Bu derlemede hem organel konumlandırma ve bileşimini incelemek için kullanılan görüntüleme ve biyokimyasal tekniklerin yanı sıra immünolojik sinaps oluşumu sırasında gözlenen sitoiskelet yeniden düzenlemeleri tartışacağız. Etkin yeniden şekillendirmenin ilk aşamaları, B hücrelerinin hücre yüzeylerini artırmalarına ve sinapsta toplanan antijen BCR komplekslerinin miktarını en üst düzeye çıkarmalarına olanak sağlar. Öte yandan, sinaptik membrandaki centrozomile birlikte, lizozomların lokal olarak işe alınması, immobilize antijenlerin çıkarılmasını kolaylaştırdığı bilinen lizom sekresyonu ile birleşebilir.
Alınan antijen, t yardımcı hücrelerine sunulmak üzere MHC sınıf II moleküllerine yüklenen peptidlere endoskopik kompartımama içinde daha fazla işlenir. Bu nedenle, bağışıklık sinaps ile ilişkili organel dinamikleri incelenmesi Nasıl B hücreleri tam olarak aktive olduğunu anlamak için çok önemlidir. İmmobilize antijenlerle aktive edilen B hücrelerinin immünororesansı farklı hücre bileşenlerini ve bağışıklık sinapslarına nasıl girebileceklerini takip etmemizi sağlar.
B hücreleri bir boncuk yüzeyinde veya kapak kayması yüzeyinde immobilize antijenler aracılığıyla aktive edilebilir. Antijen kaplı boncuklar amino grupları aktive etmek için daha önce glutaraldehit ile tedavi amino boncukile belirli ligandlar kuluçka tarafından hazırlanır. PBS ve girdap 100 mikrolitre aktif boncukresuspend.
Bu arada, 150 mikrolitre PBS'ye BCR ligand'ın mL başına 100 mikrogramını ekleyerek antijen çözeltisini hazırlayın. Sonra, antijen çözeltisine 50 mikrolitre aktif boncuk ekleyin ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Unutmayın, aynı zamanda negatif kontrol olarak ilgisiz bir ligand kullanın.
Kuluçkadan sonra boncukları PBS ile yıkayın. Supernatant aspire ve PBS ile değiştirin. Üç kez tekrarlayın.
Daha sonra, BSA bir çözeltisi 500 mikrolitre resuspended boncuklar tarafından üç amino grupları bloke. Son olarak, PBS 70 mikrolitre boncuk resuspend. Son konsantrasyonu hesaplamak için, boncukları saymak için hemositometre kullanabilirsiniz.
B hücre aktivasyonu için, 50 mL tüp kullanın ve CLICK%5 fetal sığır serumu ile desteklenen mL başına 1,5 milyon konsantrasyona hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre boncuk karışımının 100 mikrolitresine karşılık gelen 150,000 B hücreyi, farklı zaman noktaları için 37 derecede poli-L-lizin kaplı kapaklı bir reklam kuluçkaya yatırın. B hücrelerini aktive etmek için ikinci bir yaklaşım antijen kaplı kapakları üzerine tohumlama olduğunu.
Bu amaçla, anti-BCR ve B220 ile kat slaytlar hücre yapışmasını artırır. Antijen çözeltisini, pbs'a mL başına 10 mikrogram ve mL başına 0,5 mikrogram lık son konsantrasyona ekleyerek hazırlayın. Daha sonra, parafilm film kaplı 24 kuyu plaka bir kapak üzerinde coverslip ayarlayın ve antijen çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin.
Plakayı kapatın ve bir gecede 4 derecede kuluçkaya yatın. Coverslip aktivasyon başlatmak için, ilk PBS ile yıkayın ve birkaç dakika kurumasını bekleyin. Sonra, 150, 000 B hücreleri ekleyin ve farklı zaman noktaları için 37 derece kuluçka.
Her iki durumda da, boncuk veya antijen kaplı slaytlar ile etkinleştirirken, en uzun zaman noktası ile başlayan ve daha sonra kısa olanlara devam öneririz. Kuru kapak kaymasını mikroskop slaytına monte ettikten sonra, çözünürlük gereksinimlerine bağlı olarak numunelerinizi görüntülemek için bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanabilirsiniz. Aktarılan ışığı kullanarak numuneye odaklanın.
Hücrelerin ve boncukların tek bir oranda etkileşimiçinde olduğu alanları aramalısınız. Antijen kaplı kapaklarda aktive edilen B hücreleri için daha iyi çözünürlük için 100x hedefini kullanın. Parametreler için, tüm hücreyi kapsayan bir z yığını almayı düşünün.
Hücrenin alt ve üst sınırlarını sınırlamak için actin etiketleyebilirsiniz. Antijen kaplı boncuklarla aktive edilen ve bir noktaya hapsedilmiş organeller için etiketlenen B hücreleri için, ilk olarak iki alanın sınırlandırılması: hücre alanı ve boncuk alanı. Daha sonra, pozisyonu veya organeli bir nokta ile belirleyin ve yerelleştirme koordinatlarını elde edin.
İki vektör çizin: biri hücre merkezi ile organel arasında, diğeri de hücre merkezi ile boncuk merkezi arasında. Her ikisinin de uzunluğunu ölçün ve şimdi alfa olarak adlandırılan iki vektör arasındaki açıyı ölçün. Alfa Guassian kullanarak centrozsome ve hücre merkezi arasında vektör ile bir projeksiyon yapmak ve sonra yansıtılan vektör, a, b bölerek organel polarite indeksi hesaplamak.
Böylece sıfır ve bir arasında bir polarite indeksi polarize bir fenotip gösterir. Sıfır ve eksi arasındaki değerler polarize olmayan bir fenotipgösterir. Daha fazla dağılım organı için polarite indeksi belirlemek için, örneğin izozomlar gibi, daha önce bahsedilen algoritmayı kullanabilirsiniz, bu durumda, kitle merkezinin etiketlerin koordinatları için organel lokalizasyon koordinatlarını değiştirerek, lizozomlar.
Daha önce açıklanan analize benzer şekilde, sıfır ile bir arasındaki polarite indeksi polarize bir fenotip gösterirken, sıfır ile eksi arasındaki değerler polarize olmayan bir fenotipi gösterir. Yeni sinapsa yakın olarak alınan her organelin miktarını ölçmek için boncuktaki organel floresan yüzdesini hesaplayabilirsiniz. Bunun için, boncuk ve hücre alanı sınırlamak gerekir, ilgili floresan yoğunluğuölçmek ve daha sonra boncuk floresan toplamı ve hücre floresan bölün.
Yeni sinaps ile temas eden her organelin miktarını elde eyleyeceksiniz. Alternatif olarak, boncuk karşısında bir dikdörtgen çizin. Hücre uzunluğunun çeyreğine karşılık gelen bir ağırlık kullanın, ardından dikdörtgenin içindeki floresan yoğunluğunu ölçün ve toplam floresan ile bölün.
Bu algoritma her zaman yeni sinaps yakın organel yüzdesini elde etmek için, ancak mutlaka arayüzü ile doğrudan temas. Dinlenme ve aktive B hücrelerinde centrozom ilişkili bileşenleri ölçmek için. Kısaca, üç parametre belirleriz.
Hücre ve boncuk alanı ve merkezomal lokalizasyon koordinatları. Daha sonra, centrozom çevreleyen bir daire tanımlamak ve centrozom merkezinden radyal profil analizi çalıştırın, daha önce tanımlanmış. Çizimi aldıktan sonra, maksimum floresanların %70'inin korunabilen yarıçapı belirleyin.
Centrozom çevreleyen bir daire çizmek için bu yarıçapı kullanın. Son olarak, centrozsome alan ve hücre alanında ilgi bileşeni floresan yoğunluğu elde ve floresan yoğunluk oranı elde etmek için her iki değerleri bölmek. Bağışıklık sinaps arabiriminde organellerin dağılımını ölçmek için, öncelikle antijen kaplı kapak lı ile temas eden B hücrelerinin alanını belirleyin.
Bu alanı tanımlamanıza yardımcı olacak şekilde actin etiketleyebilirsiniz. Ardından, slaytla temas eden alanı, hücrenin yüksekliğini ve genişliğini ölçün. Antijen kaplı kapak kayma bakan alan B hücre aktivasyonu üzerine yayılan B hücre nin bir ölçüsüdür.
Hücredeki merkezi bir alanı sınırlamak için yükseklik ve genişlik değerlerini kullanın, bu alan sınırlardan yüksekliğin dörtte biri ve genişlik değerleriyle ayrılmıştır. Genellikle bunlar toplam hücre alanının yaklaşık üçte biri karşılık gelir. Son olarak, yeni sinaps merkezinde organel işe hesaplamak, tüm hücrenin floresan yoğunluğu ile merkezi alanda floresan yoğunluğu bölen.
Bu indeksin pozitif değerleri yeni sinaps merkezinde bir organel zenginleştirme gösterir. Aksine, negatif değerler çevresel dağılımı gösterir. Antijen kaplı kapaklarda aktive edilen B hücrelerinin z düzlemleri boyunca organellerin dağılımını ölçmek için önce sinaptik arabirimi ve hücrenin üst limitini sınırlandırın.
Ardından, hücre merkezine bir çizgi çizin ve xz görüntüsü elde etmek için görüntüyü yeniden dilimleyin. Hücrenin başını ölçün ve görüntüyü bağışıklık sinapsından hücrenin üst sınırına kadar aynı alanın 10 fraksiyonuna bölün. Her z-fraksiyonundaki floresan'ı ölçün ve her z-fraksiyonundaki floresan'ı hücrenin toplam floresanına bölerek floresan yüzdesini hesaplayın.
Son olarak, z-fraksiyonu başına floresan yoğunluğu yüzdesini çizin. Kesir bir ve iki sinaptik arabirimi temsil. İşte iş akışı veya centrosome izolasyon prosedürü.
Durum başına 20 milyon B hücresi kullanın. Sitokasin D ve Nocodazol içeren hücreleri centrozom kopmasını kolaylaştırmak için gerekli protokole göre ön tedavi edin. Daha sonra, hücreleri 5 mL TBS arabelleği içinde yeniden suyararak izleyin.
%8 sakaroz ile desteklenen 0.1x TBS tamponunun 1 mL'sini kullanarak tekrarlayın. 150 mikrolitre likis tamponu ile hücre peletini yeniden askıya alın. Sitosol ve organelleri çekirdekten ayırmak için 10, 000 g'de 4 santigrat derecede 10 dakika bekleyin.
Hücre supernatant'ı dikkatlice kurtarın ve 1,5 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. %60 sakaroz ile desteklenen 300 mikrolitre degrade tampon ile doldurun. Santrifüj örnekleri 10, 000 g'da 30 dakika 4 santigrat derecede.
Bu santrifüj adımı santrizomları yoğunlaştırmak için önemlidir. Santrifüjden sonra arayüze ulaşana kadar supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tüpte kalan numuneyi girdap.
0,45 mL 70%sakaroz, 0,27 mL %50 sakaroz ve daha sonra 0,27 mL%40 sakaroz degrade tamponunu boylayarak ultracentrifuge tüpte kesintisiz sakaroz gradyanı hazırlayın. Centrozomla zenginleştirilmiş numuneleri kesintili degradenin üzerine yerleştirin ve her numunenin ağırlığını ilgili adaptörlerde kalibre edin. Tüpleri 40, 000 g'da 4 santigrat derecede 1 saat, minimum hızlanma ile ve degradeyi tedirgin önlemek için mola vermeden santrifüj edin.
Santrifüjden sonra, eşit hacimde 12 kesir dikkatlice toplayın. Yükleme arabelleğiyle örneği yeniden askıya alın ve bir SDS-PAGE çalıştırın. Bağışıklık sinaps oluşumu sırasında B hücrelerinde organel dağılımını incelemek için farklı zaman noktaları için antijen kaplı boncuklarla aktive edilen 2A1.6 B hücreleri kullanıldı.
Kontrol olarak, B hücreleri alakasız BCR-ligand içeren boncuklarla aktive edildi. Daha sonra, immünoresans boyama kullanarak, immobilize antijenler ile aktivasyon üzerine lokalizasyonunu değiştirmek farklı organeller, tespit yok. Burada rab6a ile etiketlenmiş alfa-tubulin ve golgi aparatı ile etiketlenmiş centrozomları gösteriyoruz.
