Name: detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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Wir möchten, dass George Cross für allgemeine Hinweise auf Trypanosomen Biologie anzuerkennen. Diese Arbeit wurde auch durch eine Bill and Melinda Gates Foundation GCE Zuschuss DS, ein NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) zu MRM und ein NIH / NIAID (Erteilungs # AI085973) zu FNP unterstützt. Wir danken Galadriel Hovel-Miner für die Verwendung des Stammes der I-SCEI-Gen und Erkennungsstelle enthält.

ANMERKUNG: In dem Verfahren ist es notwendig, Zellen auf Eis zu halten. Kalte Medien sollten auch überall eingesetzt werden. 1. Probenernte <ol><li> Wachsen Lister-Stamm 427 Blutstrom Trypanosomen zu einer Dichte von 0,5 bis 1.000.000 / ml. Es ist am besten Kulturen mit einer kleinen Anzahl von Parasiten zu starten. Spin down 50 x 10 6 Zellen / Probe für 10 min bei 1500 x g. Achten Sie darauf , 1 x 10 6 Zellen in Kultur zu verlassen , für später als positive und negative Antikörper - Steuerelemente verwenden. Hinweis: Dieses Protokoll kann auch auf aus Tierblut (siehe Diskussion für weitere Details) isoliert Trypanosomen verwendet werden. </li><li> Pipette oder schütten die meisten Überstand aus (lassen Sie etwa 750 &amp; mgr; l). Transfer der Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin-Zellen bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg in einer Mikrozentrifuge und entfernen Überstand. </li></ol> 2. Magnetische Labeling <ol><li> Die Zellen in 150 &amp; mgr; l Kulturmedium (HMI-9 with Serum zum Beispiel) + primäre anti-VSG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnung. HINWEIS: Die Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Es ist wichtig, eine primäre anti-VSG-Antikörper zu verwenden, die nicht mit einem Fluorophor markiert ist. </li><li> Vortex-Zellen einen Wirbel-Adapter-60 bei der Geschwindigkeit 6 unter Verwendung von - 10 min 8 in einem kalten Raum bei 4 ° C. Waschen mit 800 - 1000 ul kalten HMI-9 mit Serum. </li><li> Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und den Überstand absaugen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und wie oben drehen. Den Überstand aspirieren. Pellet in 100 ul HMI-9 mit Serum. </li><li> Hinzufügen, 110 &amp; mgr; l magnetischen aktivierte Zellsortierung (MSC) Mikrokügelchen. Verwenden Sie Anti-Maus, anti-Kaninchen oder Anti-Biotin-Perlen als geeignet für den primären anti-Antikörper VSG. Gut mischen. Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Während Zellen werden verwirbelt, stellen eine Magnet-aktivierte Trennsäule / Probe auf einem Trennmagneten auf. Achten Sie darauf, eine erneute habenceptacle (wir verwenden, um eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen) unter der Spalte, die den Durchfluss zu sammeln. Stellen Sie das Gerät in einem kalten Raum. </li><li> 2 ml HMI-9 mit Serum zu grundieren Spalte. Nach der Grundierung Ort ein 15 ml Zentrifugenröhrchen unter dem Säulendurchfluss von jeder Probe zu sammeln. </li><li> Nach der 10-minütigen Inkubation in Schritt 2.4, fügen 800-1000 ul kalten HMI-9 mit Serum. Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und repeat 100 ul des Überstands zu verlassen. </li><li> Flick das Zentrifugenröhrchen kräftig und visuell inspizieren das Rohr, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig suspendiert. 1 ml der HMI-9 mit Serum und Pipette auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen sind gut suspendiert. </li></ol> 3. Magnetische Trennung <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Spalten grundiert werden, wie oben beschrieben. Anwenden Zellen Spalte. Sammeln der Durchströmung mit Zellen, die die nicht-dominante VS exprimierenG. 