Bu proje, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü PG # 20R47867 tarafından desteklenmiştir.

1. Astrositlerdeki Bağıl Hücre-Yüzey Protein Ekspresyonunun Biyotinleme ile Saptanması NOT: Burada, bu biyotinleme tekniğinin hücre geçirgen matris molekülünün laminin&#39;in su geçirgen kanal aquaporin-4&#39;ün (AQP4) hücre yüzeyi lokalizasyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine uygulanışını göstermektedir. Bu deney için gereken uzmanlık gerektiren materyaller arasında sülfo-NHS-LC-biyotin ve streptavidin-agaroz reçinesi bulunur (bkz . Malzeme Tablosu ). <ol><li> Noel ve ark. 12 , tahlilden yaklaşık 2 hafta önce kortikal astrositler kültürleri hazırlayın ve bunları 75 cm2 havaleli kültür şişeleri içinde büyütün. Astrositler% 80-90 konfluent olduklarında kültür yüzeyinden% 0,05 tripsin kullanarak ayırın ve sonra 1: 3&#39;ü geçirin. </li><li> Deneyden 48 saat önce, hücreler tekrar% 80-90 oranında birleştiğinde, geçiş astrositleri 1: 3&#39;ü (cKültür formatında hange) 60 mm hücre kültürü yemekleri üzerine yerleştirin, böylece deneyin gerçekleştiği gün% 70&#39;e yakın konfluent olurlar. Hücrelerin bulaşıklar arasında eşit olarak dağıldığından emin olun. </li><li> Testten 16 saat önce, 24 nM&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar kültür ortamına pipetleyin ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Analizden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin veya soğutun: CM-PBS (1X PBS, pH 7.4 içinde 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve 100 mg / L CaCl2), biotin tamponu (0.5 Yıkama tamponu (CM-PBS&#39;de 50 mM NH4CI), liziz tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCl ve 5 mM) içeren süspanse edildi. EDTA,% 1 triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol, 300 mM DTT ve% 0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu Tris (pH 7.4), 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 1 Triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli). </li><li> remAstrosit kültürlerini kuluçka makinesinden tutan yemekler ve ortamı atın. </li><li> Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile yıkayın ve bulaşıkların üzerine ezilmiş buz koyun. </li><li> Her oyuğa 2 mL biyotin tamponu pipetleyin ve tam kapsama sağlamak için yemekleri birkaç kez öne arkaya doğru yatırın. 30 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Bir aspiratör kullanarak biyotin tamponunu çıkarın ve 4 mL söndürme tamponu ile değiştirin. 10 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Söndürme tamponunu aspire edin ve eşdeğer hacim ile değiştirin. Yine buzda 10 dakika bekletin. </li><li> Söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş CM-PBS&#39;ye kazın ve süspansiyonu mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> 3 dakika süreyle 100 xg&#39;de santrifüj ederek pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve hücreleri 500 μL liziz tamponu içinde yeniden süspanse edin. </li><li> Örnekleri buzda 30 dakika bırakın, her 5 dakikada bir vorteksleyin veya plOnları uç uca rotatorda 4 ° C&#39;de sürün. </li><li> Herhangi bir deterjana uygun olmayan maddeleri pelet haline getirmek için lizat 14000 xg&#39;de 10 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. <ol><li> Bu lizatın 50 μL&#39;ini kurtarın ve içine yükleme tamponu ekleyin. Sonra kuru bir banyoda 95 ° C&#39;de ısıtarak denatürasyon yapın; Bu, hem biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinlerini hem de biyotinleştirilmemiş sitozolik proteinleri içeren &quot;girdi&quot; fraksiyonudur. </li></ol></li><li> Keskin bir makas kullanarak yaklaşık 0.5 cm malzeme keserek bir pipet ucunun açılmasını genişletin. Bu pipet ucu kullanarak, 75 μL streptavidin-agaroz boncuklar (normalde 4 ° C&#39;de saklanır) lizata aktarın ve 4 ° C&#39;de çalkalayıcı / rocker üzerinde inkübe edin. <ol><li> Streptavidin-agaroz sıklıkla hacim olarak% 50 boncuk içeren