Name: detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry at JoVE.com

Biz tripanozom biyoloji genel tavsiye için George Haçı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma aynı zamanda DS, MRM bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1.325.261) ve FNP bir NIH / NIAID (hibe # AI085973) Bir Bill ve Melinda Gates Vakfı GCE hibe ile desteklenmiştir. Biz-SCEI geni ve tanıma bölgesi içeren gerginlik kullanımı için Galadriel Hovel-Miner teşekkür ederim.

NOT: süreci boyunca, o buz üzerinde hücreleri tutmak için gereklidir. Soğuk ortam ayrıca boyunca kullanılmalıdır. 1. Numune Hasat <ol><li> 1.000.000 / ml - 0.5 bir yoğunluğa Lister 427 suşu kan dolaşımı tripanozomlann büyütün. Bu parazit az sayıda kültürleri başlamak en iyisidir. 1.500 x g&#39;de 10 dakika boyunca 50 x 10 6 hücre / örnek aşağı doğru döndürün. Daha sonra pozitif ve negatif antikor denetimlerini kullanın için kültüründe 1 x 10 6 hücre bırakın emin olun. NOT: Bu protokol ayrıca, hayvan kanı (detaylar için tartışmaya bakınız) izole tripanozomlann kullanılabilir. </li><li> Pipet veya yüzer maddenin en dökün (yaklaşık 750 ul bırakın). 1.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarın. </li><li> bir mikrosantrifüj içinde 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de hücreler Spin ve supernatant çıkarın. </li></ol> 2. Manyetik Etiketleme <ol><li> Tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul kültür ortamında (HMI-9 wiUygun seyreltme örneğin inci serumu) + primer anti-VSG antikoru. Not: Anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1:50 seyreltmede kullanılmıştır. Bir florofor ile işaretlenmiş bir birincil anti-VSG antikor kullanılması önemlidir. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada 8 - hız 6 bir girdap adaptör 60 kullanılarak vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ile yıkayın. </li><li> 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de spin ve süpernatant aspire. serum ile 1 ml HMI-9 ile yıkayın ve yukarıdaki gibi döndürün. süpernatant aspire. serumu HMI-9, 100 ul içinde süspanse pelet. </li><li> (MSC) mikroboncuklar ayırma Manyetik aktive hücre 110 ul ekle. birincil anti-VSG antikor uygun olarak, anti-fare anti-tavşan veya anti-biyotin boncuk kullanın. İyice karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. </li><li> Hücreler vorteks olsa da, bir ayırma mıknatıs üzerinde bir manyetik aktive ayırma kolonu / örnek oluşturdu. Bir yeniden var emin olunsütununda ceptacle (biz bir 15 ml santrifüj tüpü kullanın) flow-through toplamak için. Soğuk bir odada aparatı ayarlayın. </li><li> Başbakan sütuna serum ile HMI-9 2 ml ekleyin. akış her bir örnek toplamak için sütunu altında bir 15 ml santrifüj tüp yeri emişli sonra. </li><li> Adım 2.4 10 dakika inkübasyondan sonra, 800-1000 civarında ul soğuk HMI-9 serumu ile ekleyin. 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de dönel çıkartıldı ve süpernatan bağlanmamış antikorların çıkarılması için. Serum ve tekrar süpernatant 100 ul bırakarak ile HMI-9 1 ml yıkayın. </li><li> şiddetle ve görsel santrifüj tüpü Flick pelet tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için tüp inceleyin. Hücreler de yeniden süspanse emin olmak için yukarı ve aşağı serum ve pipet ile HMI-9 1 ml ekleyin. </li></ol> 3. Manyetik Ayırma <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi sütunlar hazırlanmış olduğundan emin olun. sütun hücreler uygulanır. Hücreler