1 ml Medium + Trypanosomen dauert in der Regel 6 bis 7 min durch die Säule zu fließen. </li><li> Wasch 2x mit 1 ml HMI-9 mit Serum und zu sammeln, wie in Schritt 3.1 in dem gleichen Rohrdurchströmung. </li><li> Divide Durchfluss (3 ml) in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Diese später kombiniert werden können , oder die Hälfte kann verwendet werden , um RNA zu isolieren, usw. </li><li> Entfernen Sie Spalte von Magneten. 3 ml HMI-9 mit Serum-Säule und tauchen Sie Säule in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen Zellen zu erhalten, die die Ausgangs, dominant VSG auszudrücken. Entfernen 300 ul eluierte Material für eine spätere Analyse. Bewahren Sie diese Zellen auf Eis. </li><li> Zur Verwendung als positive und negative Kontrolle nehmen etwa 1 Million Zellen aus der Ausgangskultur von Kontrollzellen bei 37 ° C wachsen und Pipetten sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (die nicht zu wechseln häufig erwartet). HINWEIS: Positive Kontrollzellen werden mit Fluorophor-markierten Antikörper in Schritt 4.1 gefärbt werden. Negative Kontrollzellen REMAin für den Rest des Protokolls ungefärbt. </li><li> Spin Durchflussproben und positive Kontrollprobe Antikörper bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen. HINWEIS: Weitere 300 &amp; mgr; l Aliquot von eluierten Zellen können als positive Kontrolle für die Anti-VSG-Färbung verwendet werden. </li></ol> 4. Die Färbung zu identifizieren Fremd- und Switcher <ol><li> Resuspendieren Durchflussproben und positive Kontrollzellen in 100 ul HMI-9 mit Serum + primären, Fluorophor-markiertem, anti-VSG Antikörper bei der geeigneten Verdünnung. HINWEIS: Die markierten Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1: 1000. Der Fluorophor-markierten, anti-VSG können aus der gleichen Quelle wie die unmarkierten Antikörper in der Trenn MACS step.There 3 ml Durchfluss Probe in zwei Mikrozentrifugenröhrchen folgenden Schritt 3.5 sein sollte. </li><li> Um alle Durchfluss mittels Durchflusszytometrie, vereinige die Pellets in den beiden Mikrozentrifugenröhrchen analysieren, während erneut susdie Proben in 100 ul anhängiger HMI-9 mit Serum + anti-VSG-Antikörper. Gut mischen. </li><li> Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min. In 800 - 1000 ul kalt HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen. </li><li> Wasche die Zellen mit 1 ml von HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen. Während dieser letzten Spin, drehen die eluierten-Proben aus Schritt 3.4 nach unten und der negativen Kontrollprobe. </li><li> Resuspendieren alle Flow-Through und eluierten Proben in: 148,5 ul HMI-9 mit Serum, 25 &amp; mgr; l absolute Zählen Perlen und 1,5 ul Propidiumiodidfärbung Lösung (175 ul insgesamt). Resuspendieren positive und negative Antikörper Kontrollproben in 175 &amp; mgr; l HMI-9 mit Serum. Achten Sie darauf, die Zahl der absoluten Zählen Perlen / 25 &amp; mgr; l für die jeweilige Menge zur Aufzeichnung. </li><li> Führen Sie alle Proben durch einen Durchflusszytometer und sammeln Daten. Tote Zellen anfärben als PI <sup&gt; +. Verunreinigungen Fleck als PI - VSG +. Switcher Fleck als PI - VSG - 8. </li><li> Berechnen Schaltfrequenzen mit Hilfe der Durchflusszytometrie Daten. HINWEIS: Für Anweisungen, wie Schaltfrequenzen zu berechnen, finden Sie in der Zusatzdatei <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Flow Cytometry Calculations.docx</a> und Tabelle 1. </li></ol>