Grafikte, her noktanın bir hücreyi temsil ettiği her aktivasyon noktasında sentrozom ve golgi aparatı polarite verus için polarite indeksi gösteriyoruz. Aktivasyon sırasında, bu organellerin polarite indekslerinin 1'e yakın değerlere ulaştığını gözlemleyebiliriz, bu da lizozomlar gibi daha dağınık bir dağılım gösteren IS.Organeller'e işe alımlarında bir artış olduğunu düşündürmektedir, ayrıca polarite indeksi kullanılarak ölçülebilir. Liozomitpolarite indeksinin aktivasyon la daha olumlu değerlere ulaşacağını gözlemleyebiliriz, bu da İd'e işe alımdan kaynaklanan sonuçlar. Bağışıklık sinapsına doğru bir izozom alımını ölçmek için tamamlayıcı bir yaklaşım gösteriyoruz.
Antijen kaplı boncuklarla aynı aktivasyon protokolü kullanılarak İd'e lizom alımı, boncuk çevresinde veya sinaptik alan içinde tanımlanan bölgeye alınan lyozomların floresan etiketinin ölçülmesi yle hesaplanmıştır. Açık aktivasyonu gözlemleyebiliriz. Sinaps bölgesine birleşen lyzomlarda artış vardır.
Burada spesifik ve spesifik antijen kaplı boncuklarla aktive edilen B hücrelerinde sentrozomda aktin miktarını sunuyoruz. Aktin havuzu bir okla gösterilir. Bu durumda aktin gibi centrosome ilişkili bileşenlerin nicelleştirilmesi, her noktanın bir hücreyi temsil ettiği nokta çizimi ile temsil edilebilir.
Aktivasyondan sonra, B hücresi centrozom çevresindeki aktin miktarında azalır. Bu adım, sentrozonun perinükleer bölgeden ayrılması ve kutuplaşmasının yeni sinapsa ayrılması için önemlidir. Antijen kaplı yüzeyde aktive edilen B hücresi için, aktin remodeling yanı sıra sinaptik membran organellerin işe çalışabilirsiniz.
Burada sırasıyla merkezi ve periferik dağılım gösteren golgi aparatı ve endoplazmik retikulum gibi organellerin analizini gösteriyoruz. Ayrıca, farklı aktivasyon noktalarından sonra B hücrelerinin yayılma alanını hesaplayabiliriz. Bu amaçla, XY düzlemindeki hücre limitini tanımlayabilmek için actin etiketliyiz.
Grafikte, etkinleştirme 30 ve 60 dakika sonra hücre alanında artış gözlemleyebilirsiniz. Bir organelin dağılımı XZ düzleminde sinaptik arayüze göre de hesaplanabilir. Grafik, ilk iki düzlemin sinaptik arabirime karşılık geldiği z düzleminde aktin dağılımını temsil eder.
Aktivasyon üzerine aktivasyonun bu alanda zenginleştiğini gözlemleyebiliriz. Görüntüleme analizine ek olarak, biyokimyasal yaklaşım da B hücre aktivasyonu üzerine centrozom bileşimindeki değişimi incelemek için kullanılabilir. Burada bej dikdörtgen tarafından vurgulanan centrosome içeren fraksiyonu temsili bir Batı leke göstermektedir.
Centrozsome fraksiyonları bir kesintili sakaroz gradyan izole edildi ve gama-tubulin tesviye tarafından tespit edildi. Aşağıdaki Western blot aktivasyon üzerine tükenmiş hale b hücrelerinin dinlenme gelen centrozsome fraksiyonları actin ve Arp2 gösterir. B lenfositler fonksiyonel bir immün sinaps oluşturmak için membran arabiriminde dinamik değişikliklere uğrarlar.
Bu süreç, bu videoda açıklanan görüntüleme ve biyokimyasal teknikler ile incelenebilir. Bu analizin, B hücrelerinin nasıl etkin bir şekilde aktive edilebileceğine dair moleküler mekanizmalar hakkında değer bilgisi sağlayabileceğine inanıyoruz.