baskın olmayan VS ifade ile flow-through toplayınsütun üzerinden akmaya 7 dakika - G. 1 orta ml + tripanozomlar genellikle 6 alır. </li><li> Yıkama 1 ml HMI-9 serum ile 2x ve adım 3.1 olarak akış yoluyla aynı tüp içinde toplamak. </li><li> Bölme akış (3 mi), iki 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine. Not: Bu, daha sonra bir araya getirilebilir ya da yarı vb RNA izole etmek için de kullanılabilir </li><li> mıknatıstan sütun çıkarın. sütununa serum ile HMI-9 3 ml ilave edilir ve başlangıç ​​baskın VSG ifade eden hücreleri elde etmek için bir 15 ml santrifüj tüpüne sütun dalma. daha sonra analiz için akıtılan malzemenin 300 ul çıkarın. buz üzerinde bu hücreleri tutun. </li><li> pozitif ve bir negatif kontrol olarak kullanılmak üzere, 37 ° C &#39;de büyümekte, kontrol hücrelerinin başlangıç ​​kültüründen yaklaşık 1.000.000 hücre sunar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bunları pipet (bu sıklıkla geçiş beklenmemektedir). Not: pozitif kontrol hücreleri adım 4.1 fluoroforla işaretlenmiş antikor ile boyanmış olacaktır. Negatif kontrol hücreleri remaProtokolün geri kalanı boyunca lekesiz olarak. </li><li> Sıkma akış örnekler ve 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de pozitif antikor kontrol örneği ve supernatant çıkarın. Not: elüt hücrelerinin diğer 300 ul alikosu, anti-VSG boyama için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. </li></ol> 4. Boyama Bulaşanlar ve switcherlar Belirlemek İçin <ol><li> Süspanse akış örnekler ve 100 ul HMI-9, uygun seyreltide Serum primer, fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG antikoru ile pozitif kontrol hücreleri. Not: etiketli anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1 seyreltme ile kullanılır: 1000. fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG step.There adım 3.5 aşağıdaki iki mikrosantrifüj tüpleri içinde akış numune 3 mi olmalıdır MACS ayırma etiketlenmemiş antikor olarak aynı kaynaktan olabilir. </li><li> yeniden sus ise iki mikrosantrifüj tüpler pelet birleştirmek, akım sitometri-through akımı ile tüm analiz etmek100 ul HMI-9 serum + anti-VSG antikoru ile örnekleri bekleyen. İyice karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ekleyin. 4 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg&#39;de ve çıkarma bağlanmamış antikorların çıkarılması için. </li><li> serumu HMI-9 için 1 ml hücre yıkayın. 4 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg&#39;de çıkarın. Bu son dönüş sırasında, adım 3.4 ve negatif kontrol örneğinden yıkandı-örnekleri aşağı doğru döndürün. </li><li> 148.5 ul HMI-9 serumu, 25 ul mutlak sayım boncuk ve 1.5 ul Propidium iyodür solüsyonu (175 ul toplam) boyama: Tüm akış ve elüt örnekleri yeniden süspanse edin. 175 ul pozitif ve negatif antikor kontrol örnekleri tekrar süspansiyon HMI-9 serumu ile. Mutlak sayım boncuk / kullanılan özel lot için 25 ul sayısını kaydetmek için emin olun. </li><li> bir akış sitometresinde aracılığıyla tüm örnekleri çalıştırmak ve veri toplamak. PI olarak leke ölü hücreler <sup&gt; +. Kirletici maddeler PI olarak leke - VSG +. VSG - - Seçiciler PI olarak leke 8. </li><li> veri flow sitometri kullanılarak anahtarlama frekansları hesaplayın. NOT: anahtarlama frekansları nasıl hesaplanacağı ile ilgili talimatlar için, ek dosyasına başvurun <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Sitometrisi Calculations.docx</a> ve Tablo 1&#39;de. </li></ol>

