Name: quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass
Uploaded: 2017-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
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우리는 소프트웨어 최적화와 도움 뿐만 아니라 락 쉬 미와 Narasimhan Govindarajan TPST1 EGFP DNA 플라스 미드, 디 스티븐 스 (브리스톨의 대학, 브리스톨, 영국) 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 L.L. 국립 의학 연구 위원회 (NMRC/CBRG/007/2012), 교육 (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 및 RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-t 2-2-073)에서 교부 금에 의해 지원 되었다

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전, 가벼운 현미경 검사 법에서 골 지 단백질의 지 방화는 주로 상관 관계 또는 알려진된 지역화15,16, Golgi 마커 이미지와 단백질의 이미지의 중첩의 정도 의해 계량 17. 결과 상관 관계 또는 겹치는 계수 얼마나 가까운 테스트 단백질이 골 마커를 공간적으로 반영 합니다. 이 접근에 대 한 적어도 3 개의 경고가 있다. 첫째, 상관 관계 또는 겹치는 계수 비선형 이며 직접 공간적 거리 표시 하지 않습니다. 둘째, 상관 관계의 정도 비판적으로 현미경 시스템의 해상도에 따라 달라 집니다. 따라서, 두 골 단백질 사이의 계수 시스템 상수 아니다. 셋째, 같은 축 지역화 cisternae 따라 다른 측면 배포와 두 골 단백질 고유 계수를 가질 수 있습니다. 따라서, 상관 관계 또는 겹치는 계수 나타내지 않습니다 Golgi 단백질의 축 지역화. Dejgaard 외에 의해 제안 된 다른 방법에서., cis, 트랜스-Golgi 마커 및 관심사의 단백질은에 트리플 표시 nocodazole 골 지 미니-스택, GLIM와 비슷한 취급. 각 골 미니 스택 내 3 최대 강도 픽셀의 위치를 인수 하 고 테스트 단백질의 상대적 위치는 거리 비율18로 계산 됩니다. 그러나, 그들의 방법은 크게 제한 응용 프로그램 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위해 수 없습니다. 이전 양적 방법, GLIM, 독립적으로 개발 되었다 그러나 곰 Dejgaard 외의 비슷한 개념에 비해., 전례가 없는 정확도와 일관성 Golgi 단백질의 축 지역화를 정할 수 있다.
우리는 것 표현된 GFP 태그 단백질-TPST1-EGFP LQ를 얻으려고 GLIM의 프로토콜을 제시. 내 생 단백질의 LQ는 항 체는 사용할 수 있는 경우 확인할 수 있습니다. 1 차적인 항 체, 마우스 또는 토끼, 토끼 또는 마우스 안티-GM130 항 체의 종류에 따라 각각 사용할 수 있습니다 트리플 라벨 프로토콜. 토끼와 마우스 안티-GM130 항 체 면역 형광 라벨에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 이전 토끼와 마우스 안티-GM130 항 체 GLIM7에서 동일한 결과 줄을 증명 하고있다. 만약 테스트 단백질은 본질적으로 빨간색 형광 방출, mCherry 퓨전, GM130 항 체 라벨와 함께에서 알려진된 LQ와 마커 단백질 트리플 레이블 셀에 사용 하 고 테스트 단백질의 LQ를 직접 추론할 수 GFP 태그 골 등 이다. 마커 단백질의 가정 LQ LQm 이며 GM130의 마커 단백질의 중심 으로부터 거리 dm, LQ는 테스트 단백질의 x (dx/dm) × LQm로 산출 될 수 있다. 슈퍼 해상도 현미경에 비해 GLIM의 가장 큰 장점 중 하나입니다 그것은 쉽게 기존의 미세한 설정에서 라이브 셀 이미징에 적용할 수 있습니다. 우리는 LQ의 GFP-Golgin84 단일 골 미니 스택7동적으로 모니터링에 대 한 3 개의 형광 단백질, GFP-Golgin84, mCherry GM130, 갈 트-iRFP670의 조합을 노력 했다.