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	<li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular &amp; Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li><li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li><li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei.">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li><li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections.">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li><li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li><li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro.">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li><li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).</li><li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei.">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li><li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes.">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li><li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei.">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In Bezug auf experimentelle Technik, die kritischste Komponente des Protokolls hält alle Proben kalt. Trypanosomen internalisieren sehr rasch Antikörper an ihre Oberfläche gebunden 9, aber dieser Prozess ist Motilität abhängig und beeinflussen nicht den Test, solange die Zellen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Alle Proben sollten immer auf Eis gehalten werden, und Pipettieren sollte schnell Exposition zu minimieren, um die 25 ° C Laborumgebung durchgeführt werden. Kalt HMI-9 mit Serum sollte zu Beginn des Experiments verfügbar sein und sollten während auf Eis gehalten werden. Die Isolierung der Trypanosomen, indem sie über die Säule läuft, muss in einem kalten Raum durchgeführt werden, wie es dauert 5 bis 7 min eine 1 ml Probe durch die Säule laufen. Wenn es mehr Proben als magnetische Trennung Einheiten zur Verfügung, magnetische Trennung sind, können in der Reihenfolge durchgeführt werden, solange Proben nicht aktiv getrennt werden auf Eis gehalten werden. Es ist auch wichtig, dass die Proben sehr gut gemischt af seinter der letzten Waschung nach der Inkubation mit den Mikrokügelchen und vor der Isolierung auf dem Magneten. Dies kann durch aggressive Schnippen des Zentrifugenröhrchens oder leichte Verwirbelung erreicht werden. Keine Pellets oder Klumpen von Zellen sollten vor der Zugabe der Probe in die Trennsäule sichtbar sein, was durch einen Blick auf die Lichtmikroskopie Ebene überprüft werden kann. Wenn Klumpen vorhanden sind, ist das Niveau der Verunreinigung in der Durchfluss Probe von Zellen, die dominant VSG exprimierenden Regel deutlich höher als wünschenswert. Wenn für die Anzahl von Umschaltern in der Probe am Ende des Protokolls, die Berechnung durchgeführt wird, ist es wichtig, zu berücksichtigen, ob alle Durchfluss für die durchflusszytometrische Analyse verwendet wurde oder ob die Hälfte verwendet. Wenn nur die Hälfte verwendet wurde, sollte die Gesamtzahl der Umschaltern berechnet mit 2 multipliziert werden. Wenn der Überstand während der Waschschritte entfernt wird, ist es nicht notwendig, den letzten Tropfen zu pipettieren ab, und in der Regel 15 bis 25 &amp; mgr; l sindlinks des Pellets von Zellen umgibt. Dies ist besonders kritisch während der Endphase der Färbung und Waschen, weil an dieser Stelle Pellets selten in den Strömungsdurch Proben gesehen werden, weil es so wenige geschalteten Zellen sind. Während die endgültige Anti VSG Fleck typischerweise mit gereinigtem, Fluorophor-markierten Anti-Antikörper VSG, das erste Anti-VSG Fleck vor der magnetischen Trennung kann getan werden, mit gereinigter Antikörper oder Serum durchgeführt wird. Wir haben auch Bioreaktor Überstand, abgeleitet von Hybridomen exprimiert anti-VSG Antikörper verwendet. Egal, das Material für den ersten Fleck verwendet wird, muss titriert werden gute Trennung der Zellen zu gewährleisten, die tun oder nicht äußern die dominant, beginnend VSG. Es ist typisch für die Population von Zellen in der Durchfluss mit Zellen kontaminiert werden, um die dominante VSG ausdrückt. Während diese Kontamination sollte minimal sein, in unserer Erfahrung ist es selten, dass die Bevölkerung völlig von Zellen frei zu sein, zum Ausdruck bringening die dominante VSG. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Zellen, die durch das Isolationsverfahren gegangen sind nicht so hell mit Anti-Antikörper VSG als diejenigen Fleck, der nicht durch das Verfahren gewesen. Wir vermuten, dass zwei Dinge für diesen Unterschied erklären könnte. Der erste ist, dass Trypanosomen führt zu vergießen von VSG, und es gibt viele Spins, die an der Isolationsverfahren Spinnen. Dies würde erwartet werden, um die Intensität des Signals für den letzten anti-VSG stain zu verringern. Die zweite ist, dass der erste Schritt des Protokolls Anfärbung mit einem primären anti-VSG-Antikörper beinhaltet. Wenn die durch den Antikörper erkannten Epitope in diesem ersten Schritt gleich oder okkludieren die erkannten Epitope durch den Antikörper in der endgültigen stain werden verwendet, würde man die Intensität des Signals erwarten, daß sie niedriger ist als wenn nur ein Antikörper verwendet wurden. Aus diesem Grund ist es wichtig, den Antikörper zu titrieren, die in dem letzten Schritt verwendet wird, so dass das Signal von einem positiv gefärbte Zelle ungefähr zwei istGrößenordnungen höher als bei einem negativ gefärbten Zelle. Auf diese Weise, selbst wenn die Intensität des Signals von einer positiv Anfärben Zelle wird in Zellen verringert, die das Isolierungsverfahren unterzogen wurden, werden diese positiven Zellen noch gut von den negativen Zellen auf der Durchflusszytometrie Stück getrennt werden. Wenn die automatische Kompensation verwendet wird, sollte einzelne Fleck Kontrollproben hergestellt werden. Antikörper, die wir erzeugt haben, sind für den Kauf von Memorial Sloan Cancer Center monocolonal Antikörper-Anlage zur Verfügung. Wir haben mit der Verwendung von unmarkierten monoklonalen IgG-Antikörper den besten Erfolg hatte. Wir haben das Protokoll mit polyklonalen Antikörpern VSG durchgeführt, jedoch polyklonale Antikörper können gelegentlich andere VSGs erkennen, um monoklonale Antikörper bevorzugt sind. VSG Identität kann aus der Amplifikation von konservierten Sequenzen in der VSG 3&#39;UTR und die gespleißten Leiter erzeugt durch Sequenzierung VSG cDNA bestimmt werden. Ein besonderer Antikörper kann auf zuvor isolierten geschaltet Spezifität getestet werdenZellen, die VSG Identität wurde, wie gerade beschrieben bestimmt. Das Protokoll hier vorgestellte hat eine Reihe von Vorteilen auf. Es kann sowohl zu isolieren Umschaltern für die spätere Analyse verwendet werden, und die Anzahl von Umschaltern in einer gegebenen Population zu quantifizieren. Es kann auch eine spezielle Variante von Interesse, solange ein Antikörper verfügbar ist für diese Variante zu isolieren, verwendet werden. Es ist auch möglich, dieses Protokoll Trypanosomen auszuführen isoliert von Tieren, mit der Maßgabe, dass rote Blutzellen Anti Ter119 eliminiert unter Verwendung unter Verwendung von beschichteten magnetischen Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wir haben nicht die untere Grenze für die Zahl der Trypanosomen erforderlich getestet, aber wir haben erfolgreich das Protokoll unter Verwendung von 2,5 durchgeführt - 10 Millionen Trypanosomen von 250 ul Blut. Schließlich kann das Protokoll in Verbindung mit der Fluktuationsanalyse verwendet werden, um die Frequenz des Schaltens in einer gegebenen Population zu erhalten. Das Isolierungsverfahren ist ziemlich fast, wobei 3 bis 4 Stunden vom Start in Abhängigkeit von der Anzahl von Proben zu beenden, und somit ist effizienter als frühere Verfahren, die vor der Immunisierung von Mäusen oder spezielle Stämme enthaltenden Arzneimittelresistenzmarker erforderlich. Das Verfahren ist durch die Tatsache begrenzt, dass Antikörper gegen das Ausgangs VSG erforderlich sind, jedoch. Ohne eine solche Reagenzien, ein alternatives Verfahren wie beispielsweise VSG-seq könnte eine geeignetere Wahl zu messen sein , die VSGs in einer gegebenen Population 10 ausgedrückt werden.

