אנו מודים שיגאו קיטה עבור הצעות ערך ודיון שלו. אנו מודים גם Sumire אקשטיין וג'ון שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד.

הערה: דגימות השתמשו במחקר זה היו מיקרואורגניזמים, במהירות קפוא עם גז חנקן נוזלי, להקפיא שהוחלפו ב אצטון המכיל 2% אוסמיום ארבע-חמצני, ומוטבעים אפוקסי שרף1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. הכנת הסרט תמיכה (איור 1-3)
הערה: Formvar בצבע כסף תמיכה הסרט מוכן באמצעות שיטת יצוקה על-זכוכית19.
<ol><li>להוסיף 100 מ של 1.5% Formvar של-אתילן dichloride אל מנגנון יצירת Formvar (איור 1). טובלים חצי אחד של שקופית מזכוכית (76 מ מ x 26 מ"מ x 1.3 מ"מ) בתמיסה Formvar בעמודה העליון של המנגנון על ידי לחיצה על הפתרון עם האוויר דרך 'a' באמצעות כדור גומי19.<ol>
<li>סוחטים את הפתרון מן העמודה על-ידי פתיחה של צימוד-כיוונית של שחרור האוויר דרך 'b' כדי להפחית את הלחץ. להוציא את השקופית זכוכית מן המנגנון ויבש באוויר כדי ליצור סרט על פני השטח של השקופית זכוכית. השתמש מנורת להט להאיץ הייבוש של הסרט Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר מגרדים ארבעת הקצוות של הסרט בשקופית זכוכית עם סכין גילוח (איור 2 א), ונשימה אותן לשקופית כדי להקל על ההפרדה של הסרט שקופית20, ימחאו הסרט על המים במועט השקופית זכוכית לתוך מים לאט בזווית אופקית נמוכה (בערך 10°, איור 2b).</li>
	<li>תגרדו את הסרט Formvar מן המים באמצעות ארון תקשורת של אלומיניום (30 מ מ x 25 מ"מ x 3 מ"מ) עם חורים (4 מ מ קוטר) (איור 3 א). שמור על האצטבה עם הסרט Formvar desiccator עד לשימוש (איור 3b).</li>
</ol>2. קיצוץ הרחוב דגימה של להב חיתוך אולטראסוניות, גילוח 21 תחת stereomicroscope (איור 4)
<ol><li>ודא כי ישנם תאים על פני השטח של גוש על ידי התבוננות קצה הרחוב עם מיקרוסקופ אור (איור 4a).</li>
	<li>הר הרחוב דגימה ב הצ'אק (בלוק מחזיק), והר הצ'אק על הבמה זמירה21 (איור 4b). בשלב זה זמירה יש מנגנון תאורה מהחלק האחורי של הדגימה.</li>
	<li>חתוך שאבן בגודל של 0.7 מ"מ x 1.0 מ"מ (איורים 4 c, 5d). מאז שרף אפוקסי הוא מאוד קשה, לקצץ את אבני הראשון באמצעות להב חיתוך אולטרה סאונד. להב חיתוך אולטראסוניות מכונה הציג לאחרונה, הבלוקים, נסגרים בקלות. אז לקצץ את גוש נוסף עם סכין גילוח. חותכים כתף אחת כדי לסמן את הכיוון של חיתוך (ראה איור 5 d, איור 8).</li>
</ol>3. זמירה את הרחוב דגימה בסכין יהלום באמצעות את האזמל הקטן (איור 5)
<ol><li>להגדיר הרחוב דגימה צ'אק הדגימה האוחז ultramicrotome. מקם את הדגימה ב- 90° נגד כיוון השעון בניגוד לעמדת בפועל בעת חלוקתה זגוגית טורי שבוצעה (ראה איור 5 d).</li>
	<li>חותכים את השטח של גוש עם סכין חיתוך יהלום (ראה איור 5-d). להגדיר את קצה סכין יהלום מקביל פני בלוק הדגימה, לחתוך את הכמות המינימלית של משטח הדגימה כדי לא לאבד את כל הדגימה (איור 5 d). הערה: שלב זה נעשית להחליק פני השטח הדגימה. חלק משטח הדגימה של החלק הדק הוא נותר ללא פגע (לכן החלק הזה לא זורחת כמו מראה, איור 5 d), כדי לא לאבד חלק כלשהו של הדגימה על חלוקתה טורי. הסיבה לכך היא הדגימה נחשף על פני הרחוב.</li>
	<li>להציב מראה (Mesa קאט, ז) על הבמה את הסכין כדי לנטר את חיתוך הרחוב דגימה (איור 5 c).</li>
	<li>חותכים את הקצה השמאלי (זה הופך סייד, איור 5 d, המדגם ב טורי חלוקתה) של גוש באמצעות סכין חיתוך על ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות שמאלה (איור 5a).</li>
	<li>חתכו את הפנים בלוק-כ-100 מיקרומטר מהקצה השמאלי של הדגימה (זה הופך בצד התחתון של הדגימה ב טורי חלוקתה, איור 5 d) על-ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות ימינה (איור 5b). הערה: הסעיפים טורי יהיה לחתוך חלק רזה של הדגימה כ- 90 ננומטר x בערך בגודל 1 מ מ בלבד. החלק הגדול ישמש כדי להתאים את השטח הדגימה ואת קצה הסכין כך הם מקבילים. לאחר התאמת השטח הדגימה כדי להיות מקביל עד קצה הסכין, החלק גדול יוסרו עם סכין גילוח. על ידי גזירה את הצדדים העליון והתחתון של הדגימה באמצעות את האזמל הקטן, בשני הצדדים של הדגימה הופך בדיוק מקבילים זה לזה (איור 5 d), וחלקה אשר הכרחי לקבל את הכלים ישר ואינו רצופה מקטעים.</li>