GLIM, 가장 시간이 많이 걸리는 단계에서는 analyzable 골 미니-스택 선택에 특히 후 수집 분석입니다. 골 지 미니-스택 크기와 분자 구성19이종은, 그것은 분명 LQs (그림 3 층)의 분포 골 미니-스택의 이기종 아키텍처 또는의 우리의 계산의 불확실성을 나타내는 경우는 LQ입니다. 원인에 우리 때 n은 작은 타협은 analyzable 골 미니-스택 (n) LQ의 정확도 보장 하기 위해 다 수 중요 하다는 것을 발견. 일반적으로, n ≥ 100 여러 셀에서 데이터는 신뢰할 수 있는 LQs를 생성합니다. 따라서, GLIM 골 지 미니-스택 개성 왜곡 앙상블 평균 지역화 데이터를 제공 합니다. GLIM의 또 다른 한계는 모든 골 단백질 단일 센터 주위는 좁은 분포는 가정 이다. COPI 소 단위, ARF1 및 수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (SNAREs)20,21, 같은 일부 골 단백질, 트랜스- cis 에서 광범위 하 게 배포 보고 되었습니다. 골 고는 TGN입니다. 아마는 LQ에 의해 그들의 골 지 방화 연구를 적합 하지 않다. GLIM는 현재 모두 힘들고 주관적입니다 Golgi 미니-스택, 수동 선택 포함 최소한의 인간의 간섭으로 Golgi 미니-스택 자동으로 선택 하는 소프트웨어 도구를 구현 하 GLIM의 미래 발전 될 것입니다.
GLIM의 공간적 해상도 무엇입니까? LQ는 비율을 단위 이므로 공간 거리를 나타내지 않습니다. 여기, 우리는 매우 거칠게 추정을 제공 하려고 합니다. GLIM의 공간 해상도 두 확인할 Golgi 단백질 사이의 작은 축 거리도 정의할 수 있습니다. 우리 주위에 0.03 n ≥ 100 범위와 데이터 집합의 SEMs 발견 다양 한 골 단백질7의 LQs를 검사. 가정 두 골 단백질 같은 n 100과 sem의 = 0.03, 단백질에 의해 중요 한 다른 지역화는 두 골 = t-검정 (p < 0.05), 즉, 확인, 그들의 LQs 사이의 차이점은 ≥ 3 × sem의 경우 = 0.09. EM 데이터에서 우리는 또한 GM130에서 GLIM에 갈-mCherry 거리, 골 지 미니 스택의 축 길이 예상할 수 있습니다 ~ 300 nm8. 따라서, GLIM의 해상도 0.09 × 300 = 30 추정 골 축 nm. GLIM에서 큰 n 일반적으로 작은 SEM를 차례로 더 높은 해상도 얻을 수 있습니다.
아마 후자의 기법 양적 현지화 데이터를 직접 생성 하지 않습니다 이후 면역-골드 그들의 GLIM의 해상도 직접 비교를 적합 하지 않다. GLIM와 마찬가지로 골 축 면역-골드 그들의 해상도 수로 정의할 수 두 확인 Golgi 마커 사이의 작은 거리. 해상도 측정 하 골 축을 따라 서로 밀접 하 게 인접 한 두 골 지 단백질의 듀얼-면역-골드 라벨의 연구가 필요 합니다. 이러한 조직의 연구 아마 우리의 지식에 따라 제공 되지 않습니다. 면역-골드 그들의 공간 해상도에 제한 요소 중 하나는 해상도 보다 더 나쁜 것을 시키는 항 체 복잡 한의 큰 크기 소개에서 설명 했 듯이, ~ 20 nm. 이미지 해상도의 또 다른 중요 한 제한 요인은 항 원 분자의 라벨 밀도입니다. 나이 키스 트 샘플링 이론에 따르면 해상도 단위 당 금 입자를 두 개 이상 있어야 합니다. 대부분의 면역-골드 EM 연구에서 이웃 금 입자 사이 거리는 매우 낮은 인 < 15 nm 하지 라벨 효율성; 이것은이 기술이 30 보다 작은 이미지 해상도 달성 하기 어려운 nm. 이 관점에서 우리는 GLIM의 해상도 적어도 면역-골드 그들의 예상.
GLIM 높게 일관 된 결과 제공 하는 강력한 방법입니다. 그것은 사용 하는 현미경의 종류의 독립입니다. 같은 결과가 나왔고 그 넓은 필드와 회전 디스크 confocal 현미경 테스트 했습니다. 실험의 다른 배치에서 인수 같은 골 단백질의 LQs 서로와 좋은 계약에 또한 있었다. 다양 한 골 주민 단백질의 구성 된 LQ 데이터베이스 비교 및 해석에 대 한 생성 되었습니다. 우리는 연구 커뮤니티에서 GLIM의 더 많은 사용 데이터베이스 확장 크게 것입니다 기대 합니다. 따라서, 양적 Golgi 단백질의 많은 수의 지역화를 설명 하는 자세한 데이터베이스 조직 그리고 Golgi 단지의 기능을 이해에 크게 도움이 됩니다.