Der einzelliger Parasit, Trypanosoma brucei, ist ein Erreger von Krankheiten , die Menschen (über Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense) und Tiere (über Trypanosoma brucei brucei) in ganz Afrika südlich der Sahara beeinflussen. Es ist dem Säugetierwirt durch den Speichel der Tsetse-Fliege Vektor übertragen. Mensch und Tier afrikanischen Trypanosomiasis eine schwere wirtschaftliche Belastung in Endemiegebieten verursachen, und nur wenige Medikamente zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung entweder Krankheit zu behandeln. Mechanismen der Immunumgehung zu verstehen, ist für die Entwicklung von Medikamenten für Trypanosomiasis kritisch. Antigenic Variation der dichten, Variant Oberflächen Glycoprotein (VSG) Mantel, der den Parasiten abdeckt , ist eine der wichtigsten Mittel , durch die T. brucei ausweicht die Säugetier-Antikörper - Reaktion. Ca. 2.000 Varianten des Gens VSG bestehen in Trypanosomen Genom, aber nur einer wird zu einem gegebenen Zeitpunkt transkribiert von einer ~ 15 Expression Websites. &#39;Switching&#39; des exprimierten VSG kann entweder durch Kopieren eines VSG - Gens in den aktiven Expressionsstelle oder durch die Transkriptionsaktivierung eines zuvor stillen Expressionsstelle ( beschrieben in 1) auftreten. Obwohl viel Arbeit zum Verständnis der Antigenvariation in T. gewidmet brucei, die Faktoren, die Frequenzeinfluss Schalt sind noch kaum verstanden. Bisherige Untersuchungen wurden durch die Tatsache erschwert , dass , während Schalt stochastisch in vitro auftritt, Schaltfrequenzen sehr niedrig sind, in der Größenordnung von 1 in etwa 10 6 Zellen 2. Dies macht es schwierig zu messen, ob ein gegebener Faktor erhöht oder Schaltfrequenz abnimmt, da Schalt hart ist in erster Linie zu detektieren. Vor 2009 Methoden für Switcher in einer bestimmten Population zu isolieren waren langwierig und arbeitsintensiv. Dazu gehörten Passagierung Trypanosomen durch immunisierten Mäuse gegen die herrschende VSG und dann erntet Zelleneinen Tag später 3 oder Hunderte von Zellen durch Immunofluoreszenz 4,5 zu zählen. Eine andere Strategie stützt sich auf Auswahl für Medikamentenresistenz zu Switcher 6 isolieren. Da African in vitro gezüchtet Trypanosomen typischerweise aus einer großen Population gemacht werden eine wichtige Variante ausdrückt, und eine viel kleinere Population von Switcher ausdrücken alternative Varianten, verweisen wir auf die Hauptvariante in diesem Papier als dominant, beginnend VSG. Dabei wir in keiner Weise andeuten wollen, dass diese wichtige Variante mehr Fitness als andere Varianten in der Bevölkerung hat. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Anzahl der Trypanosomen Expression eines nicht-dominanten VSG in einer bestimmten Population in 3 zuverlässig messen kann - 4 Std. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn man will, ob eine bestimmte genetische Manipulation oder medikamentöse Behandlung zu ermitteln, die Anzahl von geschalteten Zellen in einer Population erhöht. Anstatt die Population von Zellen zu befreien, die do ausdrückenminante, beginnend VSG durch Drogen oder durch immunologische Mittel werden diese Zellen durch diese zuerst mit magnetischen Kügelchen Beschichtung eliminiert gekoppelt Antikörper gegen das dominante VSG und dann auf einem Magnet Säule isoliert. Die geschaltete Population wird dann in der Durchströmungs gesammelt und wieder gefärbt mit einem Fluorophor anti-VSG markierten Antikörper Kontaminanten zu identifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch Zugabe einer definierten Anzahl von absolute Zählung beads zu jeder Probe erreicht , so daß das Verhältnis der Kügelchen zu den Zellen bestimmt und verwendet werden können , um die Anzahl von Umschaltern in der Population 7 zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>unlabeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>fluorophore labeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>HMI-9 media</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 is made in house</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute counting beads</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnetic separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>vortex adapter-60</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer analysis software</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Die hier beschriebene Methode wurde verwendet , die Doppelstrangbrüche in der VSG Ausdruck Website zu demonstrieren stieg die Zahl der Switcher in einer Population 8. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus einer Population von Trypanosomen, die einen Doppelstrangbruch an der Expressionsstelle ähnlich induziert zu erzeugen wurden. Wir vergleichen diese Trypanosomen zu denen , die einen Doppelstrangbruch zu erzeugen , wurden nicht induziert. Abbildung 1 zeigt repräsentative Durchflusscytometrie Plots aus un-induzierten und induzierten gesammelten Zellen in Durchströmrichtung von der Magnet aktivierte Zellsortierung Spalte. Für dieses spezielle Experiment war die dominierende Ausgangs VSG Vsg2. Die linke Platten aus 1A zeigen nach vorn und Seitenstreuung, die Tore ermöglicht rund um die absolute Zählen Perlen und Zellen gezogen werden , die eine Vorwärts- und Seitenstreu Unterschrift zeigen , die charakteristisch für lebende Zellen ist. Beachten Sie, dass Gates könnengezogen werden, um mehr Zellen, weil tote Zellen umfassen kann mit PI-Färbung beseitigt werden; jedoch muss die Gate die gleiche für alle Proben gehalten werden. Die rechten Platten aus 1A zeigen nur jene Zellen, die auf den linken Platten innerhalb der &quot;Live&quot; Tor fallen. Zellen, die positiv für die PI (Q1 und Q2) sind tote Zellen färben. Zellen, die positiv für die dominante VSG und negativ für PI in Q3 Fleck sind Verunreinigungen. Die Zellen, die sich negativ sowohl für PI und der dominanten VSG in Q4 sind lebende Zellen anfärben, die eingeschaltet haben. Man kann beobachten, dass der prozentuale Anteil der Verunreinigungen in Q3 niedriger für diese Zellen ist, wenn ein Doppelstrangbruch induziert wurde. Jedoch können die Prozentsätze in Q3 nicht verwendet werden, zu folgern, ob es mehr Umschaltern in einer gegebenen Population sind. Es ist nur durch das Verhältnis der Anzahl der Zellen in Q4 zu der Anzahl der Perlen zu vergleichen gesammelt , dass eine Schaltfrequenzen berechnen kann. Tabelle 1 zeigt die Zahlen aus der flo erhaltenw-Zytometrie Plots und das Verfahren die Prozent-Switcher in diesen Populationen zu berechnen. Diese Berechnungen wurden auf drei biologische Proben durchgeführt , um die beobachteten Schaltfrequenzen in 1B angezeigt zu erhalten. Die Höhe der stochastischen Schalt in vitro ist sehr gering, da hier berechnet bei einem Durchschnitt von 9,53 × 10 -5, während eine Pause Ergebnisse in 1 induzieren - 6 x 10 -3 Zellen, die mit dem nicht-dominanten VSG eingeschaltet haben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715fig1.jpg" /> Abbildung 1. Isolierung und Quantifizierung von Switched Trypanosomenpopulationen. (A) Die Durchflusszytometrie Fraktionen von Trypanosomen in der Durchflussfraktion folgende Auswahl von nicht-Switcher auf einem Magnet aktivierte Zellsortierung Säule zeigt. Eine Population von Zellen mit einer induzierten I-SCEI Doppelstrangbruch wird ohne eine induzierte bre auf eine Population von Zellen im Vergleichak. (B) berechneten Frequenzen für Schaltzellen , die haben oder nicht mit einem I-SCEI Doppelstrangbruch induziert worden. Die Zahl auf dem Grundstück stellt die Ergebnisse einer zweiseitigen, ungepaarten T-Test. Die Fehlerbalken stellen SD. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Supplemental - Datei 1. Flow Cytometry Berechnungen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715tbl1.jpg" /> Tabelle 1. Berechnung der Schaltfrequenzen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

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Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

8.7K Aufrufe.  Rockefeller University. African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Serie: Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologie

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.

Nachweis von extravaskulären Trypanosoma Parasiten durch Feine Nadelaspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Entwicklung eines pHluorin2-basierten Sensors für den glykosomalen pH-Wert bei Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der glykosomalen pH-Überwachung bei Trypanosoma brucei mit dem pHluorin2-Biosensor

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Nachweis von

Zusammenfassung

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Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus