Name: quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass
Uploaded: 2017-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass at JoVE.com

Ö Stephens (University of Bristol, Bristol, İngiltere) TPST1-EGFP DNA plazmid yanı sıra için Lakshmi Narasimhan Govindarajan yazılım optimizasyonu ile yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser L.L. Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC/CBRG/007/2012), Milli Eğitim Bakanlığı (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 ve RG132/15 ve AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) hibe tarafından desteklenmiştir

<ol>
	<li>Glick, B. S., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Golgi+traffic:+a+critical+assessment.">Models for Golgi traffic: a critical assessment.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).</li><li>Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mammalian+Golgi.">Architecture of the mammalian Golgi.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li><li>Lu, L., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endosomes+to+the+trans-Golgi+network.">From endosomes to the trans-Golgi network.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exiting+the+Golgi+complex.">Exiting the Golgi complex.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Tie, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+imaging+method+for+quantitative+Golgi+localization+reveals+differential+intra-Golgi+trafficking+of+secretory+cargoes.">A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes.</a> Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).</li><li>Trucco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+traffic+triggers+the+formation+of+tubular+continuities+across+Golgi+sub-compartments.">Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).</li><li>Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+dispersal+during+microtubule+disruption:+regeneration+of+Golgi+stacks+at+peripheral+endoplasmic+reticulum+exit+sites.">Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites.</a> Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).</li><li>Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+assembly+status+on+the+intracellular+processing+and+surface+expression+of+an+integral+protein+of+the+plasma+membrane.">Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).</li><li>Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nocodazole+and+taxol+affect+subcellular+compartments+but+not+secretory+activity+of+GH3B6+prolactin+cells.">Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells.</a> Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+cis-Golgi+matrix+protein,+GM130.">Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130.</a> J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).</li><li>Roth, J., Berger, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+localization+of+galactosyltransferase+in+HeLa+cells:+codistribution+with+thiamine+pyrophosphatase+in+trans-Golgi+cisternae.">Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae.</a> J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).</li><li>Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+sulfation+is+a+trans-Golgi-specific+protein+modification.">Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification.</a> J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).</li><li>Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+Arf-1+to+the+early+Golgi+by+membrin,+an+ER-Golgi+SNARE.">Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE.</a> J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).</li><li>Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapled+Golgi+cisternae+remain+in+place+as+cargo+passes+through+the+stack.">Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack.</a> Elife. 2, 00558 (2013).</li><li>Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+large+ADP-ribosylation+factor-guanine+nucleotide+exchange+factors+to+different+Golgi+compartments:+evidence+for+distinct+functions+in+protein+traffic.">Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).