골 복잡 한 포유류 세포1,2,3분 비/endocytic 단백질과 지질 (이 화물)의 인신 매매에 필수적인 역할을 재생 합니다. 골에서 화물은 다양 한 하위 세포질 구획 정렬 뿐만 아니라 또한 다양 한 유형의 glycosylation 수정. 포유류 골 복잡 한 일반적으로 구성 된 4-11 밀접 하 게 인접 하 고 평평한 막 낭 cisternae 라는 수많은 옆으로 연결 된 골 스택 구성 되어 있습니다. 순차적으로 누적된 골 cisternae 더로 분류 됩니다, 다른 한쪽 끝에서 cis, 중간 및 트랜스-cisternae. 트랜스에서-Golgi 스택, 트랜스의 측면-대부분 막 sac 트랜스라고 하는 관 및 그물 막 네트워크로 개발-Golgi 네트워크 (TGN)4. 분 비 통로에서 바인딩과 그물 (응급실)에서 파생 된 화물의 cis에 Golgi 스택에 입력-측면 및 다음 순차적으로 통과 중간 및 트랜스-cisternae. 화물 결국 종료 트랜스에서 골-골 또는 TGN destining 원형질 막, endosomes 또는 분 비과 립.
어떻게 화물 운송 Golgi 스택 및 어떻게는 Golgi의 cisternal 조직 유지의 분자 및 세포 메커니즘 신비로운 남아 있다 고 현재 열띤된 토론1의 밑에 아직도. 이 분야에 있는 어려움 중 하나는 Golgi cisternae만 확인할 수 전자 현미경 (EM) 아래는 광학 현미경의 해상도 때문입니다 (~ 200 nm) 개별 Golgi cisternae 두 cisternal 두께에서 (< 100 nm를 해결 하기 위해 충분 하지 않습니다 그리고 거리)입니다. 따라서, 거주 단백질과 외계 화물의 하위 Golgi 지역화 통상 면역-골드 EM에 의해 결정 됩니다. 그러나, 면역-골드 그들은 매우 기술적으로 요구 하 고 그것은 대부분의 세포 생물학 실험실의 기능. EM의 해상도 하위 나노미터 수 면역-골드 엠에서 제공 하는 해상도 크게 복잡 한 항 체의 크기 (1 차 및 이차 항 체)와 금 입자에 의해 방해 하 고 20 보다 더 나쁠 수 있다 nm. 또한, EM 이미지 2D 얇은-섹션 대신 상대 위치 및 2D 섹션5의 방향에 따라 잘못 된 결론에 발생할 수 있습니다 골의 3 차원 세계 보기에서에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어 EM 단일 섹션 공부 아니다 안정적으로 구별할 수 있는 소포는 관의 직교 보기 때문에 둘 다 동일한 라운드 막 프로필을 표시할 수 있습니다. 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM) 같은 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술의 최근 출현 자극 방출 소모 (호텔 위치), photoactivated 지역화 현미경 (팜)와 추계 광 재건 현미경 ( 폭풍), 가벼운 현미경6에서 하위 골 구조를 해결 하기 위해 가능 하 게. 그러나, 적어도 4 개의 단점이 크게는 Golgi의 세포 생물 학적 연구에 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 1) 현재 슈퍼 해상도 기법 대부분 세포 생물학 실험실 넘어는 비싸고 특별 한 하드웨어 구성이 필요 합니다. 2) 특별 한 형광 라벨 프로토콜 슈퍼 해상도 기법 필요 합니다. 최고의 조건 하에서 이러한 기술을 공간 해상도에 20-110 nm 주장, 3) 하지만, 실제 샘플에서 얻은 실용적인 해상도 훨씬 더 수 있습니다. 4) 비교에 전통적인 현미경 검사 법, 이러한 슈퍼 해상도 기법 여전히 어려움에서 다 색, 3D 또는 라이브 셀 이미징, 단독으로 또는 조합에서. 아마 가장 중요 한 것은, 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 및 면역-골드 그들 항복 질적 양적 지역화 데이터 대신.
