachen. Die Kunststoffabdeckung verfügt über drei Löcher: ein Loch ist für das Fernglas Objektive, und die beiden anderen Löcher sind für die Arme um den Betrieb zu ermöglichen, während der Deckel auf. Die hölzerne Armlehne dient für die Platzierung der Arme dabei heikle Arbeit, z. B. Abrufen von Schnittserien mit Gittern. Die hölzerne Armlehne befindet sich auf verschiedene Tabellen aus der Mikrotom-Tabelle (Abbildung 7, Pfeile), um nicht die Schwingung der Hände des Bedieners, Mikrotom zu übertragen.</li>
	<li>Fang an zu schneiden die Probe bei 200 nm Dicke (Abbildung 8). Einstellung bei 200 nm Dicke sparen Zeit, darin das Messer an der Oberfläche der Probe.</li>
	<li>Nach den ersten Schnitt gesetzt die Schnittdicke bis 70 nm (Abbildung 8).</li>
	<li>Wenn die Anzahl der Schnittserien erreicht 20 (genau gesagt, nach der Band erreicht etwa 1,8 mm; die Anzahl der Abschnitte abhängig von der Breite der Abschnitte variiert), setzen die Schnittdicke bis 10 nm (Abbildung 8) gleichzeitig schneiden. Hinweis: Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. Es ist wichtig, um getrennte Abschnittsgruppen (Abbildung 9) für die Abholung Serienschnitte, Schwierigkeiten bei der Trennung von Abschnitten, die manuell über ein paar Haarsträhnen zu vermeiden. Da das Sichtfeld in der Transmissions-Elektronenmikroskop 2,0 mm ist, sollte Abschnitte höchstens 1,8 mm lang sein.</li>
	<li>Legen Sie die Schnittdicke bis 60 nm (Abbildung 8). Dies wird 70 nm Abschnitte (Abbildung 8) produzieren, weil die Maschine die letzten 10 nm Dicke hinzufügen wird.</li>
	<li>Legen Sie die Schnittdicke wieder auf 70 nm (Abbildung 8) und das Schneiden fortsetzen, bis 1,8 mm lange Abschnitte erhalten sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie 6,6-6,8 bis fünf 1,8 mm lange Abschnitte (Abbildung 9) erreicht werden. Wir machen in der Regel fünf Abschnittsgruppen, da gibt es fünf Probenhalter in der Transmissions-Elektronenmikroskop in unserem Labor zur Verfügung, aber fünf nicht das Limit ist.</li>
</ol>7. Abholung Serienschnitte (Abbildung 10-12)
<ol><li>Legen Sie die "Abschnitt-Holding-Schleife"23 (innerer Durchmesser der Schleife: 5,0 mm) (Abb. 10a) auf die dritte Abschnittsgruppe (Abbildung 10). Hinweis: Es ist erforderlich, um die Abschnitte in der Reihenfolge ihrer schneiden zu fotografieren in der richtigen Reihenfolge abzurufen. Aber da auf dem Messer Boot gibt es fünf Abschnittsgruppen, ruft es oft verwirrend, welche Gruppen sind. Wenn Sie die Schleife auf der dritten Gruppe, wird klar, dass die beiden Gruppen in der Nähe der Betreiber sind die erste und zweite und entfernte zwei vom Betreiber sind die vierten und fünften Gruppen (Abbildung 10). Dadurch wird verhindert, die Reihenfolge vertauschen.</li>
	<li>Legen Sie "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife"23 (WSRL, Innendurchmesser der Schleife: 4,0 mm) (Abb. 11a) auf der Bühne Messer (Abbildung 11 b). Die WSRL wird fest auf der Messer-Bühne stehen, weil es mit einem Magneten an der Unterseite ausgestattet.<ol>
<li>Legen Sie die Schleife der WSRL oberhalb der Schnittserien durch bewegte seinen Schaft und Griff. Senken Sie die Schlaufe des WSRL auf die Wasseroberfläche, so dass die Schleife in den Abschnitten umkreist.</li>
		<li>Drücken Sie die Schleife durch Drehen der Schraube nach unten, so dass die Wasseroberfläche durch Oberflächenspannung (Zahlen 11 c-d) auslöst. Verschieben Sie den Abschnitt in der Mitte der Schleife, positionieren Sie es an die Spitze des Wassers und passen Sie die Richtung des Abschnitts mithilfe einer Haar-Strang-21.</li>
		<li>Abschnittsgruppen durch Berührung mit einem nackten Schlitz-Raster, die von einer Pinzette gehalten und immer parallel zur Wasseroberfläche (Abbildung 11 d) abholen. Es ist wichtig für Abschnitte, das Netz zuerst berühren nicht das Wasser, um Abschnitte genau in der Mitte des Rasters (Abbildung 11 d) zu platzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Gitter mit Abschnitten zusammen mit einem Tropfen Wasser auf Formvar Unterstützung Film16 (Abbildung 12), und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier. Hinweis: Faltenbildung der die Trägerfolie ist oft ein Problem wenn Abschnitte mithilfe eines Rasters mit Trägerfolie abgeholt werden, weil Membran (Abschnitte) Membran (Trägerfolie) direkt berührt. Das Problem der immer Falten auf der Trägerfolie wird deutlich reduziert, indem ein Abschnitt tragenden Raster zusammen mit einem Tropfen Wasser auf die Formvar Unterstützung Film16.</li>
</ol>(8) Färbung Abschnitte16,24 (Abbildung 13)
<ol><li>Nach die Abschnitten vollständig getrocknet sind, reißen Sie den Formvar Film von rund um die Netze zu, und entfernen Sie die Gitter mit den Abschnitten.</li>
	<li>Legen Sie die Gitter in die Nut der die Färbung Rohr16 in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 13), und Flecken Sie Abschnitte mit Uranyl Acetat und Blei Citrat24. Hinweis: Befindet sich eine Nut 0,6 mm tief entlang der Längsachse des Rohres mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Röhre ist nützlich zur Vermeidung versehentlichen Bruch der Unterstützung Filme Verwendung einer Pinzette, da direkte Handhabung von Grids während der Färbung und waschen Prozess16 entfällt.</li>
</ol>9. Beobachtung der Schnittserien (Abbildung 14)
<ol><li>Legen Sie die 5 Raster im Multi-Probenhalter in der richtigen Reihenfolge (Bild 14a), Ausrichtung der Längsachse der Raster Schlitz senkrecht zur Probe Halter. Die Griffe (Pfeilspitzen) der Netze müssen nicht geschnitten werden, da die Raster-Fixierer die Griffe nicht berührt werden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Gitter mit "Raster-Fixierer" (Abb. 14 b) und der Transmissions-Elektronenmikroskop einfügen Sie Probenhalter. Hinweis: Es ist oft nützlich, geringer Vergrößerung Bilder von allen Zellteile (Abbildung 15), interessante Mikroorganismen oder Zellen in gutem Zustand ohne Kontamination und mit gute Fixierung zu finden nehmen vor dem Fotografieren der Zielzelle.</li>
	<li>Machen Sie Fotos von den Zielzellen in allen Zellteile bei hoher Vergrößerung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. 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Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. 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K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellte Methode erfordert keine teure Ausrüstung. Es erfordert nur ein Alu-Rack (Abbildung 3), 3-Schlitz-Raster (Abbildung 6 c), Abschnitt-Holding Schleifen (Abb. 10a), Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife (Abbildung 11a) und eine Färbung Rohr (Abbildung 13). Es gibt viele Features des vorliegenden Verfahrens. Der große Teil der Probe wird verwendet, um die...