</li><li>Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy-based+linescan+methodologies+for+intra-Golgi+localization+of+proteins.">Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins.</a> J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).</li><li>Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-independent+secretion+requires+functional+maturation+of+Golgi+elements.">Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements.</a> J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).</li><li>Volchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countercurrent+distribution+of+two+distinct+SNARE+complexes+mediating+transport+within+the+Golgi+stack.">Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack.</a> Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).</li><li>Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+budding+within+the+Golgi+stack.">COPI budding within the Golgi stack.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Daha önce yerelleştirme ışık mikroskobu altında Golgi protein ağırlıklı olarak korelasyon veya protein görüntünün Golgi işaret bilinen Yerelleştirme15,16resimle örtüşen tarafından sayılabilir, 17. Elde edilen korelasyon veya örtüşen katsayısı ne kadar yakın test Golgi işaretçisi için dağınık şekilde proteindir yansıtır. Bu yaklaşım için en az üç uyarılar vardır. İlk olarak, korelasyon veya örtüşen katsayısı doğrusal olmayan ve doğrudan kayma mesafesi göstermez. İkinci olarak, korelasyon derecesi eleştirel mikroskobik sisteminin çözünürlüğüne bağlıdır. Bu nedenle, iki Golgi protein arasındaki katsayısını sistemden bağımsız sabit değildir. Üçüncü, iki Golgi protein ile aynı Aksiyel yerelleştirme ama cisternae boyunca farklı yanal dağıtım farklı katsayıları sahip olabilir. Bu nedenle, korelasyon veya örtüşen katsayısı Golgi protein Aksiyel yerelleştirme göstermez. Dejgaard ve diğerleritarafından önerilen alternatif bir yöntem olarak., CIS, trans-Golgi işaretleri ve faiz protein üçlü etiketli nocodazole tedavi Golgi mini-yığınlar, ışık için benzer. Her Golgi Mini yığını içinde üç en fazla yoğunluk piksel pozisyonlar iktisap ve test protein göreli konumunu bir mesafe oranı18hesaplanır. Ancak, bu yöntem uygulama büyük ölçüde sınırlar alt piksel çözünürlük elde değiştiremiyor. Önceki Nicel Metodlar, ışık, bağımsız olarak geliştirilmiştir ancak Dejgaard ve ark' e benzer bir kavram ayılar karşılaştırıldığında., eksenel yerelleştirme Golgi protein benzeri görülmemiş doğruluğu ve tutarlılığı ile ölçmek yapabiliyor.
Biz ışık LQ exogenously ifade GFP öğesini protein - TPST1-EGFP elde etmek için protokol sundu. Onun antikor varsa endojen protein LQ belirlenebilir. Birincil antikor, fare veya tavşan sonra bir tavşan veya fare anti-GM130 antikor tür bağlı olarak sırasıyla üçlü etiketleme iletişim kuralında kullanabilirsiniz. Ayirt etiketleme için tavşan ve fare anti-GM130 antikorları ticari olarak kullanılabilir. Biz daha önce tavşan ve fare anti-GM130 antikorları ışık7' aynı sonuçlar verdiğini göstermiştir. Test protein özünde mCherry füzyon, GFP öğesini Golgi marker protein GM130 antikor etiketleme ile birlikte bilinen LQ ile üçlü etiketli hücreleri için kullanılan ve dolaylı olarak LQ testi protein anlamak gibi floresan emisyon kırmızı ise. Marker protein varsayarak LQ LQm , işaretleyici protein Merkezi'nden Uzaklik GM130 olan dm, LQ testi protein x (dx/dm) × LQmhesaplanabilir. Süper çözünürlük mikroskobu ile karşılaştırıldığında ışık en büyük avantajlarından biri bunu kolayca canlı hücre görüntülemede geleneksel mikroskobik kurulumları için uygulanabilir olduğunu. Biz-si olmak güvenilir üç Floresans proteinler, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 ve GalT-iRFP670, bir arada dinamik olarak LQ, GFP-Golgin84 tek Golgi mini-yığınlar7izlemek için.
