Questo progetto è stato sostenuto dall&#39;Istituto canadese di ricerca sulla salute PG # 20R47867.

1. Determinazione dell&#39;espressione della proteina cellulare-superficie in astrociti mediante biotinilazione NOTA: Qui illustriamo l&#39;applicazione di questa tecnica di biotinilazione allo studio degli effetti della laminina molecolare della matrice extracellulare sulla localizzazione della superficie del canale aquaporin-4 (AQP4) permeabile all&#39;acqua. I materiali specializzati necessari per questo dosaggio comprendono la resina sulfo-NHS-LC-biotina e la streptavidina-agarosio (vedi tabella dei materiali ). <ol><li> Utilizzando il metodo descritto in Noel et al. 12 , preparare le colture di astrociti corticali circa 2 settimane prima del dosaggio e svilupparle in 75 cm2 palloni di coltura sfiorata. Quando gli astrociti sono confluenti 80-90%, staccandoli dalla superficie della coltura usando il 0,05% di tripsina e quindi passarli 1: 3. </li><li> A 48 ore prima del dosaggio, quando le cellule sono nuovamente confluenti 80-90%, astrociti di passaggio 1: 3Hange nel formato della cultura) su piatti di coltura di cellule da 60 mm in modo che siano&gt; confluenti del 70% al giorno in cui si svolge l&#39;esperimento. Assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente tra i piatti. </li><li> A 16 h prima del dosaggio, pipettare la laminina nel mezzo di coltura fino ad una concentrazione finale di 24 nM ed incubare a 37 ° C. </li><li> Immediatamente prima del dosaggio, preparare quanto segue e quindi mettere in ghiaccio o refrigerare: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H2O e 100 mg / L CaCl2 in 1X PBS, pH 7,4), tampone biotina (0,5 ), Tampone di lisi (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicina, 150 mM NaCl e 5 mM), tensioattivo (50 mM NH4Cl in CM-PBS) EDTA, 1% tritone X-100, 1X proteasi inibitore), tampone di carico 3X (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerolo, 300 mM DTT e 0,01% blu bromofenolo) Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 x proteasi inibitore cocktail). </li><li> RemQuesti piatti che tengono le culture astrociste dall&#39;incubatore e scartano il mezzo. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato e mettere i piatti su ghiaccio tritato. </li><li> Pipettare 2 mL di tampone biotino in ogni pozzetto e piegare delicatamente i piatti avanti e indietro qualche volta per assicurare una copertura completa. Lasciare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Rimuovere il tampone di biotina usando un aspiratore e sostituirlo con 4 mL di tampone di tiro. Lasciare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Aspirare il buffer di spegnimento e sostituire con un volume equivalente dello stesso. Ancora una volta, lasciare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Scartare il tampone di spegnimento e lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato. </li><li> Stabilizzare le cellule in 1 ml di CM-PBS refrigerato usando un sollevatore di celle e trasferire la sospensione al tubo di microcentrifuga. </li><li> Pellet cellule mediante centrifugazione a 100 xg per 3 min. Scartare il supernatante e ri-sospendere le cellule in 500 μl di tampone di lisi. </li><li> Lasciare i campioni in ghiaccio per 30 minuti, vorticando ogni 5 minuti, o plIn un rotatore a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il lisato a 14.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per far pelliccare tutti i materiali insolubili nel detergente. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo di microcentrifuga. <ol><li> Salva 50 μL di questo lisato e aggiunge il tampone di caricamento ad esso. Quindi denaturarlo riscaldandosi a 95 ° C in un bagno asciutto; Questa è la frazione &quot;input&quot; contenente sia proteine ​​della superficie cellulare biotinilata, sia proteine ​​citosoliche non biotinilate. </li></ol></li><li> Estendere l&#39;apertura di una punta pipetta tagliando circa 0,5 cm di materiale dalla sua estremità usando un paio di forbici affilate. Utilizzando questa punta pipetta, trasferire 75 μl di branchi streptavidina-agarosio (normalmente conservati a 4 ° C) al lisato e incubare a 4 ° C per 3 ore su agitatore. <ol><li> Poiché lo streptavidina agarosio viene spesso venduto come una sospensione contenente 50% di brani in volume, sospesa in una soluzione antimicrobica, triturare la sospensione per garantire che le perleSono sospesi uniformemente e quindi pipettate 150 μL di sospensione in ciascun campione. </li></ol></li><li> Pellet streptavidin-agarose per centrifugazione a 1500 xg per 30 s a 4 ° C. <ol><li> Salvare 50 μL del supernatante (aggiungere il tampone di caricamento e denaturarlo a 95 ° C in un bagno d&#39;acqua o un blocco di riscaldamento); Questo rappresenta la frazione &quot;intracellulare&quot; e comprende principalmente proteine ​​citosoliche non biotinilate. </li></ol></li><li> Resispendere le perline di pellet in 1 ml di tampone di lavaggio e scaldare questo per 3 minuti a 4 ° C. Perline di pellicole (come nel punto 1.16) e scartare il surnatante. Ripetere questo processo 4x per ridurre al minimo il legame non specifico di proteine ​​citosoliche non biotinilate. </li><li> Pelletare le perle per centrifugazione (1500 xg per 30 s a 4 ° C) e scartare il buffer di lavaggio sovrastante. Aggiungere 50 μl di tampone di carico 1X (diluito utilizzando buffer lisi). Rilasciare la biotina e streptavidina dai branchi denaturandoli a 95 ° C; Questa frazione di shoUld contengono solo le proteine ​​della superficie delle cellule biotinilate (frazione &quot;superficie cellulare&quot;). <ol><li> Ingressi separati, cellule superficiali e frazioni intracellulari da SDS-PAGE 13 e analisi mediante blotting occidentale 14 . NOTA: Mentre abbiamo utilizzato un gel di gradi prefabbricato da 4 a 20% nei nostri esperimenti, un gel di separazione del 12-14% con uno strato di impilamento del 4% (ciascuno contenente 0,1% SDS) dovrebbe bastare per le proteine ​​di interesse in questo studio. Dovrebbe essere utilizzato anche uno standard di peso molecolare della gamma di dimensioni appropriata. Si noti che talvolta ci può essere un upshift osservabile nelle masse molecolari apparenti delle proteine ​​biotinilate. </li></ol></li></ol> 2. Determinazione della velocità di internalizzazione delle proteine ​​della superficie cellulare in astrociti per biotinilazione NOTA: Qui di seguito descriviamo un tipico esperimento di biotinilazione impulso-chase utilizzato in questo caso per monitorare l&#39;endocitosi di AQP4 in astrociti. QuestoIl metodo è basato su quello utilizzato da Madrid et al. 15 . I materiali specializzati necessari includono la solfo-NHS-SS-biotina, la resina streptavidina-agarosio, il glutatione ridotto e l&#39;iodoacetamide (vedi tabella dei materiali ). <ol><li> Preparare le colture di astrociti corticali del miele in piatti da 60 mm utilizzando i metodi descritti nella sezione precedente. Assicurarsi che le cellule siano circa confluenti del 70% al giorno del dosaggio e che ogni piatto contiene un numero equivalente di celle. </li><li> Immediatamente prima del dosaggio preparare quanto segue e mettere in ghiaccio o refrigerare: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H2O e 100 mg / L CaCl2 in 1X PBS, pH 7,4), tampone biotina (0,5 (50 mM di glutatione ridotta, 75 mM di NaCl e 75 mM di NaOH), di tampone di quenching (50 mM iodoacetamide, 1% di BSA in CM-PBS) Tampone di lisi (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glicina, 150 mM NaCl e 5 mM EDTA, 1% tritone X-100, 1(10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA), tampone di carica 3 volte (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerolo, 300 mM DTT e 0,01% bromofenolo blu) 150 mM NaCl, 1% tritone X-100, 1 x proteasi inibitore cocktail). </li><li> Preparare il mezzo di coltura fresco di cellule (DMEM integrato con 10% Fetal Bbovine Serum (FBS), 1% penicillina / streptomicina e 1% L-glutammina) e collocarlo in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. </li><li> Rimuovere le culture astrociste dall&#39;incubatore e aspirare il mezzo utilizzando un aspiratore. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato e mettere i piatti su ghiaccio tritato. </li><li> Pipettare 3 ml di tampone biotino in ogni piatto, inclinare i piatti avanti e indietro qualche volta per assicurare che il tampone sia ben distribuito e lasciarlo su ghiaccio per 30 minuti. </li><li> Aspirare il tampone di biotina e sostituirlo con 5 mL di terreno caldo. Incubare un piatto di coltura a 37 ° C per 15 minuti e un secondo piatto alla stessa temperatura per 30 min. Lasciare un altro piatto a 46; C come campione di 0 min. </li><li> Alla fine del periodo di incubazione, scartare il mezzo e lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerati. Pipettare 6 mL di tampone riducente sulle cellule e lasciare in ghiaccio per 15 minuti. </li><li> Rimuovere il tampone riducente e quindi sostituirlo con 6 mL di tampone riducente fresco. Mettere in ghiaccio per altri 15 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione riducente e sostituirla con 6 mL di tampone di cottura. Lasciare in ghiaccio per 15 minuti. </li><li> Ripetere lo spegnimento ancora una volta. </li><li> Scartare il tampone di spegnimento e lavare le cellule tre volte con 4 ml di PBS refrigerato. </li><li> Staccare le cellule in 1 ml di PBS refrigerato utilizzando un sollevatore di celle e trasferire la sospensione in un tubo di microcentrifuga. </li><li> Pellet cellule mediante centrifugazione a 100 xg per 3 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μl di tampone di lisi. </li><li> Lasciare questo su ghiaccio per 30 minuti e vorticarsi ogni 5 min. In alternativa, posizionare i campioni su un rotatore di fine corsa a 4 ° C per questa durata. </li><li> Centrifugare la lyA 14.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per far pelliccare i materiali insolubili nel detersivo, quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo di microcentrifuga. Salvare 50 μl di questo lisato, aggiungere il tampone di caricamento e denaturare a 95 ° C in un bagno asciutto; Questa è la frazione &quot;input&quot;, contenente sia proteine ​​endocitose biotinilate, sia proteine ​​non biotinilate. </li><li> Utilizzando una punta di pipetta tagliata, aggiungere 150 μL di slurry di streptavidina-agarosio al lisato e incubare a 4 ° C per 3 ore su agitatore. Vedere 1.15 per ulteriori dettagli su questo passaggio. </li><li> Pellet streptavidin-agarose per per centrifugazione a 1.500 xg per 30 s a 4 ° C. </li><li> Resispendere le perle in 1 ml di tampone di lavaggio e scalpellare per 3 min a 4 ° C. Perline di pellicole (come al punto 2.18), e scartare il supernatante. Ripetere questo processo 4x per ridurre al minimo il legame non specifico di proteine ​​citosoliche non biotinilate. </li><li> Le pellicole vengono centrifugate a 1.500 xg per 30 s, a 4 ° C, e scartano questeTampone lavaggio. Aggiungere 50 μL di tampone di caricamento 1X (diluito utilizzando lysis buffer). Rilasciare biotina e streptavidina da branelli denaturando a 95 ° C; Questa frazione dovrebbe contenere solo proteine ​​delle cellule-superficie internalizzate (frazione &quot;endocitosed&quot;). </li><li> Ingresso separato, superficie cellulare e frazioni non legate da SDS-PAGE 13 e analisi mediante blotting occidentale 14 . NOTA: Mentre abbiamo utilizzato un gel di gradi prefabbricato da 4 a 20% nei nostri esperimenti, un gel di separazione del 12-14% con uno strato di impilamento del 4% (ciascuno contenente 0,1% SDS) dovrebbe bastare per le proteine ​​di interesse in questo studio. Dovrebbe essere utilizzato anche uno standard di peso molecolare della gamma di dimensioni appropriata. Si noti che talvolta ci può essere un upshift osservabile nelle masse molecolari apparenti delle proteine ​​biotinilate. </li></ol>

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	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

modifiche: Poiché questi metodi sono stati progettati per l&#39;uso con le cellule aderenti, abbiamo specificato l&#39;uso di PBS contenente 100 mg / L di MgCl2 · 6H2O e 100 mg / L CaCl2 (CM-PBS) per i passaggi di lavaggio e come base di alcuni tamponi in modo da garantire che le cellule rimangano attaccate alla superficie di coltura e che le giunzioni delle cellule cellulari non siano interrotte. Tuttavia, i protocolli possono essere applicati anche a tipi di cellule non aderenti se le cellule vengono raggruppate tra ciascuna fase della procedura. In questi casi, CM-PBS può essere sostituito con PBS. Inoltre, è importante notare che ognuna delle condizioni qui indicate è specifica per questo protocollo e dovrebbe essere considerata come linee guida ruvide se i metodi devono essere utilizzati per altre applicazioni. In particolare, si deve verificare in modo indipendente che la procedura di estrazione del detergente sia appropriataR e che le impostazioni della centrifuga sono adatte per il tipo di cella e per le perle di streptavidina-agarosio in uso. Infine, se ci sono preoccupazioni per uno sfondo vincolante e / o eccessivo non specifico, uno può sostituire streptavidina con le varie forme avidiniche attualmente disponibili sul mercato. Ad esempio, l&#39;avidina degglosilata ha una affinità significativamente più bassa per le lectine e per le molecole caricate negativamente come il DNA. Risoluzione dei problemi e controlli: Mentre le procedure esaminate in questa relazione sono abbastanza semplici, bisogna considerare una serie di problemi critici che possono influenzare il risultato dell&#39;esperimento. Innanzitutto, sebbene entrambi i dosaggi dipendono fortemente dalla natura impermeante dei reagenti di biotinilazione solfati, alcune condizioni potrebbero causare la membrana plasmatica delle cellule per essere interrotta, determinando così una certa proteina intracellulareIns biotinilati. Per controllare questa possibilità, si suggerisce che le frazioni biotinilate debbano essere esaminate per obiettivi noti per non essere espressi alla membrana plasmatica, come β-actina. Bisogna fare attenzione a rispettare le condizioni di stoccaggio adeguate per i reagenti di biotinilazione (tipicamente 4 o -20 ° C, con una qualche forma di essiccazione), poiché questi potrebbero non funzionare altrimenti, a causa della loro natura altamente sensibile. Tuttavia, è buona pratica sondare le frazioni in ingresso, biotinilate e non biotinilate con streptavidin-HRP per accertare che la biotinilazione è effettivamente verificata e che le proteine ​​biotinilate sono state precipitate in modo efficiente (che sarà evidente dall&#39;assenza di un segnale nel Frazione non biotinilata). Ciò dovrebbe permettere l&#39;eliminazione della possibilità di reagenti difettosi. La riduzione del legame di disolfuro è un passo cruciale nella procedura di biotinilazione endocitica, in quanto garantisceChe solo le proteine ​​interne saranno isolate nella frazione biotinilata. Incorporando controlli in cui il reagente riduttore è omesso ( Figura 1 C ) permette di ottenere un&#39;impressione dell&#39;efficacia del trattamento.

Le proteine ​​alla superficie cellulare svolgono una serie di ruoli centrali per mantenere la funzione cellulare. In numerosi casi, la loro attività dipende o modulata da processi endocitici che li privano temporaneamente in siti intracellulari o che li dirigono verso percorsi degradativi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Qui evidenziamo 2 approcci basati sulla biotinilazione progettati per consentire all&#39;utente di specificare e isolare in modo specifico le proteine ​​espresse alla membrana plasmatica e quelle recentemente internalizzate. Attraverso questi metodi, l&#39;espressione della superficie cellulare e la velocità endocitica di qualsiasi proteina di interesse possono essere quantificati, consentendo così di ottenere una più chiara valutazione della sua regolamentazione. Determinazione dell&#39;espressione proteica relativa alla superficie cellulare mediante biotinilazione La biotina o la vitamina B7, precedentemente nota come vitamina H 6 , è una piccola molecola solubile in acqua che può essere usata per modificare chimicamente gruppi amminici, sulfidrilici e carbossilici reattivi delle molecole biologiche. La coltura attuale di reagenti di biotinilazione a superficie cellulare è costituita principalmente da esteri di N-idrossisuccinimide (sulfo-NHS) solfonati a membrana, biotina o suoi derivati, progettati per reagire con le ammine presenti sulle catene laterali di residui di lisina di proteine ​​espressi La superficie cellulare quando questi diventano deprotonati in condizioni di base, con conseguente formazione di un legame amidico con la parte biotina 7 . Così modificate, le proteine ​​della superficie cellulare possono essere isolate tramite l&#39;uso di avidin, una proteina tetramerica da 66 a 69 kDa che possiede una grande affinità per la biotina, legandola a quest&#39;ultimo con una costante di dissociazione di circa 10-15 , che la contrassegna come uno dei Interazioni non-covalenti più forti conosciute 8 </suP&gt; , 9 . Alcuni metodi alternativi di quantificazione dell&#39;espressione di proteine ​​sulla superficie cellulare sono stati utilizzati negli studi precedenti. L&#39;etichettatura delle cellule non-permeabilizzate usando anticorpi fluorescenti specifici per la proteina di interesse, seguita dalla visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza, ad esempio, è un approccio comunemente impiegato, ma è fortemente dipendente dalla disponibilità di anticorpi che possono legarsi ad epitopi extracellulari. Più recentemente sono stati impiegati anche metodi che prevedono l&#39;uso di proteine ​​chimiche contenenti fluorofori sensibili al pH che reagiscono ad essere esposti a supporti acidi. Tuttavia, tali analisi coinvolgono solitamente l&#39;espressione esogena di questi costrutti nelle linee cellulari in cui la proteina di interesse non viene trovata nativamente. Questi approcci sono comunque in grado di fornire informazioni preziose sulla localizzazione subcellulare e l&#39;itinerario esocitario delProteina bersaglio, e quindi dovrebbe essere utilizzato in combinazione con gli approcci basati sulla biotinilazione qui descritti se gli strumenti sono disponibili. In un test di biotinilazione tipico, le cellule vengono prima lavate accuratamente in PBS a 4 ° C. Ciò elimina tutte le tracce di proteine ​​del siero introdotte dal mezzo di coltura, assicurando così che queste non consumino quantità eccessive di biotina nel passo successivo. Ancora più importante, la riduzione della temperatura induce l&#39;decociazione significativa dell&#39;endocitosi. Viene quindi aggiunto il reagente di biotinazione. Successivamente, le cellule vengono nuovamente lavate e successivamente incubate con un tampone di cottura contenente sia glicina che NH 4 Cl, il cui scopo è quello di inattivare tutte le residue tracce di biotina non reagita. Le cellule vengono quindi lisate, seguendo il quale viene aggiunto streptavidina immobilizzato agarosio per precipitare le proteine ​​biotinilate. L&#39;analisi viene comunemente eseguita mediante blotting occidentale, permettendo la relativa espressione della superficie cellulare su vari prQuantitativi di otteini. A causa della base di questo test, è adatto solo per le proteine ​​che possiedono porzioni esposte all&#39;ambiente extracellulare. Le proteine ​​di transmembrana multipass, che probabilmente possiedono un certo numero di lisine reattive all&#39;interno delle loro regioni di ciclo, sono il più idoneo a questo metodo, mentre le proteine ​​a singolo passaggio tendono ad essere meno suscettibili di essere biotinilate. Anche in questi casi, resta la possibilità che le modificazioni conformazionali o le interazioni intermolecolari possano occludere determinati siti reattivi, con conseguente rendimento inferiore a quello previsto della biotinilazione. Determinare la velocità di internalizzazione delle proteine ​​della superficie cellulare mediante biotinilazione I principi di questo test sono in gran parte simili a quelli della biotinilazione a superficie cellulare, con una serie di eccezioni, il più importante dei quali è l&#39;uso di reattivi reattivi di biotinilazione. I gruppi di biotina (di questi) possiedono disuOsservi le obbligazioni, all&#39;interno delle loro strutture, suscettibili di ridurre gli agenti; Questo è sfruttato per garantire che solo le proteine ​​della superficie cellulare prese in siti intracellulari durante il periodo di dosaggio saranno lasciati biotinilati. Un dosaggio si svolge generalmente nel seguente modo. Le cellule vengono prima lavate e biotinilate con reagenti freddi, quindi viene riportato il terreno di coltura a 37 ° C e le cellule vengono riportate all&#39;incubatrice; Ciò induce le etichettate proteine ​​della superficie cellulare a subire l&#39;endocitosi. L&#39;agente riducente glutatione - che non può penetrare nella membrana - viene quindi aggiunto per rompere i legami disolfuro delle parti biotiniche attaccate a proteine ​​rimaste sulla superficie cellulare. Infine, i legami disolfuro rotti vengono reagiti con iodoacetamide, consumando i gruppi tiolici labili e impedendo i legami di riformare. Come prima, le cellule vengono poi lisate e le proteine ​​etichettate vengono precipitate usando streptavidina-agarosio. Il disco delle limitazioniUtilizzati nella sezione precedente si applicano anche qui per le somiglianze condivise tra i metodi. Inoltre, vale la pena ricordare che gli spostamenti di temperatura coinvolti in questo dosaggio precludono l&#39;esatta determinazione di quanto proteina sia endocitata per ogni incremento di tempo, in particolare nel caso di proteine ​​rapidamente internalizzate o riciclate rapidamente. Il dosaggio fornisce quindi una stima semiquantitative di tassi endocitici. La microscopia a fluorescenza completa di riflessione interna può essere usata per monitorare l&#39;assorbimento di ogni vescolina caricata e fornire una misurazione più precisa della cinetica dell&#39;endocitosi. Può quindi fornire un complemento molto utile a questo dosaggio, supponendo che sia disponibile un costrutto chimerico tagliato fluorescente della proteina di interesse 11 .

<table><tbody><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Thaw on ice.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-actin antibody (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Reduced glutathione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose resin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Le proteine ​​delle cellule superano una vasta gamma di funzioni. In molti casi, la loro attività è regolata da processi endocitici che modulano i loro livelli alla membrana plasmatica. Qui presentiamo protocolli dettagliati per 2 metodi che facilitano lo studio di tali processi, entrambi basati sul principio della biotinilazione delle proteine ​​della superficie cellulare. Il primo è stato progettato per consentire la determinazione semiquantitativa dei livelli relativi di una particolare proteina sulla superficie cellulare. In esso, i residui di lisina delle proteine ​​della membrana plasmatica delle cellule vengono prima etichettate con una parte di biotina. Una volta che le cellule sono lisate, queste proteine ​​possono essere specificamente precipitate mediante l&#39;uso di streptavidina immobilizzato da agarosio sfruttando l&#39;affinità naturale di quest&#39;ultimo per la biotina. Le proteine ​​isolate in tal modo possono quindi essere analizzate mediante un approccio Western blotting standard. Il secondo metodo fornisce un mezzo per determinare la velocità endocitica di un particulTarget di superficie cellulare per un periodo di tempo. Le proteine ​​della superficie cellulare vengono prima modificate con un derivato della biotina contenente un legame disolfuro schiarente. Le cellule vengono quindi spostate indietro a condizioni di coltura normali, che provocano l&#39;assunzione endocitica di una percentuale di proteine ​​biotinilate. Successivamente, i legami disolfuro di gruppi di biotina non internalizzati vengono ridotti utilizzando il glutatione impermeabile per riduzione della membrana. Attraverso questo approccio, le proteine ​​endocitose possono quindi essere isolate e quantificate con un elevato grado di specificità.

Utilizzando la biotinilazione della superficie cellulare per valutare l&#39;espressione della membrana plasmatica di AQP4 in astrociti Le colture astrocitiche trattate con Laminin e le cellule di controllo non trattate sono state soggette a biotinilazione a superficie cellulare utilizzando i metodi descritti. Le proteine ​​biotinilate sono state precipitate con streptavidina coniugata con agarosio e quindi separate mediante SDS-PAGE. Le frazioni di superficie cellulare sono state analizzate per AQP4 e β-distroglicano (β-DG) come controllo di caricamento a superficie cellulare, mentre le frazioni di input e intracellulari sono state blottate per AQP4 e β-actina ( Figura 1 A ) come controllo di caricamento. Le intensità della banda per la frazione della superficie cellulare sono state quantificate mediante densitometria e i livelli di AQP4 per ciascuna serie di cellule sono normalmente normalizzati contro i valori di β-DG e questi rapporti sono stati normalizzati rispetto a quelli per le cellule di controllo. L&#39;istogramma ( Figura 1 </strong&gt; B ) rappresenta i valori medi ± SEM per tre esperimenti indipendenti. Il trattamento con Laminin, in media, provoca un aumento di quasi 2 volte in AQP4 espresso alla superficie cellulare. Indagare la velocità endocitica di AQP4 usando la biotinilazione L&#39;endocitosi AQP4 in astrociti è stata monitorata per un periodo di 30 minuti. In breve, un anidride biotina cleavable è stato usato per etichettare le proteine ​​superficiali in 3 piatti di astrociti. Le cellule sono state spostate a 37 ° C rispettivamente per 0, 15 e 30 min, durante le quali le proteine ​​etichettate sono state internalizzate. L&#39;etichettatura rimasta sulla superficie è stata quindi rimossa usando un agente riducente e le proteine ​​endocitose sono state precipitate con streptavidina con agarosio-coniugato. A seguito della separazione tramite SDS-PAGE, questi sono stati quindi esaminati per AQP4 ( Figura 2 A ). I livelli AQP4 sono stati quantificati usando la densitometria ei valori corrispondenti allaI punti temporali di 15 e 30 minuti sono stati normalizzati a quelli per il campione di 0 min. L&#39;istogramma ( Figura 2 B ) rappresenta i valori medi ± SEM per quattro tali esperimenti. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55974/55974fig1.jpg" /> Figura 1 . Espressione AQP4 alla superficie cellulare nella presenza di Laminin. (A) Le frazioni di cellule, intracellulari e totali (Input) da astrociti non trattati (-LN) e astrociti trattati con 24 nM laminin-111 (+ LN) sono stati saggiati per AQP4 e β-DG. (B) Istogramma che illustra le differenze nei livelli di superficie della cellula di astrociti AQP4 non trattati e trattati con laminina, normalizzati contro i livelli di β-DG. I valori rappresentano intensità di pixel mediali normalizzate ± SEM, espresse in rapporto ai valori delle celle di controllo. L&#39;asterisco indica una statisticaL&#39;aumento significativo di AQP4, come determinato da una t- test di due studenti (n = 3, * p = 0.033). Questa cifra è stata modificata da Tham et al. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55974/55974fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55974/55974fig2.jpg" /> Figura 2 . AQP4 Internalizzazione negli astrociti (A) Le proteine ​​interne da culture astrociste a 0, 15 e 30 minuti sono state sondate per AQP4. (B) Istogramma che riassume i tassi di internalizzazione di AQP4 per 4 esperimenti indipendenti, normalizzati contro i valori per il tempo di 0 min. L&#39;asterisco indica un aumento statisticamente significativo della quantità di AQP4 endocituted tra 15 e 30 minuti come determinato da una due codaIl test t dell&#39;allievo (n = 3, * p = 0.017). (C) Quando il glutatione viene usato per rompere il legame disolfuro nell&#39;analogo biotina cleavable, il contributo della superficie cellulare AQP4 alla frazione biotinilata è notevolmente ridotto, determinando una chiara differenza tra i campioni 0 e 15 min (C, in alto a sinistra ) . Quando questo passaggio viene omesso, il segnale proveniente dalla piscina di superficie della cella rende la variazione tra i due punti temporali non rilevabili (C, in alto a destra) . Questa cifra è stata modificata da Tham et al. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55974/55974fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l&#39;espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine ​​espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione.

Determinazione dell&#39;espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Views.  University of British Columbia.  Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l'espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine ​​espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione. 

Video: Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Ricerca

Biologia

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neuroscienze

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

Saggio di biotinilazione delle proteine di membrana

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

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Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

Valutazione dell'internalizzazione delle proteine di superficie bersaglio utilizzando un derivato della biotina

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...

Determinazione dell'espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

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Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

Misurazione delle proteine plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Slice Cervello biotinilazione: An

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine di membrana

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

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Riepilogo

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