Richtige ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik ist unerlässlich, um Zellen und Zellbestandteile dreidimensional auf mikroskopischer Ebene Elektron zu studieren. Wir haben untersucht die Dynamik der Spindel Pol Körper im Zellzyklus von Hefezellen und offenbart morphologische Veränderungen ihrer Ultrastruktur während des Zellzyklus und die Zeit von Doppelarbeit1,2,3, 4,5. Im Jahr 2006 haben wir ein neues Wort "Structome" durch die Kombination von "Struktur" geprägt und "-Ome", und als die 'quantitative und dreidimensionalen Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf mikroskopischer Ebene Elektron' 6,7definiert.
Durch eine Structome Analyse, die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik erfordert, wurde festgestellt, dass eine Hefezelle von Saccharomyces Cerevisiae und Exophiala Dermatitidis etwa 200.000 Ribosomen7,8, ein hatte Escherichia coli Zelle 26.000 Ribosomen9, Mycobacterium Tuberculosis Zelle hatte 1.700 Ribosomen10 und Myojin Spirale Bakterien hatten nur 300 Ribosomen11. Diese Informationen sind hilfreich bei der Abschätzung der nicht nur der Wachstumsrate in jedem Organismus, sondern auch bei der Identifizierung von Arten9.
Darüber hinaus Structome Analyse führte zu die Entdeckung eines neuen Organismus; Parakaryon Myojinensis fand in der Tiefsee vor der Küste Japans, deren Zellstruktur waren ein Zwischenprodukt zwischen denen der Prokaryoten und Eukaryoten12,13,14,15. Derzeit gilt die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik so schwer sein, dass es lange, zu meistern dauern würde. In dieser Studie haben wir eine zuverlässige Methode entwickelt, in der jemand serielle ultradünnen Schneiden problemlos durchführen kann.