IŞIK, sonrası edinme analiz, özellikle analyzable Golgi mini-yığınlar yelpazesi en zaman alıcı bir adımdır. Golgi mini-yığınlar her iki boyutu ve moleküler kompozisyonu19heterojen olduğundan, Golgi mini-yığınlar türdeş olmayan mimarisi veya bizim hesaplanması belirsizlik LQs (şekil 3F) dağıtımını temsil ediyorsa belli değil LQ. Nedenleri ne olursa olsun bulduk n küçükken hangi tehlikeye analyzable Golgi mini-LQ doğruluğunu sağlamak için yığınları (n) çok sayıda sahip olmak önemlidir. Tipik olarak, veri n ≥ 100 üzerinden birden çok hücre ile güvenilir LQs verir. Bu nedenle, ışık yerelleştirme topluluğu ortalama veri, Golgi mini-yığınlar bireysellik engellemeyecek verir. Başka bir ışık tüm Golgi proteinler tek bir merkezi etrafında dar bir dağıtım olduğunu varsayar kısıtlamasıdır. COPI alt birimleri, ARF1 ve çözünür N ethylmaleimide duyarlı faktör ek protein reseptörü (tuzaklarına)20,21, gibi bazı Golgi proteinler CIS transiçin geniş dağıtmak rapor- Golgi ve TGN. Muhtemelen onların Golgi yerelleştirme LQ tarafından eğitim uygun değil. IŞIK şu anda Golgi mini yığınlarının hem zahmetli hem de öznel olan el ile seçimi içerir ışık gelecekteki gelişimini Golgi mini-yığınları ile çok az insan müdahale otomatik olarak seçmek için bir yazılım aracı uygulamak olacaktır.
IŞIK Uzaysal çözünürlük nedir? LQ unitless, bir oranı bu yana kayma bir mesafe anlamına gelmez. Burada, çok kaba bir tahmin vermek girişimi. IŞIK Uzaysal çözünürlük iki çözülebilir Golgi protein arasındaki en küçük Aksiyel mesafe olarak tanımlanabilir. LQs çeşitli Golgi proteinler7inceleyerek, SEM çevresinde 0,03 n ≥ 100 aralığı ile veri kümeleri bulduk. Varsayarsak iki Golgi protein aynı n = 100 ve SEM 0.03, protein var önemli farklı yerelleştirme tarafından iki Golgi = t-Testi (p < 0,05), Yani, çözülebilir, onların LQs arasındaki farkı ≥ 3 × SEM ise 0,09 =. EM verilerden de GM130 GalT-mCherry ışık içinde mesafedir, Golgi Mini yığın Aksiyel uzunluğu olduğunu tahmin edebilirsiniz ~ 300 nm8. Bu nedenle, ışık çözünürlüğe 0,09 × 300 = 30 olarak tahmin nm Golgi eksen boyunca. IŞIK, daha büyük bir n genellikle sırayla daha yüksek çözünürlükte sonuç daha küçük SEM verir.
İkinci tekniği doğrudan nicel yerelleştirme veri yol değil bu yana doğrudan ışık çözünürlük IMMUNO-altın EM olan için karşılaştırmak muhtemelen uygun değil. Benzer şekilde ışık, Golgi eksen boyunca IMMUNO-altın EM çözünürlüğü iki çözülebilir Golgi işaretçileri arasındaki en küçük mesafe olarak tanımlanabilir. Çözünürlüğü ölçmek için çift-IMMUNO-altın Golgi ekseni boyunca birbirine yakından bitişik iki Golgi protein etiketlerine göre çalışma gerektirir. Sistemik böyle çalışma bizim bilgimize göre muhtemelen kullanılamaz. Giriş bölümünde açıklandığı gibi IMMUNO-altın EM ile mekansal çözünürlükte sınırlayan faktörler daha kötü olamaz Çözünürlük yapar antikor kompleksi, büyük boy biridir ~ 20 nm. Başka bir önemli sınırlayıcı faktör görüntü çözünürlüğü antijen moleküllerin etiketleme yoğunluğudur. Nyquist örnekleme teoriye göre en az iki altın parçacıkları çözünürlük birim başına olmalı. Çoğu IMMUNO-altın EM çalışmalarda, komşu altın parçacıkları arasındaki mesafeleri değil < 15 nm nedeniyle çok düşük verimlilik etiketleme; Bu zor bir görüntü çözünürlüğü daha az 30 elde etmek bu tekniği için yapar nm. Bu açıdan, ışık çözünürlüğü en az IMMUNO-altın EM karşılaştırılabilir olduğunu tahmin ediyoruz.
IŞIK son derece tutarlı sonuçlar veren sağlam bir yöntemdir. Mikroskop kullanılan tür bağımsızdır. Aynı sonuç vermedi o geniş alanlı ve iplik disk confocal mikroskoplar test ettik. LQs deneyler farklı toplu işlemleri satın aynı Golgi proteinlerin de birbirleri ile iyi anlaşma vardı. Golgi farklı aralığı ikamet proteinlerin oluşan bir LQ veritabanı karşılaştırma ve yorumu için oluşturuldu. Biz daha fazla ışık araştırma topluluk kullanımını önemli ölçüde veritabanı genişletin bekliyoruz. Sonuç olarak, kantitatif açıklayan çok sayıda Golgi proteinler yerelleştirilmesini daha eksiksiz bir veritabanı büyük organizasyon ve işlev Golgi kompleksi anlamada yardımcı olacaktır.