</ol>4. התאמת לקצה משטח והסכין הדגימה כך שהם פונים במקביל אחד לשני 21
<ol><li>להסיר את הסכין זמירה, וסובב את הרחוב דגימה 90° בכיוון השעון.</li>
	<li>הגדר את הסכין אופטים זגוגית של השלב הסכין.</li>
	<li>התאם משטח הדגימה לבין קצה הסכין כך שהם פונים במקביל זו לזו באמצעות חלק גדול משטח הדגימה. הערה: חלק גדול הדגימה משמש עבור התאמה כי הפנים חיתוך של טורי חלוקתה כל כך קטנה, ומקשה על התאם משטח הדגימה קצה הסכין באמצעות החלק הזה בלבד, בעיקר בכיוון אנכי. לכן, באמצעות החלק הגדול של הדגימה הופך התאמה קלה.</li>
</ol>5. מריחה אטומה פתרון על הרחוב דגימה (איור 6)
<ol><li>כדי למקם את צ'אק הדגימה-בדיוק באותה העמדה המיקום המקורי, להחיל את הקלטת של הצ'אק, צ'אק האוחז האזמל הקטן ושרטתי הגבול (איור 6a).</li>
	<li>סעו הדגימה צ'אק האזמל הקטן, מניחים אותה מתחת stereomicroscope (איור 6b). לחתוך את החלק הגדול של הדגימה עם סכין גילוח, עוזב את החלק הדק, שממנו ניתן להשיג חלקים טורי.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של פסטר, ירידה בערך µL 0.5% אטומה פתרון (איור 6b) על גבי הדגימה שישמש עבור חלוקתה טורי, לעשות הדבק הצדדים בסעיף. מכסים את הדגימה כל פתרון אטומה. לספוג עודפי אטומה פתרון מיד עם חתיכת נייר סינון ממוקם בסמוך הדגימה. מקבל סרט סעיפים חיוני עבור צילום תמונות סעיפים תא טורי, אטומה דבק הוא מאוד שימושי עבור מנתחות את הסעיפים.</li>
	<li>להכין 3 םיקדסה רשתות (בגדלים של חריצים: באמצע, 0.4 מ מ x 2.2 מ מ, שני הצדדים 0.2 מ"מ x 2.2 מ"מ) (איור 6 c) עבור אוסף קטעים סדרתי על ידי כיפוף בידית של הרשתות עד 60 ° צלזיוס, בטיפול הרשתות עם 0.5% אטומה פתרון, ולהפוך את הרשתות הידרופילית על ידי זוהר פריקה22.</li>
</ol>6. ביצוע סעיפים טורי (איור 7-9)
<ol><li>המקום הרחוב דגימה צ'אק פנימה את האזמל הקטן במיקום זהה כמו 5.1 (איור 6a) על ידי יישור החלקים מוקלט. פעולה זו שומרת את פני בלוק לבין קצה הסכין מקבילים זה לזה באופן מושלם. ואז להביא את הסכין קרוב הדגימה.</li>
	<li>למלא את הסירה את הסכין במים.</li>
	<li>מכסים את האזמל הקטן עם כיסוי פלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר (איור 7). הערה: זרימת אוויר במהלך חלוקתה ודק במיוחד, שליפת מקטעים לעיתים קרובות לגרום לבעיות. מכסה פלסטיק יש שלושה חורים: חור אחד הוא עבור עדשות המשקפת, שני החורים אחרים נועדו הזרועות לאפשר פעולה בעוד השער נמצא על. משענת עץ משמשת להנחה הידיים בזמן ביצוע עבודה עדינה, כגון אחזור מקטעים טורית בעזרת רשתות. משענת עץ מושם על שולחנות שונים מן השולחן מיקרוטום (איור 7, חצים), כדי לא לשדר את הרטט של הידיים של המפעיל האזמל הקטן.</li>
	<li>לחתוך את הדגימה-עובי סעיף 200 ננומטר (איור 8). הגדרה-200 ננומטר בעובי יחסוך זמן להביא את הסכין אל פני השטח של הדגימה.</li>
	<li>לאחר החלק הראשון הוא נחתך, להגדיר את עובי סעיף ל-70 ננומטר (איור 8).</li>
	<li>כאשר מספר קטעים סדרתי מגיע ל- 20 (בדיוק מדברים, לאחר מגיע סרט כ 1.8 מ"מ; מספר קטעים משתנה בהתאם לרוחב של סעיפים), להגדיר את עובי סעיף 10 ננומטר (איור 8) תוך לחתוך. הערה: מאז האזמל הקטן לא יכול לחתוך קטעים ננומטר בעובי 10, אין סעיף חדש שמופיע ולאחר הסעיפים בעבר לחתוך המופרדות קצה הסכין. חשוב לקבל קבוצות מקטעים נפרדים (איור 9) עבור אוסף טורי מקטעים למנוע קושי הפרדת המקטעים באופן ידני באמצעות זוג קווצות שיער. כיוון התצוגה של השדה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הוא 2.0 מ מ, החתכים צריכים להיות באורך 1.8 מ מ לכל היותר.</li>
	<li>להגדיר את עובי סעיף 60 ננומטר (איור 8). זה יהיה לייצר nm 70 חלקים (איור 8) כי המכונה יוסיף את עובי nm 10 הקודם.</li>
	<li>להגדיר את עובי סעיף חזרה ל-70 ננומטר (איור 8) ולהמשיך חיתוך עד 1.8-מ מארוך מקטעים מתקבלים.</li>
	<li>חזור על 6.6-6.8 עד לחמישה מדורים ארוך מ מ 1.8 מתקבלים (איור 9). אנו מבצעים בדרך כלל חמש קבוצות מקטעים מאז יש חמש מחזיקי הדגימה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים זמינים במעבדה שלנו, אבל חמש דקות הם לא הגבול.</li>
</ol>7. אוסף טורי מקטעים (איור 10-12)
<ol><li>במקום 'סעיף החזקת loop'23 (בקוטר הפנימי של הלולאה: 5.0 מ"מ) (איור 10a) על קבוצת המקטע השלישי (איור 10 ב'). הערה: זה הכרחי לאחזר את הסעיפים לפי סדר שלהם חלוקתה כדי לצלם תמונות בסדר הנכון. עם זאת, מאז יש חמש קבוצות מקטעים על הסירה את הסכין, זה לעתים קרובות מקבל מבלבל אילו קבוצות הם אשר. על ידי הנחת את הלולאה על הקבוצה השלישית, מתברר כי שתי הקבוצות ליד המפעיל הן הראשון, השני, ושני מרוחק מהמרכזן הן הקבוצות הרביעית והחמישית (איור 10 ב'). פעולה זו תמנע ערבוב את ההזמנה.</li>
	<li>במקום 'הרמת-מים-פני לולאה'23 (WSRL, הקוטר הפנימי של הלולאה: 4.0 מ"מ) (איור 11 א) על הבמה הסכין (איור 11b). WSRL לעמוד ביציבות על הבמה סכין כי הוא מצויד מגנט בתחתית.<ol>
<li>במקום הלולאה של WSRL ממש מעל הסעיפים טורי על-ידי הזזת מוט וידית שלה. להוריד את הלולאה של WSRL על גבי משטח מים כך הלולאה מקיף הסעיפים.</li>
		<li>לדחוף את הלולאה למטה על-ידי סיבוב הבורג כלפי מטה כך פני המים יעלה על ידי מתח (דמויות 11c-d). להעביר את המקטע למרכז הלולאה, למקם אותו על השיא של המים, ולהתאים את הכיוון של המקטע באמצעות קווצת שיער21.</li>
		<li>לאסוף קבוצות מקטעים על ידי נגיעה בו עם חשוף חריץ-רשת, אשר מוחזק על ידי פינצטה, המשיך מקביל פני המים (איור 11 d). חשוב עבור מקטעים הרשת נוגעת, לא המים, למקם קטעים בדיוק מרכז הרשת (איור 11 d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את הרשתות עם מקטעים יחד עם טיפה קטנה של מים על ה Formvar תמיכה הסרט16 (איור 12), ולהסיר עודפי מים באמצעות נייר סינון. הערה: התקמטות של הסרט התמיכה הוא לעיתים קרובות בעיה כאשר מקטעים לאסוף באמצעות רשת תמיכה הסרט כי הממברנה (סעיפים) נוגע ישירות ממברנה (סרט, תמיכה). הבעיה של מקבל קמטים על הסרט תמיכה פוחת באופן משמעותי על-ידי הצבת רשת סעיף מניבי יחד עם טיפת מים זעירים הסרט תמיכה Formvar16.</li>
</ol>8. צביעת סעיפים16,24 (איור 13)
<ol><li>לאחר הסעיפים הם יבשים לחלוטין, לקרוע את הסרט Formvar מ סביב הרשתות, ולהסיר את רשתות הנושאת את המקטעים.</li>
	<li>להגדיר את הרשתות לקצב של ה צינור מכתימים16 בסדר הנכון (איור 13), כתם מקטעים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט24. הערה: יש חריץ עמוק 0.6 מ"מ לאורך הציר הארוך של הצינור לחתוך עם סכין גילוח. הצינור שימושית למניעת שבירה מקרית של סרטים תמיכה כאשר באמצעות פינצטה, שכן טיפול ישיר של רשתות אין צורך במהלך ה מכתימים והניקיונות תהליך16.</li>
</ol>9. תצפית סעיפים טורי (איור 14)
<ol><li>הגדר את רשתות 5 ב בעל הדגימה מרובות בסדר הנכון (איור 14 א'), המכוונת לציר הארוך של הסדק רשת בניצב לציר מחזיק הדגימה. הידיות (חץ) הרשתות לא צריך לחתוך, כי "הרשת-מקובל" לא תיגע האחיזה.</li>
	<li>לתקן את הרשתות עם 'רשת-מקובל' (איור 14 ב) והכנס את מחזיק הדגימה לתוך המיקרוסקופ האלקטרוני שידור. הערה: לעתים קרובות שימושי לקחת תמונות הגדלה נמוכה של תא כל המקטעים (איור 15) למצוא מעניין מיקרואורגניזמים או תאים במצב טוב ללא זיהום, עם קיבוע טוב, לפני לקיחת תמונות של תא היעד.</li>
	<li>לצלם תמונות של תאי היעד בכל המדורים תא בהגדלה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת כאן דורש אין ציוד יקר. זה דורש רק על מתלה אלומיניום (איור 3), םיקדסה שלוש רשתות (איור 6 ג), סעיף החזקת לולאות (איור 10a), לולאה הרמת-מים-פני השטח (איור 11 א) וצינור מכתימים (איור 13). ישנן תכונות רבות של השיט...

טורי זגוגית אופטים הטכניקה הנכונה הוא חיוני ללמוד תאים ומרכיבים תא three-dimensionally ברמה המיקרוסקופית אלקטרון. יש ללמוד את הדינמיקה של גוף קוטב פלך במחזור התא של תאי שמרים, ואנו חשף שינויים מורפולוגיים של ultrastructure שלהם במהלך מחזור התא ואת הזמן של שכפול1,2,3, 4,5. בשנת 2006, אנחנו נטבע מילה חדשה 'structome' על-ידי שילוב 'מבנה', '-הביתה ', והוא הגדיר זאת כ 6,'כמותית ותלת ממדית מבניים מידע של כל תא ברמה המיקרוסקופית אלקטרון'7.
על ידי ניתוח structome, אשר דורשת טכניקה אופטים זגוגית טורי, התברר שיש תא שמרים של האפייה , Exophiala dermatitidis 7,כ-200,000 הריבוזומים8, Escherichia coli תא היה הריבוזומים 26,0009, תא שחפת Mycobacterium הריבוזומים 1,70010 והיה מיוג'ין ספירלה חיידקים הריבוזומים רק 30011. מידע זה שימושי באומדן לא רק את שיעור הצמיחה כל אורגניזם, אלא גם בזיהוי מינים9.
ניתוח structome נוסף, הובילו לגילוי של אורגניזם חדש; Parakaryon myojinensis נמצאה במעמקי הים החוף של יפן, מבנה תאים אשר היו ביניים בין אלה של אאוקריוטים פרוקריוטים ו-12,13,14,15. בזמן הנוכחי, טורי טכניקה אופטים זגוגית נחשב להיות כל כך קשה. שזה ייקח זמן רב להתמחות. במחקר זה, פיתחנו שיטה אמינה שבו כל אחד יכול לבצע חלוקתה זגוגית טורי ללא קושי.