부분적으로 위에서 언급 한 문제를 해결 하려고, 우리는 최근 개발 센터의 질량 (GLIM), 체계적이 고 양적 지역화는 골을 이미징 하 여 골 단백질 지 방화 라는 기반으로 하는 기존의 가벼운 현미경 검사 법 방법 면역-골드 엠7의 동일한 해상도에서 단백질. 이 방법에서는, 경작된 한 포유류 세포에서 골은 골 지 미니-스택으로 nocodazole, microtubule depolymerizing 약물의 치료에 의해 분산 됩니다. 광범위 한 학문은 nocodazole 유도 골 미니-스택 (이 골 지 미니-스택)에 유사한 조직에 세포 기능8,,910, 기본 골 더미는 설명 했다 11. 테스트 단백질의 지역화 지 수 (LQ) GLIM 통해 취득 될 수 있다 그리고 그것은 양적 하위-Golgi 지역화를 나타냅니다. LQs의 숫자 값을 비교할 수 있습니다 하 고 25 개 이상의 골 마커의 LQ 데이터베이스 사용할 수 있다.
GLIM, 골 지 미니-스택 트리플 생 또는 것 표현 GM130, 갈 트 mCherry 및 테스트 단백질 (x)에 의해 표시 된 있습니다. GM130와 갈 트-mCherry, cis-및 트랜스-Golgi 마커 각각12,13, 제공 참조 포인트. 트리플 형광, 빨강 (R), 녹색 (G), 빨강 (B), 인위적으로 각각 빨강, 녹색 및 파랑으로 표시 됩니다. 형광 질량 (이 하 센터)의 센터 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위하여 채택 된다. 골 축 GalT mCherry의 GM130의 센터에서 벡터로 정의 됩니다. 골 지 미니 스택 Golgi 축을 무한 회전 대칭 구조를 원통형으로 모델링 됩니다. 따라서, 골 지 미니 스택 골 축 1 차원 구조 더 모델링 될 수 있습니다. LQ 테스트 단백질의 x dx/d1, 있는 dx GM130의 x의 중심 으로부터 거리 d1 은 GM130의 갈 트 mCherry의 센터에서 거리로 정의 됩니다. X의 중심 축에서 인 경우에, 그것의 프로젝션 축 거리 계산을 위해 사용 됩니다. 골 축, 축 각도, dx, d1, 각도 α와 각도 β를 포함 하 여 GLIM에 대 한 변수는 그림 1에서 개요로 설명 된다. LQ는 Golgi 미니-스택 방향 셀에 무작위로 비록 골 축 각도 무관 합니다.
골 지 미니-스택 휘도가 이미지에 나타납니다. 우리는 GLIM에 대 한 analyzable 골 미니-스택 선택 하 세 기준 개발. 골 지 미니 스택 백그라운드의 표준 편차 (SD)의 총 강도의 비율 ≥ 30 각 채널에는, 1)는 신호 대 잡음 비율 기준. 이 표준은 골 미니-스택의 신호 대 잡음 비율에 달려 있는 질량의 중심의 위치 정확도 지키기 위하여 이다. 2) 축 각도 또는 거리 기준을는 d1≥ 70 nm. d1 골 축 각도의 증가 함께 감소합니다. 때 축 각도 90 °에 도달 또는 수직, 미니 스택 d1 으로 확인할 수 없는 0에 접근 하는. d1≥ 70 nm 세로 골 지 미니-스택 근처 효과적으로 제외할 수 있습니다. 어느 하나에서 3) co 선형성 기준 | α 탄 | 또는 | β 탄 | ≤ 0.3입니다. 이 기준 미니 스택 세 센터는 골 지 미니 스택 1 차원 모델에 대 한 공동 선형 충분히 보장 합니다. 모든 가벼운 현미경 빨강, 녹색 및 빨강 형광 센터의 상대적 위치를 왜곡 심각 하 게 수 있는 색수차에서 고통. 색수차 현미경 시스템의 실험적으로 110 nm 구슬, 트리플-이라고 표시 된 빨간색, 녹색 및 빨강 형광을 이미징 하 여 보정 됩니다. 각 구슬 이미지에 대 한 레드의 중심은 구슬의 진정한 위치도 정의 하며 반음계 녹색과 빨강 센터의 교대 있습니다 1 차 다항식 함수. 골 지 미니-스택 센터 녹색 및 빨강 채널의 색채 변화를 해결 하기 위해 다항식 함수를 받게 됩니다.
GLIM 통해 우리의 해상도 얻을 수 있습니다 ~ 30 nm 표준 조건 하에서 골 축. 중요 한 것은, 양적 어떤 골 단백질 지도 하는 체계적인 방법을 제공 합니다. GLIM는 넓은 필드와 같은 기존의 현미경 또는 confocal 현미경, 일반적인 형광 라벨 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이미징 및 데이터 처리는 짧은 한 시간 걸릴 수 있습니다. GLIM를 통해 우리는 직접 증명 분 비 화물의 진보적인 전환에서 cis- 트랜스-7골 측면.