Golgi kompleksi memeli hücreleri1,2,3' te proteinler ve yağlar (bundan sonra yükler) salgı/endositik kaçakçılığı önemli rol oynar. Golgi yükler sadece için çeşitli alt hücresel kompartmanlarda sıralanmış ama aynı zamanda glikozilasyon çeşitli türlerine göre değişiklik. Memeli Golgi kompleksi çok sayıda yanal bağlı Golgi yığınlar, ki genellikle 4-11 sıkı bitişik ve düz zar kesesi cisternae denilen oluşur oluşur. Seri olarak yığılmış Golgi cisternae daha fazla, diğer bir ucundan CIS, medial ve transkategorize edilir-cisternae. Trans-yan Golgi yığın, trans- transolarak adlandırılan borulu ve retikulum membran ağın çoğu membran sac geliştirir-Golgi ağ (TGN)4. Salgı yol endoplazmik retikulum (ER) türetilmiş yükler, CIS, Golgi yığın girin-yan ve daha sonra sırayla medial ve transyoluyla geçmek-cisternae. Gönderileri sonunda Golgi trans, çıkmak-Golgi veya TGN plazma zarı, endosomes veya salgı granül destining.
Nasıl yükler Golgi yığın transit ve Golgi cisternal kuruluşu nasıl saklandığına ilişkin moleküler ve hücresel mekanizmaları gizemli kalır ve hala bir hararetli tartışmalara1altında şu anda. Bu alandaki zorluklardan biri Golgi cisternae bir optik mikroskobu çözünürlük beri sadece elektron mikroskobu (EM) altında çözülebilir (~ 200 nm) bireysel Golgi cisternae (< 100 nm her iki cisternal kalınlıkta gidermek için yeterli değil ve mesafe) Bu nedenle, alt-Golgi yerelleştirme ikamet proteinlerin ve transit gönderileri geleneksel belirlenir tarafından IMMUNO-altın EM. Ancak, IMMUNO-altın EM çok teknik olarak talep ediyor ve çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği. EM çözünürlük-ebilmek var olmak alt nanometre, IMMUNO-altın EM tarafından tanınan çözünürlüğü büyük ölçüde karmaşık antikor (birincil ve ikincil antikor) boyutunu ve altın parçacık tarafından engel oluyor ve 20 kötü olabilir rağmen nm. Ayrıca, EM görüntüleri 2D ince-bölümler yerine bağlı olarak göreceli konumunu ve yönünü 2D bölüm5hatalı sonuçlara yol açabilir Golgi 3D bir genel görünümünü elde edilir. Örneğin, bir EM tek bölüm okuyan ondan beri her ikisi de aynı yuvarlak membran profiller görüntüleyebilirsiniz güvenilir bir tübül ortogonal görünümünden bir vezikül ayırt değiştiremiyor. Emisyon tükenmesi (STED), photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (3D yapılı aydınlatma mikroskobu (3D-SIM), gibi süper çözümleme mikroskobu teknikleri son gelişiyle uyarılmış Fırtına), alt-Golgi yapıları ışık mikroskoplar6altında çözmek sağlar. Ancak, önemli ölçüde kullanımları hücre biyolojik çalışmada, Golgi sınırlayabilirsiniz en az dört dezavantajları vardır. 1) geçerli süper çözümleme teknikleri çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları olan pahalı ve özel donanım yapılandırması gerektirir. 2) bazı süper çözümleme teknikleri için özel Floresans etiketleme iletişim kurallarına gerek. 3) rağmen en iyi koşul altında bu tekniklerin 20-110 nm mekansal çözünürlükte iddia, gerçek örneklerinde elde pratik çözünürlük çok daha kötü olabilir. 4) içinde karşılaştırma için geleneksel mikroskobu, bu süper çözümleme teknikleri hala yürütülmesi konusunda zorluklar çok renkli, 3D veya hücre Imaging, tek başına veya birlikte yaşamak. Muhtemelen en önemlisi IMMUNO-altın EM ve süper çözümleme mikroskobu teknikleri nitel nicel yerelleştirme veri yerine verim.