bir bulamaç olarak satılmakta, antimikrobiyal bir solüsyon içine asılmaktadır, boncuklarınEşit şekilde süspansiyon haline getirilir ve daha sonra her bir numuneye süspansiyonun 150 uL&#39;si pipetle alınır. </li></ol></li><li> Pelet streptavidin-agaroz boncuklar, 1500 xg&#39;de 30oC&#39;de 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek toplanır. <ol><li> Süpernatanın 50 μL&#39;ini saklayın (yükleme tamponu ekleyin ve 95 ° C&#39;de bir su banyosu veya ısıtma bloğunda denatürasyon yapın); Bu, &quot;hücre içi&quot; fraksiyonu temsil eder ve esasen biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerden oluşur. </li></ol></li><li> 1 mL yıkama tamponunda topak haline getirilmiş boncukları tekrar süspanse edin ve 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca sallayın. Pellet boncukları (1.16&#39;da olduğu gibi) ve süpernatanı atın. Nonbiotinli sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın. </li><li> Boncukları santrifüjle peletleyin (0 ° C&#39;de 1500 xg, 4 ° C&#39;de) ve üstteki yıkama tamponunu atın. 50 μL 1X yükleme tamponu (liziz tamponu ile seyreltilmiş) ilave edin. 95 ° C&#39;de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin serbest bırakın; Bu fraksiyon shoUld sadece biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinleri içerir (&quot;hücre yüzeyi&quot; fraksiyonu). <ol><li> Giriş, hücre yüzeyi ve hücre içi fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve western blot ile analiz edin 14 . NOT: Denemelerimizde% 4-20 prekast gradyen jel kullanırken,% 4&#39;lük istif tabakası (her biri% 0.1 SDS içeren) ile% 12-14&#39;lük ayırıcı jel, bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterlidir. Uygun boyut aralığının bir molekül ağırlığı standardı da kullanılmalıdır. Biyotinlenmiş proteinlerin görünür molekül kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir hızlanma olabileceğini unutmayın. </li></ol></li></ol> 2. Astrositlerdeki Hücre-Yüzey Proteinlerinin Biyotinleme ile İnsülasyon Hızının Belirlenmesi NOT: Aşağıda, bu durumda astrositlerdeki AQP4 endositozunu izlemek için kullanılan tipik bir pulse-chase biyotinilasyon deneyini açıkladık. BuYöntemi, Madrid ve ark. Tarafından kullanılana dayanmaktadır . 15 . İhtiyaç duyulan özel malzemeler arasında sülfo-NHS-SS-biyotin, streptavidin-agaroz reçinesi, indirgenmiş glutatyon ve iyodoasetamid yer alır ( Malzeme Tablosuna bakınız). <ol><li> Bir önceki bölümde özetlenen yöntemleri kullanarak fare kortikal astrosit kültürleri 60 mm yemekler halinde hazırlayın. Hücrelerin, analiz gününde yaklaşık% 70 konfluent olduğundan ve her tablanın eşdeğer sayıda hücre içerdiğinden emin olun. </li><li> Analizden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin veya buzdolabında saklayın: CM-PBS (1X PBS, pH 7.4&#39;de 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve 100 mg / L CaCl2), biotin tamponu (0.5 (50 mM indirgenmiş glutatyon, 75 mM NaCl ve 75 mM NaOH), söndürme tamponu (50 mM iyodoasetamid,% 1 BSA, CM-PBS içinde) içeren, CM-PBS içinde% 1 mg / mL sülfo-NHS-SS-biyotin) Lizis tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCI ve 5 mM EDTA,% 1 triton X-100,1X protaz inhibitörü kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol, 300 mM DTT ve% 0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu (10 mM Tris, pH 7.4, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl,% 1 triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli). </li><li> Taze hücre kültürü ortamı (% 10 Fetal Bbovine Serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş DMEM) hazırlayın ve 37 ° C su banyosu içine yerleştirin. </li><li> Astrosit kültürleri inkübatörden çıkarın ve bir aspiratör kullanarak ortamı aspire edin. </li><li> Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile yıkayın ve bulaşıkların üzerine ezilmiş buz koyun. </li><li> Her yemeğe 3 mL biyotin tamponu pipetleyin, tamponun iyi dağıldığından emin olmak için yemekleri birkaç kez ileri geri eğin ve 30 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Biyotin tamponunu aspire edin ve 5 mL sıcak ortamla değiştirin. Bir kültür çanağını 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin ve 30 dakika süreyle aynı sıcaklıktaki ikinci bir çanağı inkübe edin. 4&#39;te bir tabak daha bırak6; C 0 dak. </li><li> Kuluçka döneminin sonunda, orta atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Pipet 6 mL, hücreler üzerinde tamponu azaltır ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. </li><li> İndirgeyici tamponu çıkarın ve 6 mL taze azaltıcı tamponla değiştirin. 15 dakika daha buzda bırakın. </li><li> İndirgeyen çözeltiyi çıkarın ve 6 mL söndürme tamponuyla değiştirin. 15 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Söndürme adımını bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Söndürme tamponu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş PBS&#39;ye kazın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> 3 dakika süreyle 100 xg&#39;de santrifüj ederek pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve hücreleri 500 uL liziz tamponuna tekrar süspanse edin. </li><li> Buz üzerinde 30 dakika bırakın ve her 5 dakikada bir girdap yapın. Alternatif olarak, numuneleri bu süre boyunca 4 ° C&#39;de uçtan uca bir rotasyona yerleştirin. </li><li> Ly&#39;yi santrifüjleyinDeterjana uygun olmayan maddeleri peletlemek için 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 14.000 xg&#39;de sedye haline getirin, sonra süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu lizatın 50 μL&#39;ini kurtarın, üzerine yükleme tamponu ekleyin ve kuru bir banyoda 95 ° C&#39;de denatürasyon yapın; Bu, hem biyotinlenmiş endositlenmiş proteinleri hem de biyotinleştirilmemiş proteinleri içeren &quot;girdi&quot; fraksiyonudur. </li><li> Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, lizata streptavidin-agaroz bulamacından 150 mcL ekleyin ve çalkalayıcı / rocker üzerinde 3 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Bu adım hakkında ek ayrıntılar için 1.15&#39;e bakın. </li><li> Pelet streptavidin-agaroz boncuklar 1,500 xg&#39;de 4 ° C&#39;de 30 saniye süreyle santrifüje edilerek toplanır. </li><li> Boncukları 1 mL yıkama tamponuna tekrar süspansiyon haline getirin ve 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de sallayın. Pellet boncukları (adım 2.18&#39;e göre) ve süpernatanı atın. Nonbiotinli sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın. </li><li> Topak boncuklar, 30 ° C&#39;de 1,500 xg&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüjlenerek ve ove&#39;yi atınYanan yıkama tamponu. 50 μL 1X yükleme tamponu (liziz tamponu ile seyreltilmiş) ilave edin. 95 ° C&#39;de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin serbest bırakın; Bu fraksiyon sadece içselleştirilmiş hücre yüzeyi proteinleri içermelidir (&quot;endositoz&quot; fraksiyonu). </li><li> Giriş, hücre yüzeyi ve bağlanmamış fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve batı lekelemesi ile analiz yapın 14 . NOT: Denemelerimizde% 4-20 prekast gradyen jel kullanırken,% 4&#39;lük istif tabakası (her biri% 0.1 SDS içeren) ile% 12-14&#39;lük ayırıcı jel, bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterlidir. Uygun boyut aralığının bir molekül ağırlığı standardı da kullanılmalıdır. Biyotinlenmiş proteinlerin görünür molekül kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir hızlanma olabileceğini unutmayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Değişiklikler: Bu yöntemler yapışık hücrelerle birlikte kullanılmak üzere tasarlandığından, 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve Yıkama basamakları için ve hücrelerin kültür yüzeyine yapışmış olmasını ve hücre-hücresi bağlantılarının bozulmamasını sağlamak için belirli tamponların tabanı olarak, 100 mg / L CaCI2 (CM-PBS). Bununla birlikte, protokoller, hücreler prosedürünün her bir adımı arasında pelet yapılıyorsa, yapışkan olmayan hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu gibi durumlarda, CM-PBS PBS ile değiştirilebilir. Ayrıca, burada belirtilen koşulların her biri bu protokole özgü olduğunu ve yöntemlerin diğer uygulamalar için kullanılması durumunda sadece kaba kılavuz olarak düşünülmesi gerektiğini unutmamak gerekir. Özellikle, deterjan özütleme prosedürünün kendisi için uygun olduğunu bağımsız olarak doğrulamalıdırR hücre tipinde olduğu ve santrifüj ayarlarının hücre türüne ve streptavidin-agaroz boncuklarının kullanılması için uygun olduğunu açıkladı. Son olarak, spesifik olmayan bağlanma ve / veya aşırı geçmiş hakkında endişeler varsa, şu anda piyasada bulunan çeşitli avidin formlarıyla streptavidin yerini alabilir. Örneğin, glikosilatlanmış avidin, lektinlere ve DNA gibi negatif yüklü moleküllere karşı belirgin olarak düşük afiniteye sahiptir. Sorun giderme ve kontroller: Bu raporda incelenen prosedürler oldukça basit olmasına rağmen, deneyin sonucunu potansiyel olarak etkileyebilecek bir takım kritik konulara dikkat etmeliyiz. Öncelikle, her iki deney de sülfatlı biyotinleme reaktiflerinin membrana sızdırmaz nitelikte olmasına rağmen, bazı koşullar hücrelerin plazma membranının bozulmasına ve dolayısıyla bazı hücreiçi proteinininIns biyotinile edilmiştir. Bu olasılığı kontrol etmek için, biyotinlenmiş fraksiyonların plazma zarında ifade edilmeyen, β-aktin gibi hedefler için araştırılması önerilmektedir. Biotinleme reaktifleri için uygun saklama koşullarına (tipik olarak 4 veya -20 ° C, bazı kuruma şekli ile) dikkat etmeniz gerekir, aksi takdirde yüksek duyarlılıkları nedeniyle bunlar başarısız olabilir. Bununla birlikte, biyotinilasyonun gerçekten gerçekleştiğini ve biyotinlenmiş proteinlerin etkin bir şekilde çökeltildiğini (ki bu da bir sinyalin yokluğundan anlaşılacağı üzere) girişi, biyotinlenmiş ve biyotinleştirilmemiş fraksiyonları streptavidin-HRP ile saptamak iyi bir uygulamadır Biyotin olmayan kısım). Bunu yapmak, hatalı reaktiflerin imkânsız olmasını sağlamalıdır. Disülfid bağ indirgenmesi, endositik biyotinilasyon prosedürünün önemli bir adımıdır;Sadece içe uyarlanmış proteinlerin biyotinlenmiş fraksiyonda izole edileceğini belirtti. İndirgeyici reaktifin atlandığı kontrollerin birleştirilmesi ( Şekil 1 C ), tedavinin etkinliğini gösteren bir izlenim bırakır.

Hücrenin yüzeyindeki proteinler, hücre işlevini sürdürmek için merkezi rol oynarlar. Birçok durumda, bunların aktiviteleri, onları geçici olarak hücre içi bölgede tutan ya da bozunma yolları 1 , 2 , 3 , 4 , 5&#39;e yönlendiren endositik süreçlere bağlıdır veya modüle edilir. Burada, kullanıcıya, plazma zarında eksprese edilen proteinleri ve yeni içselleştirilen proteinleri özel olarak etiketlemek ve izole etmek için tasarlanmış 2 biyotinilasyon temelli yaklaşımları vurguluyoruz. Bu yöntemlerle, ilgili herhangi bir proteinin hücre yüzeyi ekspresyonu ve endositik oranı nicelleştirilebilir, böylece düzenlenmesinin daha net bir şekilde değerlendirilmesi mümkün olur. Bağıl hücre yüzeyi protein ekspresyonunun biyotinleme ile belirlenmesi Eskiden H6 vitamini olarak bilinen biyotin veya vitamin B7, biyolojik moleküllerin reaktif amin, sülfhidril ve karboksil gruplarını kimyasal olarak değiştirmek için kullanılabilen küçük bir suda çözünür moleküldür. Şu anki hücre yüzey biyotinilasyon reaktiflerinin mahsulü, esas itibariyle, eksprese edilen proteinlerin lisin tortularının yan zincirlerinde bulunan aminlerle reaksiyona girmek üzere tasarlanmış biyotinin veya türevlerinin membran geçirmeyen sülfonatlanmış N-hidroksisuksinimid (sülfo-NHS) esterlerini içerir. Bunlar, bazik koşullar altında protonsuz hale geldiğinde, hücre yüzeyi, ikinci durumda, biyotin kısmı 7 ile bir amid bağı oluştururlar. Böylece, modifiye edilmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra yaklaşık olarak 10-15&#39;lik bir ayrışma sabitiyle biyoinine bağlanan 66-69 kDa tetramerik bir protein olan avidin&#39;i kullanarak izole edilerek Bilinen en güçlü kovalent olmayan etkileşimler </suP&gt; , 9 . Önceki çalışmalarda, hücre yüzeyinde protein ekspresyonunu nicelendiren bir dizi alternatif yöntem kullanılmıştır. Örneğin, ilgi konusu protein için spesifik olan floresan etiketli antikorları, ardından flüoresan mikroskopisi ile görselleştirmeyi kullanarak, geçirimsiz hale getirilmiş hücrelerin etiketlenmesi yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmakla birlikte, hücre dışı epitoplara bağlanabilen antikorların bulunabilirliğine büyük ölçüde bağımlıdır. Daha yakın zamanlarda, asidik ortamlara maruz bırakılmaya tepkiyen pH duyarlı florofor taşıyan kimerik proteinlerin kullanılmasını içeren yöntemler de başarılı bir şekilde kullanıldı. Bununla birlikte, bu tür tahliller, genellikle, bu yapıların, ilgi proteininin doğal olarak bulunmadığı hücre çizgilerinde eksojen ifadesini içerir. Bu yaklaşımlar yine de, subselüler lokalizasyon ve ekzositik güzergah ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilmektedirHedef protein içerir ve bu nedenle burada açıklanan biyotinilasyon temelli yaklaşımlarla bağlantılı olarak kullanılmalıdır. Tipik bir biyotinilasyon tahlilinde hücreler ilk olarak 4 ° C PBS&#39;de iyice yıkanır. Bu, kültür ortamı tarafından eklenen serum proteinlerinin izlerini kaldırır ve böylece bir sonraki aşamada bu miktarların fazla miktarda biyotini tüketmesini önler. Daha da önemlisi, sıcaklıktaki düşüş, endositozun önemli ölçüde yavaşlamasına neden olur. Daha sonra biyotinleme reaktifi eklenir. Daha sonra, hücreler yeniden yıkanır ve daha sonra geri kalan tüm biyotin izlerini inaktive etmek amacı olan ya glisin ya da NH4Cl içeren bir söndürme tamponu ile inkübe edilir. Daha sonra hücreler ayrıştırılır ve ardından biyotinlenmiş proteinlerin çökeltilmesi için agaroz-hareketsiz streptavidin ilave edilir. Analiz, yaygın olarak çeşitli prin bağıl hücre yüzeyi ekspresyonuna izin vererek, western blotting yoluyla gerçekleştirilirSayısallaştırılacak oteinler. Bu tahlilin temeli nedeniyle, sadece hücre dışı çevreye maruz kalan kısımlara sahip olan proteinler ile kullanım için uygundur. Muhtemelen döngü bölgelerinde bir takım reaktif lizinlere sahip olan çok katlı transmembran proteinleri, bu yöntem için en uygun yöntemdir; tek geçişli proteinler ise biyotinilasyona daha az duyarlı olma eğilimindedir. Bu durumlarda dahi, yapısal değişiklikler veya moleküller arası etkileşimlerin belirli reaktif bölgeleri tıkayarak beklenenden düşük bir biyotinilasyon verimi oluşturması olasılığı söz konusudur. Biyotinleme ile hücre yüzey proteinlerinin içselleştirme oranının belirlenmesi Bu tahlilin prensipleri, bir takım istisna dışında, hücre yüzeyinde biyotinilasyon ile büyük oranda benzerdir; bunların en önemlisi, tersinir biyotinilasyon reaktiflerinin kullanılmasıdır. Biyotin grupları (bunların) disuYapılarında, indirgeyici ajanlara duyarlı bağlar bağlanır; Bu, tahlil süresi boyunca hücre içi sitelere alınan sadece hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinile bırakılmasını sağlamak için kullanılır. Bir analiz genel olarak aşağıdaki şekilde gerçekleşir. Hücreler önce yıkanır ve soğuk reaktiflerle biyotinlenir, daha sonra 37 ° C&#39;de hücre kültürü ortamı yeniden verilir ve hücreler kuluçka makinesine geri gönderilir; Bu etiketli hücre yüzeyi proteinlerinin endositozuna uğramasına neden olur. Zara nüfuz etmeyen indirgeyici madde glutatyon daha sonra hücre yüzeyi üzerinde kalan proteinlere bağlı olan biyotin parçalarının disülfid bağlarını kırmak için eklenir. Sonunda, bozulmuş disülfür bağları, iyodoasetamid ile reaksiyona girerek, labil tiol gruplarını tüketir ve bağların reformasyonunu önler. Daha önce olduğu gibi, hücreler daha sonra lizlenir ve etiketli proteinler streptavidin-agaroz kullanılarak çöktürülür. Disk sınırlamalarıYöntemler arasında paylaşılan benzerlikler nedeniyle burada da geçerlidir. Buna ek olarak, bu tahlilde yer alan sıcaklık değişimlerinin, özellikle hızlı içselleştirilen veya hızla geri dönüşümlü proteinlerin olması durumunda, her zaman artışı için ne kadar proteinin sitoplazma edildiğinin tam olarak belirlenmesini engellemesi akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tahlil, sadece endositik hızların semikantitatif bir kestirimini sağlar. Toplam iç yansıma flüoresan mikroskopisi, yüklü veziküllerin alımını izlemek ve endositoz kinetiğini daha kesin bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, ilgilenilen proteinin floresan etiketli kimerik yapısı bulunduğunu farz ederek, bu tahlil için çok faydalı bir tamamlayıcı madde sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Thaw on ice.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-actin antibody (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Reduced glutathione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose resin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Hücre yüzey proteinleri çok çeşitli fonksiyonlara aracılık eder. Çoğu durumda, faaliyetleri plazma membranındaki seviyelerini modüle eden endositik işlemlerle düzenlenir. Burada, bu süreçlerin çalışmasını kolaylaştıran 2 yöntem için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, her ikisi de hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinleştirilmesi ilkesine dayanmaktadır. İlki hücre yüzeyinde belirli bir proteinin göreli düzeylerinin yarı niceliksel olarak belirlenmesine izin vermek için tasarlanmıştır. İçinde hücrelerin plazma membran proteinlerinin lisin artıkları önce bir biotin kısmı ile etiketlenir. Hücreler ayrıldıktan sonra, bu proteinler daha sonra agarozla hareketsiz hale getirilen streptavidin kullanımı ile biyotin için ikinci afinitenin doğal afinitesini istifade ederek spesifik olarak çöktürülebilir. Böyle bir şekilde izole edilen proteinler daha sonra standart bir western blotlama yaklaşımı ile analiz edilebilir. İkinci yöntem, bir partikülün endositik hızını belirleme aracı sağlarAr hücre yüzeyi hedefinin belirli bir zaman süresi boyunca. Hücre yüzey proteinleri, ilk olarak, bölünebilir bir disülfid bağı içeren bir biyotin türevi ile modifiye edilir. Hücreler daha sonra biyotinlenmiş proteinlerin bir kısmının endositik alımına neden olan normal kültür koşullarına geri kaydırılır. Daha sonra, içe geçmemiş biyotin gruplarının disülfür bağları, membrana geçirimsiz redüksiyon maddesi glutatyon kullanılarak indirgenir. Bu yaklaşım vasıtasıyla, endositize proteinler izole edilebilir ve yüksek bir özgüllük derecesi ile nicelleştirilebilir.

Astrositlerdeki AQP4&#39;ün plazma membran ekspresyonunu değerlendirmek için hücre yüzeyi biotinilasyonunun kullanılması Laminin ile muamele edilmiş astrosit kültürleri ve muamele edilmemiş kontrol hücreleri tarif edilen yöntemler kullanılarak hücre yüzeyi biotinilasyonuna tabi tutuldu. Biyotinlenmiş proteinler, agaroz-konjuge streptavidin ile çöktürüldü ve daha sonra SDS-PAGE vasıtasıyla ayrıldı. Hücre yüzeyi fraksiyonları AQP4 ve β-distroglikan (β-DG) için bir hücre yüzeyi yükleme kontrolü için taranırken giriş ve hücre içi fraksiyonlar bir yükleme kontrolü olarak AQP4 ve β-aktin için bloke edildi (Şekil 1A). Hücre yüzeyi fraksiyonu için bant yoğunlukları dansitometri ile nicelleştirildi ve her hücre seti için AQP4 seviyeleri önce β-DG değerlerine karşı normalize edildi ve bu oranlar kontrol hücreleri için normalize edildi. Histogram ( Şekil 1 </strong&gt; B ), üç bağımsız deney için ortalama ± SEM değerini temsil eder. Ortalama olarak laminin tedavisi, hücre yüzeyinde eksprese edilen AQP4&#39;te yaklaşık 2X artışa neden olur. Biyotinleme kullanarak AQP4&#39;ün endositik hızının araştırılması Astrositlerdeki AQP4 endositozu 30 dakikalık bir süre boyunca takip edildi. Kısaca, 3 bölünmüş astrositler içerisinde yüzey proteinlerini etiketlemek için ilk olarak bir bölünebilir biotin analoğu kullanılmıştır. Hücreler, etiketli proteinlerin içselleştirildiği sırasıyla sırasıyla 0, 15 ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;ye kaydırıldı. Yüzeyde kalmış olan etiketleme, daha sonra, bir indirgeyici madde kullanılarak kaldırıldı ve endositleştirilmiş proteinler, agaroz-konjüge streptavidin ile çöktürüldü. SDS-PAGE yoluyla ayrıldıktan sonra, bunlar AQP4 için araştırılmıştır ( Şekil 2A). AQP4 seviyeleri, yoğunluk ölçümü kullanılarak nicelleştirildi ve15 ve 30 dakikalık zaman noktaları, 0 dakikalık örneklem için normalize edildi. Histogram ( Şekil 2 B ), bu tür dört deney için ortalama ± SEM değerini temsil etmektedir. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55974/55974fig1.jpg" /> Şekil 1 . Laminin Varlığında Hücre Yüzeyinde AQP4 Ekspresyonu. (A) 24 nM laminin-111 (+ LN) ile muamele edilmiş, muamele edilmemiş astrositlerden (-LN) ve astrositlerden alınan hücre yüzeyi, hücre içi ve toplam (Giriş) fraksiyonları, AQP4 ve β-DG için araştırılmıştır. (B) AQP4 ile muamele edilmemiş ve laminin ile muamele edilmiş astrositlerdeki hücre yüzeyi düzeylerindeki farklılıkları gösteren, β-DG seviyelerine göre normalleştirilmiş histogram. Değerler, normalleştirilmiş ortalama piksel yoğunluklarını ± kontrol hücrelerinin değerlerine göre ifade edilen SEM&#39;i temsil etmektedir. Yıldız işareti bir istatistikayı belirtirİki uçlu Student&#39;s t- testi (n = 3, * p = 0.033) ile belirlendiği gibi, AQP4&#39;te belirgin bir artış var. Bu rakam Tham ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55974/55974fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55974/55974fig2.jpg" /> Şekil 2 . Astrositlerdeki AQP4 İçselleştirmesi (A) AQP4 için 0,15 ve 30 dakika astrosit kültürleri tarafından içerileştirilen proteinler araştırılmıştır. (B) 4 bağımsız deney için AQP4&#39;ün içselleştirme oranlarını özetleyen histogram, 0 dakikalık zaman noktası için değerlere normalize edildi. Yıldız işareti, AQP4 miktarında, iki kuyruklu bir kuyruk tarafından belirlendiği üzere, 15 ila 30 dakika arasında endositize edilen istatistiksel olarak önemli bir artışa işaret etmektedirEd Öğrencinin t- testi (n = 3, * p = 0.017). (C) Glutatyon, bölünebilir biotin analogundaki disülfür bağı kırmak için kullanıldığında, hücre yüzeyi AQP4&#39;ün biyotinlenmiş fraksiyona katkısı keskin bir şekilde azaltılır ve 0 ile 15 dakika arasındaki örnekler arasında (C, sol üstte) net bir fark oluşur ) . Bu adım atlandığında, hücre yüzeyi havuzundan kaynaklanan sinyal, 2 zaman noktası arasındaki farkı algılanmaz (C, sağ üst) gösterir . Bu rakam Tham ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55974/55974fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Görüntüleme.  University of British Columbia.  Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur. 

Video: Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Nörobilim

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

Hücre Biyolojisi

Isolation of Cell-Surface and Intracellular Proteins from an Astrocyte Culture

Source: Tham, D. K. L., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of cell-surface and intracellular proteins from an astrocyte culture. The astrocyte culture is placed on ice to inhibit endocytosis, and then the cell-surface proteins are labeled with a biotinylation reagent. The cells are lysed to release the biotinylated cell-surface proteins and non-biotinylated intracellular proteins. Finally, streptavidin-coated beads are used to separate the biotinylated cell-surface proteins from the intracellular proteins.

Bir Astrosit Kültüründen Hücre Yüzeyi ve Hücre İçi Proteinlerin İzolasyonu

1. Determining Relative Cell-surface Protein Expression in Astrocytes by Biotinylation
NOTE: Here, we illustrate the application of this biotinylation ...