<table><tbody><tr><td>fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope</td></tr><tr><td>Glass coverslip &amp;Phi; 12 mm (No. 1.5)</td><td>Menzel</td><td>CB00120RAC</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip &amp;Phi; 25 mm (No. 1.5)</td><td>Menzel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Capricon</td><td>DMEM-HPA-P50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Merck</td><td>487928</td><td></td></tr><tr><td>transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>transfection medium. Commercial name: OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TPST1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>66617</td><td>A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)</td></tr><tr><td>GalT-mCherry</td><td></td><td></td><td>Made in our lab</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488</td><td>CALBIOCHEM</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610823</td><td>Primary antibody for human GM130</td></tr><tr><td>far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Far red fluorescence conjugated secondary antibody</td></tr></tbody></table>

quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass

Cis를 포함 하 여 하위 골 지역으로 더 분류 될 수 있다 직렬 스택된 막 cisternae 골 복잡 한 구성-골, 중간-골, 트랜스-골 및 트랜스-Golgi 네트워크. 골 세포 기능 그것의 거주 단백질의 특성 분포에 의해 결정 됩니다. 기존의 가벼운 현미경의 공간 해상도 하위 골 구조 또는 cisternae 해결 하려면 너무 낮습니다. 따라서, 면역-골드 전자 현미경 지역화 하위 골 수준에서 단백질을 선택 하는 방법 이다. 그러나, 기술과 악기는 대부분 세포 생물학 실험실의 기능을 넘어. 여기 이미징 센터의 질량 (GLIM) 체계적이 고 양적 Golgi 단백질을 지역화 하 여 골 단백질 지 방화 라는 우리의 최근에 개발한 슈퍼 해상도 방법을 설명 합니다. GLIM 표준 형광 라벨 프로토콜 및 일반적인 넓은 필드 또는 confocal 현미경을 기반으로 합니다. 그것은 현미경 시스템, 이미지 수집 및 사후 수집 분석의 시프트 반음계 수 차 보정을 포함 한다. 테스트의 하위 Golgi 지역화 지역화 몫으로 양적 표현 된다. GLIM;의 4 개 주요 이점이 있다 그것은 급속 한, 전통적인 방법과 도구에 따라, 지역화 결과 양적, 그리고 요 극 ~ 골 축 30 nm 실용적인 해상도. 여기는 지역화 테스트 Golgi 단백질 GLIM의 상세한 프로토콜에 설명 합니다.