Kısmen yukarıda belirtilen sorunları çözmek çalışırken, biz son zamanlarda Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık), sistematik ve kantitatif bir Golgi yerelleştirmek için Imaging tarafından adlı bir konvansiyonel ışık mikroskobu dayalı yöntem geliştirdik IMMUNO-altın EM7eşdeğer bir çözünürlükte protein. Bu yöntemde, kültürlü memeli hücrelerinde Golgi Golgi mini-yığınlar nocodazole, bir Mikrotubul depolymerizing ilaç tedavisi tarafından dağınık olduğunu. Nocodazole kaynaklı Golgi mini yığınlarının (bundan sonra Golgi mini-yığınlar) yakından organizasyon ve hücresel işlevler8,9,10yerli Golgi yığınlarda benzer kapsamlı çalışmalar göstermiştir, 11. Bir test protein yerelleştirme sayının (LQ) ışık elde edilebilir ve nicel alt-Golgi yerelleştirme gösterir. LQs sayısal değerler karşılaştırılabilir ve 25'ten fazla Golgi işaretlerinin LQ veritabanı mevcut olmuştur.
IŞIK içinde endojen veya exogenously ifade GM130, GalT-mCherry ve test protein (x) tarafından üç kez etiketli Golgi mini-yığınlar. GM130 ve GalT-mCherry, CIS- ve trans-Golgi işaretleri sırasıyla12,13, referans noktaları sağlamak. Üçlü Floresan, kırmızı (R), yeşil (G) ve far-red (B), yapay olarak kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla görüntülenir. Merkezi Floresans kitle (bundan sonra Merkezi) alt piksel çözünürlük elde etmek için kabul edilir. Golgi eksen GalT-mCherry olan için GM130 merkezi üzerinden vektör olarak tanımlanır. Golgi Mini yığın Golgi ekseni etrafında sonsuz dönme simetri ile silindirik yapısı olarak modellenmiştir. Bu nedenle, Golgi Mini yığını daha fazla Golgi eksen boyunca tek boyutlu bir yapı olarak modellenebilir. LQ testi protein x dx/d1dx olduğu x merkezine uzaklik bu GM130, d1 GM130 olan için merkezi GalT-mCherry dan mesafe olsa, olarak tanımlanır. X Merkezi Eksen dışı projeksiyon Aksiyel uzaklığı hesaplama için kullanılır. Golgi eksen, Aksiyel açı, dx, d1, açı α ve β açısı, ışık için de dahil olmak üzere değişkenler, şematik Resim 1' de gösterilmiştir. LQ Golgi Aksiyel açısı bağımsız olsa da Golgi mini-yığınlar rastgele bir hücreye yönlendirmek.
Golgi mini-yığınlar Albümdeki inhomogeneous görünür. Analyzable Golgi mini-yığınlar ışık için seçmek için üç ölçüt geliştirdik. 1) sinyal-gürültü oranı kriteri, hangi ≥ 30 her kanaldaki arka plan standart sapma (SD) Golgi Mini yığıta toplam yoğunluğunu oranıdır. Bu ölçüt Merkezi kütlenin, Golgi mini-yığınlar sinyal noise oranları üzerinde bağlıdır konumlandırma doğruluğunu sağlamaktır. 2) d1≥ 70 gerektirir Aksiyel açı ya da mesafe kriteri, nm. d1 Golgi Aksiyel açısı artış ile azalır. Ne zaman Aksiyel açı 90 ° yaklaşıyor ya da dikey, Mini yığını d1 sigara çözülebilir olur 0 yaklaşıyor. d1≥ 70 nm etkili bir şekilde dikey Golgi mini-yığınlar hariç. 3) co-doğrusallık ölçütü, hangi da | tan α | veya | tan β | ≤ 0,3 olduğunu. Bu ölçüt mini bir yığın üç Merkezi yeterince co-doğrusal Golgi Mini yığını için bizim tek boyutlu model olmasını sağlar. Tüm ışık mikroskoplar renk sapması olan kırmızı, yeşil ve far-red floresan merkezleri göreli konumları ciddi deforme edebilirsiniz acı. Renk sapmaları mikroskop sistemlerinin deneysel olarak kırmızı, yeşil ve far-red floresan tarafından üç kez etiketli 110 nm boncuk Imaging tarafından kalibre edilmiş. Her boncuk görüntüsünün kırmızı merkezi boncuk gerçek konumunu tanımlanır ve Kromatik vardiya-yeşil ve far-red merkezleri tarafından birinci dereceden polinom fonksiyonların donatılmıştır. Golgi mini-yığınlar merkezlerinden Kromatik yeşil ve far-red Kanallar olarak kaydırır düzeltmek için polinom fonksiyonların tabi.
IŞIK ile a kararlılık-in elde edebilirsiniz ~ 30 nm standart koşullar altında Golgi eksen boyunca. Önemlisi, kantitatif Golgi protein var eşlemek için uyguladıkları bir yöntem sağlar. IŞIK geleneksel mikroskoplar, geniş alanlı gibi veya confocal mikroskoplar, ortak Floresans etiketleme iletişim kuralları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Görüntüleme ve veri işleme gibi bir saat gibi kısa sürebilir. IŞIK, biz doğrudan salgı kargo aşamalı geçiş CIS- transiçin göstermiştir-Golgi7yan.