<table><tbody><tr><td>Formvar making apparatus</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td><td>-</td><td>76 x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>Aluminum rack with 4-mm holes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED illumination for stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td></tr><tr><td>LED illumination for trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Ultrasonic trimming blade</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Diamond knife for trimming</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Section-holding loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Transmission electron microscope</td></tr></tbody></table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

התבוננות תאים ומרכיבים תא בשלושה ממדים בהגדלה גדולה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מחייב הכנת טורי זגוגית מקטעים של הדגימה. למרות הכנת מקטעים זגוגית טורי נחשב להיות קשה מאוד, זה די קל אם שימוש בשיטה הנכונה. בנייר זה, אנו מראים תהליך צעד אחר צעד בבטחה קבלת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים. נקודות המפתח של שיטה זו הם: 1) כדי להשתמש בחלק גדול הדגימה ולהתאים לקצה משטח והסכין הדגימה כך הם מקבילים זה לזה; 2) כדי לחתוך קטעים טוריים בקבוצות ולהימנע קושי להבחין. בין האיזורים השונים בחשבון בעזרת זוג קווצות שיער בעת אחזור קבוצה של מקטעים טורית על גבי הרשתות שסע; 3) כדי להשתמש לולאה סעיף החזקת ולמנוע ערבוב את הסדר של קבוצות סעיף; 4) כדי להשתמש 'הרמת-מים-פני לולאה' וודא כי הסעיפים ממוקמות על השיא של המים, הם נוגעים הרשת קודם, על מנת למקם אותם במיקום הרצוי על הרשתות; 5) כדי להשתמש הסרט תמיכה על מתלה אלומיניום וכדי שיהיה קל יותר להתאושש הסעיפים על הרשתות וכדי למנוע קמטים של הסרט תמיכה; ו- 6) כדי להשתמש שפופרת מכתימים ולהימנע לשבור את הסרטים תמיכה עם פינצטה. שיטה חדשה זו מאפשרת קבלת מקטעים זגוגית טורי ללא קושי. השיטה מאפשרת לנתח את מבנה התא של מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה ב- 3D, אשר אינה יכולה להיות מושגת באמצעות שיטת ultramicrotome איסוף קלטות אוטומטיים, פרצוף-בלוק טורי או יון ממוקדת קרן סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים.

ב פרוטוקול זה, שימשו םיקדסה שלוש רשתות אוסף קטעים טורי. הרשתות עשויות ניקל או נחושת. הסעיפים טורי ממוקמות על הסדק האמצעי. החריצים משני הצדדים יש צורך להציג את המקטעים בעת לאסוף אותם עם הרשת. כדי להשאיר את הרשתות במקביל הסעיפים טורי בעת לאסוף אותם עם פינצטה (איור...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

14.1K Views.  Chiba University. מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Video: A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Biochemistry

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Bioengineering

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biology

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Neuroscience

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...