<table><tbody><tr><td>Formvar making apparatus</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td><td>-</td><td>76 x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>Aluminum rack with 4-mm holes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED illumination for stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td></tr><tr><td>LED illumination for trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Ultrasonic trimming blade</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Diamond knife for trimming</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Section-holding loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Transmission electron microscope</td></tr></tbody></table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Beobachtung von Zellen und Zellbestandteile in drei Dimensionen bei hoher Vergrößerung im Transmissions-Elektronenmikroskopie erfordert Vorbereitung ultradünne Schnittserien der Probe. Obwohl Vorbereitung ultradünne Schnittserien gilt als sehr schwierig sein, ist es ziemlich einfach, wenn die richtige Methode verwendet wird. In diesem Beitrag zeigen wir eine schrittweise Anleitung für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen sicher. Die wichtigsten Punkte dieser Methode sind: 1) verwenden Sie den großen Teil der Probe und Probe Oberfläche und Messer Rand anpassen, so dass sie parallel zueinander; (2) zu schneiden Schnittserien in Gruppen und vermeiden Schwierigkeiten beim trennen Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden; (3) zu verwenden, eine "Abschnitt-Holding-Schleife" und zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen; (4), verwenden Sie eine Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife, und stellen Sie sicher die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren; (5), verwenden Sie die Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell und machen es einfacher, die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, von der Trägerfolie Faltenbildung; und 6) verwenden Sie eine Färbung zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette. Diese neue Methode ermöglicht ultradünne Schnittserien ohne Schwierigkeiten. Die Methode ermöglicht die Zellstrukturen von Mikroorganismen mit hoher Auflösung in 3D, zu analysieren, die nicht mithilfe der automatischen Band sammeln regungsloses Methode und serielle Block-Gesicht oder fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie erreicht werden kann.

In diesem Protokoll wurden 3-Schlitz-Raster für die Abholung Schnittserien verwendet. Die Gitter sind aus Nickel oder Kupfer gefertigt. Die Schnittserien befinden sich auf den mittleren Schlitz. Die Schlitze auf beiden Seiten sind notwendig, um die Abschnitte anzuzeigen, wenn sie mit dem Netz aufnehmen. Um die Netze parallel mit der Schnittserien halten, wenn sie mit einer Pinzette (Abbildung 11 d) aufnehmen, ist der Griff gebogen (Abb. ...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

14.1K Aufrufe.  Chiba University. Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Serie: A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Forschung

Biochemie

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Biotechnik

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologie

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Neurowissenschaften

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...