<table><tbody><tr><td>fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope</td></tr><tr><td>Glass coverslip &amp;Phi; 12 mm (No. 1.5)</td><td>Menzel</td><td>CB00120RAC</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip &amp;Phi; 25 mm (No. 1.5)</td><td>Menzel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Capricon</td><td>DMEM-HPA-P50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Merck</td><td>487928</td><td></td></tr><tr><td>transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>transfection medium. Commercial name: OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TPST1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>66617</td><td>A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)</td></tr><tr><td>GalT-mCherry</td><td></td><td></td><td>Made in our lab</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488</td><td>CALBIOCHEM</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610823</td><td>Primary antibody for human GM130</td></tr><tr><td>far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Far red fluorescence conjugated secondary antibody</td></tr></tbody></table>

quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass

CISdahil olmak üzere alt-Golgi bölgelere daha fazla sınıflandırılabilir seri olarak yığılmış membran cisternae Golgi kompleksi oluşur-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi ve trans-Golgi ağ. Golgi hücresel işlevlerini kendi ikamet proteinler karakteristik dağıtım tarafından belirlenir. Konvansiyonel ışık mikroskobu Uzaysal çözünürlük alt-Golgi yapısı veya cisternae gidermek için çok düşüktür. Böylece, IMMUNO-altın elektron mikroskopi sub-Golgi düzeyinde bir protein yerelleştirmek için seçim yöntemidir. Ancak, teknik ve araç çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği vardır. Biz burada Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık) sistematik ve kantitatif Golgi protein yerelleştirmek için Imaging tarafından denilen bizim son zamanlarda geliştirilen süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır. IŞIK standart floresan etiketleme iletişim kuralları ve geleneksel geniş-alan veya confocal mikroskoplar üzerinde temel alır. Shift renk sapmaları mikroskobik sistem, resim alma ve sonrası edinme analiz kalibrasyonu içerir. Bir test protein alt-Golgi lokalizasyonu kantitatif yerelleştirme bölüm ifade edilir. IŞIK dört ana avantajı vardır; hızlı, geleneksel yöntemler ve araçlar dayalı, yerelleştirme sonucudur nicel ve bu tanıyor ~ 30 nm pratik çözünürlük Golgi eksen boyunca. Burada bir test Golgi protein yerelleştirmek için ışık detaylı Protokolü açıklar.

Bizim laboratuarda kullanılan gibi bir planı apochromatic objektifle donatılmış modern araştırma sınıf ışık mikroskobu çok az renk sapmaları (Şekil 2A) gösterir. Ancak, dikkatli bir muayene çok renkli floresan boncuk görüntünün üst karakter aynı boncuk (Şekil 2B) farklı renk görüntülerin ortaya çıkarabilir. Biz kırmızı kanalı renk sapmaları özgür ve bu nedenle kırmızı Floresans merkezlerinden boncuk doğru pozisyonlar vardır tanımlar. Göreli Kromatik-vardiya yeşil ve far-red floresan yeşil ve mavi vektörel çizimler kırmızı Floresans (Şekil 2C) Merkezi'nden kaynaklanan temsil edilebilir. Kromatik-shift görüntüleme-düzlem içinde ampirik olarak vektör yeşil ve mavi için her boncuk (Şekil 2D) tarafından gösterilmektedir. Bizim mikroskop için renk vardiya büyüklükleri ve vardiya değişim x göre yön olarak düzgün değildir ve y konumlarını. Far-red merkezleri kayması olduğu kadar 50 olabilir gibi Kromatik kaymalı önemli ölçüde ışık doğruluğunu etkileyebilir nm. Bu nedenle Kromatik kaymalı düzeltilmiş olması gerekir. Boncuk merkezlerinden elde sonra kalibre ve daha sonra renk vardiya merkezlerinin düzeltmek için birinci dereceden polinom uygun istihdam. Shift Kromatik aberasyon bu yaklaşım (Şekil 2 D-G) tarafından büyük ölçüde artırıldı.
Memeli hücrelerinde Golgi kompleksi genellikle geleneksel optik mikroskop (şekil 3A) altında çözülebilir değildir perinükleer alanda toplanır. Nocodazole tedavi için 3 saat sonra perinükleer Golgi kompleksi kaybolur ve sitoplazma (şekil 3B) boyunca endoplazmik retikulum çıkış sitelerdeki Golgi mini-yığınlar düzinelerce toplayın. Golgi membran ve toplanan Golgi mini-yığınları büyük boyutta mevcuttur ve analiz için seçilen değil. Golgi mini-yığınlar yelpazesi gösteren bir örnek görüntü şekil 3' teCgösterilir. Mini-yığınlar şekil 3' teDlistelenen 40 seçili Golgi "Makro-Golgi ROI muayene" aracını kullanarak. Üç ölçüt uygulandıktan sonra 21 Golgi mini-yığınlar analyzable ve seçilen hesaplama LQs, TPST1-EGFP (şekil 3D; "L" etiketli), şekil 3'Egösterilen onların istatistikleri ile. Toplamda, 111 analyzable Golgi mini-yığınlar 12 hücrelerden seçildi ve TPST1-EGFP LQ 0,76 0,04 olmak ölçüldü (ortalama ± SEM; n 111 =) (şekil 3F). TPST1-EGFP LQ, giantin arasında konumlandırmaktadır (LQ 0.59 =) ve EGFP-Rab6 (LQ = 1.04)7. GS15 olduğunu (LQ 0.83 =) ve ST6GalT1-AcGFP1 (LQ 0,82 =). Edebiyat nitel yerelleştirme verileri dikkate alınarak alt-Golgi bölgeleri LQs göre tanımlamış olduğunuz: ERES/ERGIC, <-0.25; CIS, 0.00 ± 0,25; medial, 0.50 ± 0,25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 ve TGN, 1,25-2.00. TPST1-EGFP LQ, bu nedenle onun transgösterir-bir önceki çalışmada14ile anlaşma olduğunu Golgi yerelleştirme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig1.jpg"> Resim 1 . IŞIK hesaplamasında kullanılan değişkenler gösterilen şematik çizimler. (A)xz görünümü Golgi Mini yığınının, GM130, GalT-mCherry ve protein koaksiyel merkezleri vardır x ekseni, eksenel açı, dx ve d1Golgi gösteren Floresans. Golgi Mini yığın onun projeksiyon görüntü düzlem üzerine görüntüdür. (B) xy görünümüyle protein açısı α, β açısı ve projeksiyon Aksiyel gösteren x eksen dışı Merkezi Golgi Mini yığın mesafe dx. A ve B adapte şekil 1E ve şekil 1F bizim önceki yayın7, anılan sıraya göre. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55996/55996fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig2.jpg"> Resim 2 . Kromatik kaymalı düzeltme. (A) üç renkli Birleştirilen görüntüyü 110 nm çok renkli boncuklar geniş alanlı mikroskop tarafından satın aldı. Her boncuk yayar yeşil, kırmızı ve far-red (yapay mavi renkli) floresan. Ölçek bar, 10 µm. (B) büyütülmüş bir birleştirilmiş tek-boncuk resmin görünümünü göze çarpan renk vardiya. Ölçeği 200 bar, nm. Vardiya yeşil ve far-red boncuk görüntülerin vektörel çizimler tarafından kırmızı boncuk görüntü (0,0) Merkezi'nden green (yeşil vektör) ve far-red (mavi vektör) boncuk görüntüler, merkezleri için sırasıyla temsil edilebilir olduğunu gösteren (C) A şematik diyagramı. (D, E) Kromatik kaymalı düzeltme etkisi. Görüntünün aynı alandaki, yeşil ve mavi vektörel çizimler daha önce çizilen ve sonra düzeltme vardiya. Küçük vardiya görselleştirmek için her vektör büyüklüğü 200-fold güçlendirilmiş. (F, G) Dağılım gösteren merkezleri green (yeşil nokta) ve far-red (mavi noktalar) boncuk önce ve sonra üst karakter düzeltme çizer. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55996/55996fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig3.jpg"> Şekil 3 . Burada TPST1-EGFP LQ edinme ışık, tipik bir örneği. Bir HeLa hücre TPST1-EGFP (yeşil) ve GalT-mCherry (kırmızı) ifade lekeli için endojen GM130 (mavi). (A) A tipik hücre. (B, C, D, E) Nocodazole ile tedavi bir hücre görüntüsü (B). Görüntüden analyzable Golgi mini-yığınlar Ciçinde gösterildiği gibi seçildi. Seçili Golgi mini-yığınlar kimlik numaralarıyla etiketlenir. Bu maskeli Golgi mini yığınlarının görüntülerini aşağıda D içinde onların kimlik numaraları ile görüntülenir. "L" Golgi Mini yığın LQ (analyzable Golgi Mini yığınlar) hesaplanması için geçerli olup olmadığını gösterir. 21 mini yığınlarının hücreden LQs histogramını Eiçinde gösterilir. (F) Histogram LQs 111 mini yığınlarının 12 hücrelerden biri. Histogram içinde gösterilen değerdir ortalama ± SEM <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55996/55996fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek malzemeler: Makro-Golgi ROI inspection.ijm, makro-çıkış 3 kanalları data.ijm, Matlab kodları, My_train.exe, My_test.exe ve elektronik tablo template.opj.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass at JoVE.com

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Görüntüleme.  Nanyang Technological University. Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Video: Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biyokimya

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Nörobilim

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Biyoloji

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Immün SYNAPSE oluşumu sırasında B hücrelerinde organelle dinamikleri eğitimi

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a super-resolution technique that allows for the determination of the microcompartments that are accessible for proteins by generating localization and tracking maps of these proteins. Moreover, by multi-color localization microscopy, the localization and tracking profiles of proteins in different subcompartments are obtained simultaneously. The technique is specific for live cells and is based on the repetitive imaging of single mobile membrane proteins. Proteins of interest are genetically fused with specific, so-called self-labeling tags. These tags are enzymes that react with a substrate in a covalent manner. Conjugated to these substrates are fluorescent dyes. Reaction of the enzyme-tagged proteins with the fluorescence labeled substrates results in labeled proteins. Here, Tetramethylrhodamine (TMR) and Silicon Rhodamine (SiR) are used as fluorescent dyes attached to the substrates of the enzymes. By using substrate concentrations in the pM to nM range, sub-stoichiometric labeling is achieved that results in distinct signals. These signals are localized with ~15&#8211;27 nm precision. The technique allows for multi-color imaging of single molecules, whereby the number of colors is limited by the available membrane-permeable dyes and the repertoire of self-labeling enzymes. We show the feasibility of the technique by determining the localization of the quality control enzyme (Pten)-induced kinase 1 (PINK1) in different mitochondrial compartments during its processing in relation to other membrane proteins. The test for true physical interactions between differently labeled single proteins by single molecule FRET or co-tracking is restricted, though, because the low labeling degrees decrease the probability for having two adjacent proteins labeled at the same time. While the technique is strong for imaging proteins in membrane compartments, in most cases it is not appropriate to determine the localization of highly mobile soluble proteins.

Here, we present a protocol for multi-color localization of single membrane proteins in organelles of live cells. To attach fluorophores, self-labeling proteins are used. Proteins, located in different membranes compartments of the same organelle, can be localized with a precision of ~18 nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Hücrelerde ATG9A Lokalizasyonunun Araştırılması

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive pathological conditions. A set of proteins, called ATG proteins, comprise the core autophagy machinery and work together in a defined hierarchy. Studies in recent years have improved our knowledge of the autophagy pathway. Most recently, it has been proposed that ATG9A vesicles are at the heart of autophagy, as they control the rapid de novo synthesis of an organelle called the phagophore. The study of ATG9A has proven challenging, since ATG9A is a transmembrane protein, and it is present in different membrane compartments. As such, understanding its trafficking is an important element for understanding autophagy. Here, detailed methods are presented that can be used to study ATG9A and, in particular, its localization using immunofluorescence techniques, which can be assessed and quantified. The pitfalls of transient overexpression are also addressed. The correct characterization of ATG9A function and the standardization of techniques to analyze its trafficking are crucial to further characterize the events governing autophagy initiation.

Yazar Spotlight: Çok Yayılmalı Bir Membran Proteini olan ATG9A'yı Görüntüleme  

This protocol describes various methods that can help in the study of ATG9A biology, including immunofluorescence followed by image analysis, transient overexpression considerations, and investigating the ATG9A glycosylation status using western blot.

Çok Kapsamlı Bir Membran Proteini Olan ATG9A'nın Görüntülenmesi

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...