<ol>
	<li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular &amp; Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li><li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li><li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei.">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li><li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections.">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li><li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li><li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro.">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li><li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).</li><li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei.">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li><li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes.">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li><li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei.">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Deneysel tekniği ile ilgili olarak, protokolün en önemli bileşeni soğuk tüm örnekleri tutuyor. Tripanozomlarına çok hızlı yüzeyleri 9 bağlanan antikor içselleştirmeye ancak bu işlem motilite bağlıdır ve hücreler, 4 ° C &#39;de tutulur sürece tahlil etkilemez. Tüm numuneler daima buz üzerinde tutulmalıdır ve pipet 25 ° C laboratuar ortamında maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Soğuk HMI-9 serum ile deneyin başlangıcında mevcut olmalıdır ve boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. sütun üzerinden 1 ml örneği çalıştırmak için 7 dakika - bu 5 alır gibi sütun üzerinde çalıştırarak tripanozomlann izolasyonu, soğuk bir odada yapılmalıdır. Mevcut manyetik ayırma birimleri daha fazla örnek varsa aktif ayrılır olmayan örnekleri, buz üzerinde tutulur gibi manyetik izolasyon sürece, sırayla yapılabilir. Örnekler, çok iyi karışmış af olması da önemlidirmıknatıs üzerinde mikro-ve önceki izolasyonu ile inkübasyon aşağıdaki son yıkama ter. Bu santrifüj tüpüne veya hafif vorteks agresif titreşmesinde yapılabilir. hücrelerin yok pelet veya kümeleri önce ışık mikroskobu düzeyinde bakarak kontrol edilebilir ayırma kolonuna numunenin, eklenmesi görünür olmalıdır. kümeleri varsa, baskın VSG ifade eden hücrelerin akış örnekteki kirlenme düzeyi genellikle arzu çok daha yüksektir. protokol sonunda numunede switcherlar sayısı hesaplama yaparken, tüm flow-through akım sitometri analizi için kullanılıp kullanılmadığı dikkate almak önemlidir, ya da yarım kullanılıp kullanılmadığı. sadece yarısı kullanıldı, hesaplanan anahtarlama sayısı 2 ile çarpılmalıdır. Yıkama adımları sırasında süpernatant çıkarırken, her son damlasına kapalı pipetle için gerekli değildir ve tipik olarak 15-25 ul vardırHücrelerin pelet çevreleyen bıraktı. Orada çok az olan hücreleri açık olduğundan, bu noktada peletler nadir akış örneklerde görülmektedir, bu, boyama ve yıkama işleminin nihai safhalarında, özellikle önemlidir. Nihai önleyici VSG leke tipik olarak saflaştırılmış, florofor-etiketli anti-VSG antikoru ile birlikte, önceden manyetik izolasyon birinci anti VSG leke saflaştırılmış antikor veya serum ile yapılabilir. Ayrıca, anti-VSG antikorları eksprese eden hibridomlar elde biyoreaktör süpernatant kullandık. Ne olursa olsun, başlangıç ​​lekesi için kullanılan malzeme yapmak veya baskın başlangıç ​​VSG eksprese etmeyen hücre iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için