우리 실험실에서 사용 하는 것과 같은 계획 apochromatic 렌즈를 갖춘 현대 연구 급료 가벼운 현미경 최소한의 색수차 (그림 2A)를 보여줍니다. 그러나, 다 색 형광 구슬 이미지의 주의 깊은 검사는 같은 구슬 (그림 2B)의 다른 컬러 이미지의 변화를 알아낼 수 있습니다. 빨강 채널 색수차의 무료 이며 따라서 빨간색 형광의 센터는 구슬의 진정한 위치를 정의 합니다. 녹색과 빨강 형광의 상대 반음계 교대 붉은 형광 (그림 2C)의 중심에서 발생 하는 녹색 및 파랑 벡터에 의해 나타낼 수 있습니다. 이미징-비행기 내에서 반음계 시프트 경험적으로 각 구슬 (그림 2D)에 대 한 녹색 및 파랑 벡터 그림입니다. 우리의 현미경에 대 한 색채 변화 균일 하지 않습니다 크기와 x에 따라 교대 변경의 방향 및 y 위치. 반음계 시프트 크게 영향을 미칠 수 GLIM의 정확도 빨강 센터의 변화 수로 50 nm. 따라서 색채 변화를 수정 해야 합니다. 구슬의 센터는 획득 되 면 우리 처음 주문 다항식 피팅 보정 후 센터의 색채 변화를 해결 하기 위해 사용 합니다. 이 방법은 (그림 2 D-G) 시프트 반음계 수 차 크게 향상 됩니다.
포유류 세포에서 골 복잡 한은 일반적으로 기존의 광학 현미경 (그림 3A) 확인할 perinuclear 지역에서 집계 됩니다. Nocodazole 치료 후 3 시간 동안, perinuclear 골 복잡 사라진다 고 수십 골 미니-스택 (그림 3B) 세포질 걸쳐 바인딩과 그물 출구 사이트에서 조립. 골 막과 집계 골 미니-스택의 큰 덩어리는 존재 하 고 그들은 분석을 위해 선택 하지 않은. 골 지 미니-스택 선택 설명 예제 이미지는 그림 3C에 표시 됩니다. "매크로-Golgi ROI 검사" 도구, 40 선택한 골 지 미니 스택 그림 3D에 나열 사용 하. 세 가지 조건, 적용 한 후 21 골 미니-스택 되었고 analyzable LQs의 TPST1-EGFP 계산에 대 한 선택 (그림 3D; "L"로 표시), 그림 3E그들의 통계로. 총에서 111 analyzable 골 미니-스택 12 셀에서 선정 되었다과 TPST1 EGFP의 LQ는 0.76 0.04 측정 (평균 ± SEM; n = 111) (그림 3F). TPST1 EGFP의 LQ giantin 사이 그것의 위치 (LQ = 0.59) 및 EGFP Rab6 (LQ = 1.04)7. 그것은 GS15 근처 (LQ = 0.83) 및 ST6GalT1 AcGFP1 (LQ = 0.82). LQs에 따라 하위 Golgi 지역 문학에서 질적 현지화 데이터를 고려 하 여 정의: 당신은/ERGIC <-0.25; cis, 0.00 ± 0.25; 중간, 0.50 ± 0.25; 트랜스-골, 1.00 ± 0.25 및 TGN, 1.25-2.00. TPST1 EGFP의 LQ는 그러므로 그것의 트랜스를 나타냅니다-14이전 연구는 Golgi 지역화.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig1.jpg"> 그림 1 . GLIM의 계산에 사용 되는 변수를 보여주는 도식 일러스트. (A) xz 보기 GM130, 갈 트 mCherry 및 단백질의 동축 센터가 골 미니 스택의 보여주는 골 축, 축 각도, dx d1형광 x. 골 지 미니 스택의 이미지 이미지 평면에의 투영 이다. 꺼짐-축 축 각도 α, 각도 β 및 프로젝션 보여주는 x 단백질의 센터와 골 지 미니 스택 (B) xy 보기 dx거리. A 와 B 각각 그림 1E 와 우리의 이전 간행물7 그림 1F 에서 적응 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55996/55996fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig2.jpg"> 그림 2 . 반음계 교대의 수정. (A)는 넓은 필드 현미경에 의해 인수 110 nm 다 색 구슬의 3 색 병합 된 이미지. 각 구슬 방출 녹색, 빨강, 및 빨강 (인공적으로 착 색 된 파랑으로) 형광. 눈금 막대, 10 µ m. (B) 확대 보기 눈에 띄는 색채 시프트와 병합 된 단일 구슬 이미지의. 스케일 바, 200 nm. (C) 회로도 녹색 및 빨강 구슬 이미지의 교대도 나타낼 수 있습니다 벡터 빨간 구슬 이미지 (0, 0)의 중심에서 녹색 (녹색 벡터)와 빨강 (블루 벡터) 구슬 이미지의 중심을 각각 보여주는. (D, E) 반음계 시프트 교정의 효과입니다. 필드 내에 같은 이미지의, 녹색 및 파랑 벡터 전에 그려집니다 고 후 보정을 이동. 작은 변화를 시각화 하려면 각 벡터의 크기는 200-fold 증폭. (F, G) 시프트 보정 전후 녹색 (녹색 점), 빨강 (파란색 점) 구슬의 센터를 표시 하는 음모를 피해 라. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55996/55996fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig3.jpg"> 그림 3 . GLIM, 여기 TPST1 EGFP LQ 취득의 전형적인 예. 헬러 세포 TPST1-EGFP (녹색)와 갈 트-mCherry (레드) (블루) 생 GM130에 대 한 얼룩 했다. (A) A 일반 셀입니다. (B, C, D, E) Nocodazole 치료 셀은 몇 군데 (B). 이미지에서 analyzable 골 미니-스택 C와 같이 선정 되었다. 선택 된 골 지 미니-스택 식별 번호로 표시 되어 있습니다. 이러한 마스크 골 미니-스택 이미지 D 그들의 식별 번호 아래 표시 됩니다. "L" LQ (analyzable 골 미니 스택)의 계산에 대 한 골 지 미니 스택 올바른지를 나타냅니다. 셀에서 21 미니-스택 LQs의 히스토그램에 에서표시 됩니다. (F) 히스토그램의 LQs 111 미니-12 셀에서 스택. 히스토그램에 표시 된 값은 평균 ± SEM. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55996/55996fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 자료: 매크로-골 아 inspection.ijm, 매크로 출력 3 채널 data.ijm, Matlab 코드, My_train.exe, My_test.exe, 및 스프레드시트 template.opj.

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Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K 조회수.  Nanyang Technological University. 골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

생화학

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

신경과학

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

생물학

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

면역학 및 감염병학

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a super-resolution technique that allows for the determination of the microcompartments that are accessible for proteins by generating localization and tracking maps of these proteins. Moreover, by multi-color localization microscopy, the localization and tracking profiles of proteins in different subcompartments are obtained simultaneously. The technique is specific for live cells and is based on the repetitive imaging of single mobile membrane proteins. Proteins of interest are genetically fused with specific, so-called self-labeling tags. These tags are enzymes that react with a substrate in a covalent manner. Conjugated to these substrates are fluorescent dyes. Reaction of the enzyme-tagged proteins with the fluorescence labeled substrates results in labeled proteins. Here, Tetramethylrhodamine (TMR) and Silicon Rhodamine (SiR) are used as fluorescent dyes attached to the substrates of the enzymes. By using substrate concentrations in the pM to nM range, sub-stoichiometric labeling is achieved that results in distinct signals. These signals are localized with ~15&#8211;27 nm precision. The technique allows for multi-color imaging of single molecules, whereby the number of colors is limited by the available membrane-permeable dyes and the repertoire of self-labeling enzymes. We show the feasibility of the technique by determining the localization of the quality control enzyme (Pten)-induced kinase 1 (PINK1) in different mitochondrial compartments during its processing in relation to other membrane proteins. The test for true physical interactions between differently labeled single proteins by single molecule FRET or co-tracking is restricted, though, because the low labeling degrees decrease the probability for having two adjacent proteins labeled at the same time. While the technique is strong for imaging proteins in membrane compartments, in most cases it is not appropriate to determine the localization of highly mobile soluble proteins.

Here, we present a protocol for multi-color localization of single membrane proteins in organelles of live cells. To attach fluorophores, self-labeling proteins are used. Proteins, located in different membranes compartments of the same organelle, can be localized with a precision of ~18 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

세포 내 ATG9A 국소화 조사

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive pathological conditions. A set of proteins, called ATG proteins, comprise the core autophagy machinery and work together in a defined hierarchy. Studies in recent years have improved our knowledge of the autophagy pathway. Most recently, it has been proposed that ATG9A vesicles are at the heart of autophagy, as they control the rapid de novo synthesis of an organelle called the phagophore. The study of ATG9A has proven challenging, since ATG9A is a transmembrane protein, and it is present in different membrane compartments. As such, understanding its trafficking is an important element for understanding autophagy. Here, detailed methods are presented that can be used to study ATG9A and, in particular, its localization using immunofluorescence techniques, which can be assessed and quantified. The pitfalls of transient overexpression are also addressed. The correct characterization of ATG9A function and the standardization of techniques to analyze its trafficking are crucial to further characterize the events governing autophagy initiation.

저자 스포트라이트: ATG9A, a multi-spanning membrane protein 이미징  

This protocol describes various methods that can help in the study of ATG9A biology, including immunofluorescence followed by image analysis, transient overexpression considerations, and investigating the ATG9A glycosylation status using western blot.

ATG9A, Multi-Spanning Membrane 단백질 이미징

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...