titre edilmelidir. Baskın VSG ifade eden hücreler ile kirlenmiş akış-through hücre nüfus için tipiktir. Bu kirlenme düzeyde olmalıdır iken nüfus ifade eden hücrelerin tamamen yoksun olabilmesi için, bizim deneyim o nadirbaskın VSG ing. Izolasyon prosedürü ile gitti hücreler prosedür aracılığıyla olmamıştır o kadar anti-VSG antikoru gibi parlak leke yok dikkat etmek de önemlidir. Biz iki şey bu farkın hesabını ihtimalini varsaydığımızda. İlk tripanozomlarına eğirme VSG dökülme yol açar, ve izolasyon prosedürü dahil olan birçok spin vardır. Bu son anti-VSG leke sinyalin şiddetini azaltmak için beklenir. İkinci protokol, ilk aşaması, bir birincil anti-VSG antikorla boyama içermesidir. bu birinci aşamada kullanılan, antikor tarafından tanınan epitopları ile aynıdır ya da son leke antikor tarafından tanınan epitopları tıkanması durumunda, tek bir sinyal yoğunluğu yalnızca bir antikor kullanılması durumunda daha düşük olması beklenir. nedenle pozitif boyalı hücreye sinyal kabaca iki öyle ki son aşamada kullanılan antikor, titre önemlidirBir olumsuz lekeli hücre için daha yüksek büyüklükte emir. Bu şekilde, bir pozitif şekilde lekeleme yapan hücre sinyalinin şiddeti izolasyon prosedürü geçiren hücrelerde azalmış bile, bu olumlu hücreler hala akış sitometri arsa üzerinde olumsuz hücrelerden ayrılır. otomatik dengeleme kullanılıyorsa, tek bir leke kontrol örnekleri hazırlanmalıdır. Biz yarattı Antikorlar Memorial Sloan Kanser Center monocolonal antikor tesisinden satın alınabilir. Biz etiketsiz monoklonal antikor IgG kullanarak en iyi başarı elde ettiler. Biz poliklonal VSG antikorları ile protokol gerçekleştirdiklerini, ancak poliklonal antikorlar bazen o kadar monoklonal antikorlar tercih edilmektedir diğer VSGs tanıyabilir. VSG kimliği VSG 3&#39;UTR ve eklenmiş lider korunmuş dizilerinin amplifikasyonu elde edilen dizi VSG cDNA tarafından belirlenebilir. Belirli bir antikor, daha önce açık izole ilgili özgüllük bakımından test edilebilirSadece açıklandığı gibi VSG kimliğini hücreleri tespit edilmiştir. Burada sunulan protokol bir takım avantajlara sahiptir. Daha sonra analiz için anahtarlayıcıları izole etmek ve belirli bir popülasyonda anahtarlama sayısını ölçmek için de kullanılabilir. Aynı zamanda, uzun bir antikor bu varyant için uygun olduğu gibi, ilgi konusu özel bir varyantını izole etmek için kullanılabilir. Kırmızı kan hücreleri, üreticinin protokolüne uygun olarak, anti-Ter119 kaplı manyetik boncuklar kullanılarak giderilmiştir koşuluyla, aynı zamanda hayvanların izole tripanozomlarına kullanarak bu protokol gerçekleştirmek mümkündür. Biz gerekli tripanozomlann sayısının alt sınırı test değil, ama biz başarıyla 2.5 kullanarak protokol gerçekleştirdiklerini - kan 250 ul gelen 10 milyon tripanozomlann. Son olarak, iletişim kuralı, belirli bir popülasyonda anahtarlama frekansı elde etmek için dalgalanma analizi ile bağlantılı olarak kullanılabilir. izolasyon prosedürü oldukça fAST, 3 alarak - baştan 4 saat numune sayısına bağlı olarak tamamlamak ve böylece ilaç direnci markerleri içeren fareler veya özel soylarının önceden bağışıklığın gerek önceki yöntemlere göre daha verimli olduğu için. yöntem, başlangıç ​​VSG karşı oluşan antikorlar, ancak gerekli olması ile sınırlıdır. Bu tür reaktif olmadan, böyle VSG-seq olarak alternatif bir yöntem VSGs belirli bir nüfus 10 olarak ifade edildiği ölçmek için daha uygun bir seçim olabilir.

Protozoon parazit, Trypanosoma brucei, Sahra-altı Afrika boyunca (Trypanosoma brucei brucei aracılığıyla) ve hayvanlar (Trypanosoma brucei gambience ve Trypanosoma brucei rhodesiense aracılığıyla) insanları etkileyen bir hastalık etkenidir. Bu çeçe sineği vektörünün tükürük yoluyla memeli konakçıda iletilir. İnsan ve Hayvan Afrika tripanosomyası Hem endemik bölgelerde ciddi bir ekonomik yük getiren ve birkaç ilaç mevcuttur ya da iki hastalığın tedavisi için geliştirilmektedir. Bağışıklık kaçırma mekanizmalarının anlaşılması trypanosomiasis için ilaçların geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Parazit kapsayan yoğun Variant Yüzey Glikoprotein (VSG) kat antijenik varyasyon birincil aracı biri olan T. brucei, memeli antikor tepkisini kaçınır. ~ 15 Expres VSG geninin yaklaşık olarak 2.000 varyantları tripanosom genomuna vardır, ama sadece bir birinden belirli bir zamanda transkripsiyonusion siteleri. Ifade VSG &#39;geçiş&#39; aktif ifadesi sitesine bir VSG genini kopyalayarak, veya (1 gözden) daha önce sessiz ifade sitenin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla gerçekleşebilir. Çok iş T. anlamak antijenik varyasyon ayrılmış olmasına rağmen brucei, anahtarlama frekansı etkileyen faktörler hala tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar anahtarlama in vitro davranışsal oluşurken, anahtarlama frekansları yaklaşık 10 6 hücre 2 içinde 1 mertebesinde, çok düşük olduğu gerçeği ile engellenmiştir. Bu anahtarlama ilk etapta tespit etmek zor olduğundan, belirli bir faktör artar veya anahtarlama frekansını azaltır olmadığını ölçmek zor hale getirir. 2009 öncesinde, belirli bir nüfusta anahtarlayıcıları izole etmek için yöntemler uzun ve emek yoğun. Bunlar arasında baskın VSG karşı aşılanmış farelerde ile tripanozomlarına pasaj ve daha sonra hücreler toplandıBir gün sonra 3 veya immünofloresan 4,5 ile hücrelerin yüzlerce sayma. Ilaç direnci anahtarlayıcıları 6 izole etmek için başka bir strateji seçimi dayanmaktadır. In vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomlar tipik bir büyük varyant ve alternatif varyantları ifade switcherlar çok daha küçük bir nüfusa ifade büyük bir nüfus oluşuyor, çünkü biz baskın, başlangıç VSG olarak bu yazıda boyunca büyük varyantı bakın. Bunu yaparken, biz hiçbir şekilde bu önemli varyant popülasyonda diğer varyantları daha fazla uygunluk olduğunu ima etmek istiyoruz. 4 saat - Burada güvenilir 3 belirli bir nüfusta bir dominant olmayan VSG ifade tripanozomlann sayısını ölçebilen bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir belirli bir genetik manipülasyon ya da ilaç tedavisi popülasyonda açık hücrelerin sayısını artırır olmadığını belirlemek istediğinde için özellikle yararlıdır. Bunun yerine do ifade hücrelerinin nüfusu riddingminant ilaç ile VSG başlayan ya da immünolojik vasıtasıyla, bu hücreler önce, bir manyetik sütun üzerinde izole hâkim VSG karşı antikora bağlanmış manyetik boncuk ile kaplanması ve ortadan kaldırılmıştır. anahtarlamalı nüfus daha sonra akış yoluyla toplanan ve kirletici tanımlamak için bir fluorofor etiketli anti-VSG antikoru ile tekrar lekeli. Niceleme hücrelere tanelerin oranı belirlenir ve nüfus 7 anahtarlama sayısını ölçmek için kullanılabilir, böylece her bir örnek için, mutlak sayaç boncuk belirli sayıda ekleyerek elde edilir.

<table><tbody><tr><td>unlabeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>fluorophore labeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>HMI-9 media</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 is made in house</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute counting beads</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnetic separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>vortex adapter-60</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer analysis software</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Burada anlatılan yöntemi nüfusu 8 switcherlar sayısını artırdı VSG ifade site içinde bu çift iplikli tatili göstermek için kullanılmıştır. Burada, aynı ifade yerinde bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan olan tripanozomlann bir nüfusa temsilcisi sonuçlarını gösterir. Biz bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan edilmemiş olması olanlara bu tripanozomlann karşılaştırın. 1 akış-geçen manyetik aktive hücre sıralama kolondan toplanan un-uyarılmış ve isteyerek hücrelerden araziler sitometri temsili akışını göstermektedir. Bu özel deney için baskın başlangıç ​​VSG VSG2 oldu. Şekil 1A sol panelleri ileri göstermek ve giriş kapıları, canlı hücrelerin karakteristik bir ileri ve yan dağılım imza göstermek mutlak sayım boncuk ve hücrelerin etrafında çizilmiş sağlar yan dağılım. Not kapıları olabilir kiölü hücreler PI boyama ile elimine edilebilir, çünkü daha fazla hücre içerecek şekilde çizilebilir; Bununla birlikte, kapak, tüm numuneler için aynı tutulmalıdır. Şekil 1A sağ panelleri sol panellerde &#39;Canlı&#39; kapısı giren sadece bu hücreleri göstermektedir. PI (Q1 ve Q2) için pozitif leke Hücreler ölü hücrelerdir. 3. çeyrekte PI pozitif baskın VSG ve olumsuz leke Hücreler kirletici vardır. hem PI ve Q4 baskın VSG için olumsuz leke Hücreler açtınız canlı hücrelerdir. Bir Q3 kirleticilerin yüzde çift iplikli sonu kaynaklı olmuştur bu hücreler için daha düşük olduğunu gözlemleyebiliriz. Ancak, Q3 yüzdeler belirli bir nüfusta daha fazla switcherlar olup olmadığını anlaması için kullanılamaz. Sadece tek bir anahtarlama frekansı hesaplayabilir toplanan tanelerin sayısı Q4 hücrelerin sayısının oranı ile karşılaştırmaktır. Tablo 1 flo elde numaralarını gösterirw sitometri araziler ve yöntem bu popülasyonlarda yüzde anahtarlayıcıları hesaplamak için. Bu hesaplamalar Şekil 1B görüntülenen gözlenen sviçleme frekansları elde etmek için 3 biyolojik örnekler üzerinde yapıldı. Dominant olmayan VSG açtınız 6 x 10 -3 hücrelerinde - 1 bir kırılma sonuçlarını indükleyici ederken, 9.53 x 10 -5 ortalama burada hesaplanan in vitro stokastik geçiş seviyesi oldukça düşüktür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715fig1.jpg" /> Şekil 1. İzolasyon ve Anahtarlamalı Trypanosome Populasyonlarının miktarının belirlenmesi. (A), bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif kolonu üzerinde olmayan anahtarlama seçimi şu akış fraksiyonunda tripanozomlarına fraksiyonlarını gösteren akış sitometri bulunmaktadır. indüklenmiş bir I-SceI çift iplikli kesmeli bir hücre popülasyonu indüklenmiş bir bre olmayan hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığındaak. (B) ya da I-SCEI çift sarmallı bir mola ile uyarılan edilmemiş hücreler için anahtarlama frekanslarını hesaplanmıştır. arsa üzerinde sayı iki kuyruklu, eşsiz T testinin sonuçlarını temsil eder. Hata çubukları SD temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Company Dosya 1. Akım Sitometri Hesaplamalar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715tbl1.jpg" /> Tablo Anahtarlama Frekansları 1. hesaplanması. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

8.7K Görüntüleme.  Rockefeller University. African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Video: Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biyoloji

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.

Ince Iğne aspirasyonu ile Ekstrasovasküler Trypanosoma parazitlerin tespiti

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH için pHluorin2 Tabanlı Sensörün Geliştirilmesi

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Yazar Spotlight: pHluorin2 Biyosensörü Kullanılarak Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH İzlemedeki Gelişmeler

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi