Name: using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1. Genel Trypanosome Yetiştiriciliği <ol><li> SDM79 ortamlarının hazırlanması (Tablo 1), katı madde tartılır. </li><li> 4 50 ml konik ° C veya bir plastik torba saklayınız. NOT: Reaktifler, en az 6 ay stabildir. </li><li> Çözülme fetal inek, bir 37 ° C su banyosunda serumu (FBS) ve tersine periyodik olarak karıştırın. NOT: FBS steril bir çözelti olarak tedarikçiden alınır. FBS sterilize parazit büyümeyi desteklemek kabiliyetini azaltır. </li><li> Tüm şişe çözülmüş sonra, ısı serum bileşenlerinin çökelmesini azaltmak için periyodik karıştırma, 56 ° C su banyosu içinde 30 dakika boyunca serum etkisiz hale getirirler. </li><li> Çözülme penisilin / streptomisin solüsyonu (pen / strep), Hemin (50 mM NaOH içinde 2 mg / ml), ve oda sıcaklığında bazal ortam kartal vitamin çözeltisi. </li><li> 1.000 ml&#39;lik dereceli bir silindir için, sıvı bileşenler (Tablo 2) SDM79 katı (Tablo 1) 20.2 g &#39;ını ve bir karıştırma levhası üzerinde iyice karıştırın. </li><li> 7,35 pH ayarlayın ve su ile 850 ml hacim getirmek. </li><li> Filtre bir filtre şişe altına bir vakum hortumu takarak ortamı sterilize. Çözelti filtre kadar vakum uygulayın. </li><li> Biyogüvenlik kabini filtre üst çıkarın ve FBS ısı 150 ml ekleyin. Steril kap ve mühür medya şişe plastik kaplamayı çıkarın. </li><li> Aşağıdaki istisnalar dışında SDM79 gibi aynı şekilde SDM80 ortamını hazırlayın; glikoz veya glukozamin ekleyebilir ve glutamin olmadan MEM kullanmayın. FBS, ısı 150 ml yerine, 135 diyalizlenmiş FBS, ısı ml ve FBS, ısı 15 ml ilave ediniz. </li><li> 27 ° C de, 10 ml bir uygun ortam ile 25 cm2 şişeye ve% 5 CO2 Kültür PCF parazitleri. Not: Hücreler bir hemositometre sitometresi veya bir akışı kullanılarak günlük olarak kabul edilmelidir (bölüm 6) ve kültürler 1 x 10 5 ve 5 x 10 6 hücre / ml arası bir yoğunlukta muhafaza edilmesi gereklidir. </li></ol> 2. TrFloresan Raportörü Yapısının ile PCF Parazitlerin ansfection Not: geliştirilmiş sarı floresan proteinine aldolaz peroksisomal hedefleme sekansı (PTS2) ihtiva eden bir raportör proteini parazitler olarak ifade edilir, glycosome dinamikleri izleyin. Füzyon proteini kodlayan sekansı procyclin promotörünü ve tübülin intergenik bölgeleri, genom içerisine doğrudan homolog rekombinasyon ve seçilmesi için blasticidin direnç geni içeren pXS2bla 12 içine klonlanır. T7 polimeraz ve tetrasiklin bastırıcı (PF29-13) kodlayan genleri barındıran Procyclic hücre çizgileri hedefleme konstruktu, pXS2 ile transforme edilmiştir: PTS2eYFP. <ol><li> Tablo 3&#39;te sıralanan unsurların karıştırılması ile cytomix hazırlayın. Oda sıcaklığında sterilize etmek ve saklamak Filtre. </li><li> DNA (1 ug / ml), 5 ul sınırlayıcı enzim tamponu, 33 ul su, 10 ul pipetleme Mlul ile linearize plazmid DNA ve 2 μ, Bir mikrosantrifüj tüpüne Mlul enzim l. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Kısıtlama sınırlama enzimi sindirimi ve bağlama tamponu içinde 1 hacim ekleyerek sindirmek saflaştınlır. Vorteks yoluyla bağlayıcı tampon ve sindirilmiş DNA karıştırın. Kısaca tüpün altındaki örnek toplamak için santrifüj. </li><li> 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içine sütunu, DNA bağlayıcı bir ekleme, ve transfer sütuna bağlanma tampon çözeltisi / DNA ile sindirilmiş. </li><li> 1 dakika 10.000 xg için santrifüj. Santrifüj işleminden sonra toplama tüpünden süzüntü atın ve toplama tüpüne sütun dönmek. </li><li> 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de Dikenlikurt&#39;un yıkama tamponu ve santrifüj 700 ul ilave edin. </li><li> Toplama tüpünden atın süzüntü, toplama tüpüne sütun dönmek ve Dikenlikurt&#39;un yıkama adımı ve tekrar santrifüj. </li><li> 10,000 x g&#39;de 3 dakika boyunca atın Filtratın, toplama tüpüne geri sütun ve santrifüj boş kolon kalan etanolü atmak üzere. </li><li> Bir biyogüvenlik kabini içinde, col atmaksteril mikrosantrifüj tüpü içinde lection boru ve yer kolon. </li><li> , DNA elüt sütunu için steril su içinde 25 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek. 1 dakika 10.000 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Sütun biyo-güvenlik başlığı içinde steril su içinde bir 25 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1 dakika 10.000 xg hızda santrifüj. </li><li> Bir biyogüvenlik kabini içinde yeni bir steril mikrosantrifüj tüp DNA&#39;nın tüm hacim transferi. NOT: Bu adım santrifüj sırasında açık kapaktan kirlenmesini önler. </li><li> Filtre ve sterilize edilen cytomix 400 ul steril, saflaştırılmış, linearize DNA (10 ug) ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj ile 5 x 10 7 -10 8 hücrelerin bölüm 6&#39;da tarif edilen ve hasat gibi hücre sayımı. </li><li> Süpernatantı dökün ve 1 ml&#39;lik bir serolojik bir pipet kullanarak DNA + cytomix 450 ul hücre pelletini. </li><li> Ce içeren Transfer çözüm<html> rf, elektroporasyon odasında steril 4 mm boşluk küvet ve yer küvete DNA ve cytomix. </li><li> &quot;Üstel çürüme&quot; seçin ve elle aşağıdaki ayarları girin: Gerilim: 1.5 kV, Kapasitans: 25 mF, Resistance: Ω, ve Küvet: 4 mm. Basın darbe. Darbe tamamlandıktan sonra, elektroporasyon odasından küvet kaldırmak ve biyo-güvenlik kabini geri döner. </li><li> Yeni bir steril bir şişeye, pipet SDM79, 10 ml. SDM79 10 ml şişeye üzere dönüşmüş hücreleri aktarın. </li><li> 27 ° C,% 5 CO2 seviyesinde 24 saat süre ile ilaç seçim olmadan inkübe edin. 24 saat sonra, G418 (15 ug / ml), higromisin (50 ug / ml) ve blastisidin (ug / ml 10 ug) ilave edilir. Ilaç ile SDM79 9 ml ilaç ile dönüştürülmüş hücrelerin 1 ml geçirin. </li><li> Bölüm 6 ve 7 hücreleri, floresan içinde tanımlanan, ve x, 10 7/1 mi bir hücre yoğunluğuna ulaşıldığında gibi uzun süreli depolama (3.1-3.3) hale stabilates için, günlük hücreleri analiz edin. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Stabilates Yapımı <ol><li> Dondurma medya yapmak için sterilize cytomix ve filtre% 100 gliserol eşit hacimde ekleyin. </li><li> Kriyotüpe hücre 800 ul (1 x 10 7) benzer şekilde dondurma ortamı 200 ul, iki raf arasında köpük inversiyon ve yerine göre, yavaşça karıştırın ve -80 ° C&#39;de dondurun. </li><li> (~ 24 saat) sonra, donmuş sıvı nitrojen transfer hücreleri. NOT: C hücre yaşamı sürdürme kabiliyetinde bir azalmaya yol açmaktadır ° -80 Bu daha uzun depolama gibi, 24 saat sonra 2 LN hücreleri içine taşımak için önemlidir. </li></ol> 4. Çözülme Dondurulmuş Stoklar <ol><li> Yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında C ve -80 ° &#39;den çözülme dondurulmuş şişesinden çıkarın. </li><li> Yeni bir steril şişe içine ilaç ile SDM79 Pipet 9 mi. Bu şişeye, çözülmesi hücreleri ekleyin. (1 x 10 5 ug / ml nihai konsantrasyon), yeni bir şişe içinde SDM79 9 ml bu kültürün 1 ml ilave etmek suretiyle hücreleri 01:10 geçirin. </li><li> Hücreler, 10 7 / ml &#39;lik bir yoğunluğa ulaşmadan önce, sitometresi set başlaryukarı ve seyreltme testleri. </li></ol> 5. Cytometer Kur <ol><li> Sitometrede akış açın ve cflow Artı programını açın. NOT: Herhangi bir örnek çalıştırmadan önce, fluidik adımlar 5,2-5,7 göre akıtmaya ve durulanmalıdır. </li><li> SIP boş bir tüp ile depolandığı Nanopure suyun tüp değiştirin. </li><li> &quot;Backflush&quot; düğmesini seçin. </li><li> Backflush tamamlandıktan sonra, yudum ve ıskarta gelen mikrosantrifüj tüpü çıkarın. </li><li> Yudum yeni Nanopure su 1 ml ihtiva eden yeni bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Cflow programda yeni bir kuyu seçin. &quot;Çalıştır Sınırları&quot; altında 2 dakika için zaman ayarlayın. &quot;Fluidics&#39;in&quot; altında &quot;hızlı&quot; ve &quot;Çalıştır&quot; seçeneğini seçin. </li><li> 2 dakikalık bir zaman sınırı tamamlandıktan sonra, &quot;Örnek Verileri Sil&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol> Akış Sitometreyi kullanarak 6. Hücre Sayım <ol><li> Numune su yerine sayılacak. &quot;SetRun Sınırları &quot;30 sn,&quot; hızlı &quot;için&quot; Fluidics Çalıştır &quot;&quot; ve sonra seçin &quot;. </li><li> 30 sn zaman sınırı cflow, tam artı ul &quot;Son Çalıştır.&quot; Her kültür için tekrarlayın sayımı altında olayları / sağlayacaktır sonra. NOT: Hücreler, 1 x 10 7 hücre / ml ulaşmadan önce, seyreltme testi ile devam edin. Bir seyreltme deney tamamlandıktan sonra hücreler kesilmelidir. Uzun süreler boyunca kültüre hücreler çevre koşullarına yanıt yeteneğini kaybeder. </li></ol> Akış Sitometreyi kullanarak 7. Ölçme Floresan <ol><li> Floresan değerlendirmek için, 10.000 olaylar &quot;Run Limitleri&quot; ve &quot;yavaş&quot; için &quot;Fluidics&quot; olarak ayarlayın. &quot;Set eşiği&quot; seçeneğini seçin. &quot;Birincil Eşik&quot; altında (kutuda aşağı açılan), &quot;Sürekli olayları ortadan kaldırmak&quot; &quot;FSC-H&quot; seçin ve daha az 30,000 girin. Ardından &quot;kapatmak&quot;, &quot;uygulamak&quot; tıklayın. </li><li> Seçin220; Histogram &quot;yeni arsa pencerelerden birinde düğmesine basıp&quot; FSC-A FL1-A &quot;&quot; Açılır listeden itibaren, seçin &quot;. NOT: 530 nm dalga boyunda FL1-A önlemler floresan. </li><li> &quot;Çalıştır&quot; ı seçin ve tüm kültürler için tekrarlayın. </li><li> 2 dakika 2 dakika ve su için fluidik hattı ile çözüme temizleme çalıştırın. </li></ol> 8. Seyreltme Tahliller <ol><li> 25 cm 2 kültürü şişesinde SDM79 3 ml içinde 1 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir yoğunluğa hücrelerin Pass ve hemen geçtikten sonra ve daha sonra 3 saat ve 24 saat sonra floresans ölçer. </li></ol> 9. Veri Analizi <ol><li> Seçin cflow Plus sekmesi &quot;Analiz&quot;. </li><li> Click &quot;yeni bir komplo yapın.&quot; Seç &quot;FSC-A&quot; ve bir damla listesi altında &quot;Histogram&quot; düğmesi belirir. Kanal seç &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Analiz etmek için bir kuyu vurgulayın. &quot;Kapısı&quot; düğmesini seçin, ve elle bir kapı çizmekilgi nüfus için. </li><li> Akış Artı hücre bu kapı içinde &quot;Sayısı&quot; ve &quot;Bu Plot%&quot; sağlayacaktır. </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetoplastids:+related+protozoan+pathogens,+different+diseases.">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li><li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei.">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li><li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids:+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses.">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li><li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids.">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li><li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes,+glyoxysomes+and+glycosomes+(review).">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li><li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes:+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target.">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li><li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes.">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li><li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose.">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views.">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes.">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li><li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function,+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida.">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li><li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome.">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li><li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei.">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li><li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes.">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li><li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei:+RNA+interference+studies+of+PEX14,+hexokinase,+and+phosphofructokinase.">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li><li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li><li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li><li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose.">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li><li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei.">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li><li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes.">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li><li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p.">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li><li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes.">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li><li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+trypanosomatid+PEX19:+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number.">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li><li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi's+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal.">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li><li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation.">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li><li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes.">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Glycosomes temel, dinamik, parazit özgü organellerdir. Bu organellerin biyogenezi, bakım, çoğalması ve biçimlenme düzenleyen süreçler olası terapötik amaçlar için istismar edilebilir ilaç hedefleri arasındadır. Bu tür ilaç hedefleri potansiyel olarak yüksek bolluğuna rağmen, daha glycosome biyogenez alan baskın nedeniyle, hızlı ve dinamik organel karşılıklarının izlenmesi için olan bir izlenebilir, yüksek hacimli sistem eksikliği, bir başka organizmalarda benzer süreçlerle ilgili çalışmalarda gerisinde kalmış Canlı hücrelerdeki. Floresan-organel haberci sistemleri, maya, bitki, mantar ve memeli gibi daha yüksek ökaryotlardan 23-25 ​​organel dinamikleri üzerinde çalışmak için kullanılmaktadır. Biz floresan organellere, sonuçta glycosomes olgun hedeflenmektedir PTS2eYFP ifade PCF parazitler bir transgenik gerginlik yarattı. Glycosome kompozisyonunda değişiklikler aşağıdaki hücresel floresan ile izlenebilir. Bu sistemi kullanarak, özellikle glukoz, çevre koşulları, glycosome bileşim 12 düzenleyen bulmuşlardır. Genellikle kinetoplastida parazitlerde organel dinamikleri üzerinde çalışmak için kullanılan yöntemleri mikroskop aksine, bu raportör sistemi hızla bileşikleri ve genel glycosome dinamikleri etkileyebilecek koşullar taranması için olan bir yöntem sunar. Bununla birlikte, floresanstaki değişimler genel organel bileşimlerinde değişiklikleri yansıtır. Ayrıca biyokimyasal ve mikroskopik deneyler farklı floresan yoğunluklannı gösteren hücre popülasyonları arasındaki spesifik moleküler farklılıkları tanımlamak için gereklidir. Biz remodeling analizlerde kritik adımlardan bir dizi belirledik. İlginç bir şekilde, hücreler daha uzun bir süre (en fazla iki geçiş) kültürlendi gibi, çevresel değişikliklere tepki olarak davranış tahmin edilemez olduğunu bulduk. Uzun süreli kültürden sonra hücreler taze m içine yüksek yoğunluklarda geçtiedia, onlar hala glycosomes pişmanlık mümkün olduğunu belirten loş nüfus geçici bir artış gösterirler, ancak 24 saat sonra ölür. Biz de hiçbir biçimlenme görülmektedir durumlarla karşı karşıya kalmıştır. Bu davranışın nedeni belirsizdir ama biz burada anlatıldığı gibi hücreleri ele zaman (iki hücre pasajlar sayısının sınırlandırılması ve 1 x 10 7 / ml altında kültürlerini koruyarak) bulduk, glycosome yeniden şekillenme tekrarlanabilir. Hücreleri, bu durum, raportör plazmid-yapısı genellikle ilaçlar hücrelerin yeniden dönüştürülmesiyle, artık çevre şartlarına duyarlı olduğunda. Bu sistem, Afrika tripanozomlann glycosome davranışını incelemek için kullanılmış olsa da, aynı zamanda diğer selüler kompartımanlara, doğrudan protein lokalizasyonu amino asit dizilerini floresan proteinleri kaynaştırarak diğer parazitler organellerin çalışma için kabul edilebilir.

Trypanosoma brucei sığır Afrika insanlarda uyku hastalığından ve israf hastalığı, nagana neden olur. Bu hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçlar, aşılar mevcut değildir, eskimiş ve son derece zehirlidir ve ilaç direnci gelişimi için potansiyel yeni ilaç hedefleri 1 için arama gerektirir. Ömrünün, T. sırasında brucei, bir böcek vektör ve memeli ev sahibi arasında dönüşümlü; parazit hayatta gerekir hangi çok farklı ortamlarda sergileyen iki ana. Parazit farklı çevre koşullarına maruz gibi metabolik ve morfolojik değişikliklerin bir dizi ortaya çıkar. En dramatik değişikliklerden bazıları tek-zar-sınırlı parazit özgü Mikrocisimler gözlenir, glycosomes 13 adlandırılır. Glukoz seviyeleri nispeten yüksek (~ 5 mM) kan ve kan parazitler (BSF) glikolisis wh ile sadece ATP üretmekIle mitokondriyal metabolizma 14 bastırılır. Ökaryotlarda farklı olarak, glikoliz, sitoplazma, T. oluşur brucei glycosomes 14,15 glikolitik enzimlerin çoğu compartmentalizes. Parazitler, bir bloodmeal sırasında çeçe sineği tarafından alınır ve sinek tarafından sindirildikten 15 dakika içinde tespit edilemez seviyelere düşer glikozunda bir düşmenin, yaşarlar. Böcek metabolizması, procyclic formu (PCF), parazit daha esnek ve glukoz gibi, prolin gibi amino asitler, ATP, 16-18 sentezinde kullanılabilir olduğunu. Karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yaşam döngüsü glycosomal bağımlı değişiklikler ve kan parazitlerin artan glikolitik proteinler ile mitokondriyal proteinler ve TCA döngüsü ve solunum zincirinde 13,19 katılan mitokondriyal proteinleri ortaya. Birçok çalışma BSF ve PCF glycosomes arasındaki farklar odaklanmış olsa da, küçük env tepki olarak ortaya PCF glycosomes değişiklikler hakkında bilinmektedirironmental değişir. Sineğin hindgut, glukoz düzeyleri bir beslenme 20 sırasında geçici artışlar ile düşüktür. In vitro çalışmalar çoğunda, PCF parazitler glikoz içeren ortamda yetiştirilmektedir. Ancak son çalışmalar önemli ölçüde yanıt PCF metabolizma değişiklikleri durumunu 17 glikoza olduğunu göstermiştir. Glukoz, prolin alım ve prolin dehidrojenaz aktivitesi artışı 18 yokluğunda. Mitokondrial metabolizmanın bu değişiklik muhtemelen glycosome kompozisyon ve morfolojisinde bir değişime de eşlik eder, bununla birlikte, bu direkt olarak değerlendirilmemiştir. Elektron ve floresan mikroskobu yaygın teknikler T. glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılır brucei 2,21-24. Bu protokoller, zaman ve yoğun, pahalı ve gerçek zamanlı çalışma ve yüksek verimli protokollere adapte zor doğum. Bir floresan-organel muhabiri sistemi u bu sınırlamayı aşmak içinmemeli hücreleri ve maya sistemlerinin organellere çalışma sed T. kullanılmak üzere modifiye edilmiştir brucei 12. Floresan-organel haberci sistemleri yaygın gibi maya, bitki ve memeli hücreleri de 25-27 gibi daha yüksek ökaryotlardaki kullanılmıştır. Bu gibi sistemlerde, bir flüoresan proteini spesifik organellere proteini hedefler bir amino asit sekansına kaynaştırılır. Hedef proteinlerin bozulması veya sentez floresan ölçülmektedir ve organel bileşim değişiklikler hücre flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır. Geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) &#39;nin açık okuma çerçevesi, bir tip II peroksisomal hedefleme sekansı (PTS2) ve 12 bağlı olduğunda, olgun bir protein PTS2eYFP, ithal yetkin glycosomes ve floresan içine alınır, akış sitometrisi vasıtasıyla izlenebilir. Glycosome bileşim içinde varyasyonlar hücresel flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır. Bu sistem, resol yardımcı olabilirglycosome bileşim içinde çevreden kaynaklanan değişiklikler belirleyen mekanizmaları VING. Bu yazıda canlı parazitlere gerçek zamanlı glycosome dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile bağlantılı PCF parazitler bir glycosome raportör sistemin üretimini tarif ve farklı ortamlarda yanıt olarak glycosome bileşim değişimlerin izlenmesi için kullanılmıştır bir örnek sağlamaktadır. Taze ortam glycosome kompozisyonunda değişikliklere tetikler içine Özet olarak, bileşim, glycosome hücre dışı glükoz konsantrasyonu ve log-faz geçişi kültürlerin etkilenir. Bu sistem tripanozomlarına ve diğer parazitlerin diğer organellerin dinamik davranışlarını incelemek için modifiye edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraction kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA purifiation</td></tr><tr><td>Research grade Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Freezing media</td></tr><tr><td>Graces insect cell media powder</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MEM Amino Acids (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Pyruvic acid, sodium salt</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>SPW wash buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosome transformation</td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosome transformation</td></tr></tbody></table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei sığır 1, insan Afrika trypanosomiasis (HAT), ya da uyku hastalığı ve israf hastalığı, nagana neden olan bir kinetoplastida parazittir. Memeli konakçının kan ve çeçe sineği vektörü arasındaki parazit seçim yapar. Pek çok hücresel organellerin bileşimi bu farklı hücre dışı koşullara 2-5 cevaben değişir. Glycosomes glikoliz katılan enzimlerin çoğu bölmeli olan yüksek seviyede uzmanlaşmış peroksizomlar bulunmaktadır. Gelişimsel ve çevresel düzenlenmiş şekilde 4-11 Glycosome kompozisyon değişir. Şu anda, glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılan en yaygın teknikler elektron ve floresan mikroskopisi; pahalı, zaman ve emek yoğun ve yüksek verimlilik analizleri kolayca adapte değildir teknikleri. Bu sınırlamaları, bir flüoresan raportör sistemi-glycosome üstesinden gelebilmek için,12 glycosomes için, füzyon proteini yönlendiren peroksizom hedefleme dizisi (PTS2) kaynaşır sarı floresan protein (EYFP) geliştirilmiş olan kurulmuştur. PTS2eYFP füzyon proteininin ithalinde, glycosomes floresan olur. Organel bozulması ve akış sitometrisi ile ölçülebilir floresans kaybı geri dönüşüm ile sonuçlanır. Hücrelerin büyük sayılar (5,000 hücre / sn) gibi tespit ve montaj gibi geniş numune hazırlama olmadan gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Bu yöntem, çevre koşulları dalgalı yanıt olarak bir organel kompozisyonunda değişikliklere tespit hızlı bir yol sunar.

Bu sistemde, glycosome bileşim içinde bir glukoza bağımlı bir değişiklik gözlenmemiştir. Hücreleri glikoz içeren ortamda yetiştirildiği zaman, iki nüfus gözlenir; Bir parlak ve bir loş (Şekil 2A). Dim hücreler parlak hücreler olgun ve olgunlaşmamış glycosomes 12 bir karışımını barındıran süre PTS2eYFP ithal değil olgunlaşmamış glycosomes, liman. Glikoz ortamı içinde mevcut olduğunda, protein glycosome mislocalization 15,28 öldürücü ve glycosome protein ekspresyon muhtemelen alma ile yakından bağlıdır. Bu sıkı düzenleme hücrelerin yeterli alma yeteneği olmayan zaman glycosome protein ifadesi baskılandığı loş hücrelerin görülmesi sorumludur. Glycosome alma amaçlı tamamen monte ve fonksiyonel sonra, hücreler daha sonra floresan hücre sağlar, glycosomes içine alınır glycosome proteinleri ifade eder. Glukoz Boyar maddeler içinde glycosome proteinlerin mislocalization tolere olduğuD 15, ve bimodal popülasyonu dağılımının floresan daha geniş bir aralıkta (Şekil 2B) tek bir tepe noktası ile değiştirilir. Bu sistem glycosome bileşim içinde değişikliğine yol koşullarını tanımlamak için kullanılmıştır. ~% 10 sönük hücreleri (Şekil 3A) içeren yüksek yoğunluklu kültürler taze ortam içine iletildiğinde, loş hücreleri (Şekil 3B) yüzdesinde bir geçici bir artış vardır. 24 saat ile. Orijinal nüfus dağılımı (Şekil 3C) yeniden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 Katılar </td><td > Ağırlık (g / l) </td></tr><tr ><td > Böcek hücresi ortamı toz süsler </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Glikoz </td><td> 1 </td></tr><tr ><td > Hepes </td><td> 8 </td></tr><tr ><td > MOPS </td><td> 5 </td></tr><tr ><td > NaHCO3 </sub&gt; </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Sodyum piruvat </td><td> 0.1 </td></tr><tr ><td > L-Alanin </td><td> 0.2 </td></tr><tr ><td > L-Arginin </td><td> 0.1 </td></tr><tr ><td > L-Glutamin </td><td> 0.3 </td></tr><tr ><td > L-Methonine </td><td> 0.07 </td></tr><tr ><td > L-Fenilalanin </td><td> 0.08 </td></tr><tr ><td > L-Prolin </td><td> 0.6 </td></tr><tr ><td > L-Serin </td><td> 0.06 </td></tr><tr ><td > L-Taurin </td><td> 0.16 </td></tr><tr ><td > L-treonin </td><td> 0.35 </td></tr><tr ><td > L-Tirozin </td><td> 0.1 </td></tr><tr ><td > Adenozin </td><td> 0.01 </td></tr><tr ><td > Guanozin </td><td> 0.01 </td></tr><tr ><td > Glukozamin HCl </td><td> 0.05 </td></tr><tr ><td > Folik asit, </td><td> 0.004 </td></tr><tr ><td > r-Aminobenzoik asit </td><td> 0.002 </td></tr><tr ><td > Biotin </td&gt; <td> 0.0002 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. SDM79 katı bileşenler. Katı ortam bileşenleri ve miktarı (g / L) verilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 </td><td ></td></tr><tr ><td > Glutamin MEM </td><td > 600 mi </td></tr><tr ><td > Kalem / Strep </td><td > 10 mi </td></tr><tr ><td > BME vitamin çözeltisi </td><td > 10 mi </td></tr><tr ><td > MEM amino asit çözeltisi </td><td > 8 mi </td></tr><tr ><td > MEM gerekli olmayan amino asit çözeltisi </td><td > 6 mi </td></tr><tr ><td > Hemin </td><td> 3.75 </td></tr><tr ><td > Su </td><td > 162,25 mi </td></tr></tbody></table> Tablo 2. SDM79 sıvı bileşenler. Birimleri ml verilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td ><strong&gt; cytomix </td><td > 20 ml </td></tr><tr ><td > 120 mM KCI </td><td > 1.4 mi (1 M) </td></tr><tr ><td > 0.15 mM CaCl2 </td><td > 3 mi (1 M) </td></tr><tr ><td > 10 mM K 2 HPO 4 </td><td > 400 mi (0.5 M) </td></tr><tr ><td > 25 mM HEPES </td><td > 500 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 2 mM EDTA </td><td > 80 mi (0.5 M) </td></tr><tr ><td > 5 mM MgCI2 </td><td > 100 mi (1 M) </td></tr><tr ><td > Su </td><td> 16.52 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. cytomix tarifi. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig1highres.jpg" /> 1. Floresan glycosome raportör sistemi Şekil. A), PTS2eYFP ekspresyon yapısı entegrasyonu. PCF tripanozomlar pX ile dönüştürülmüştürS2PTS2eYFP plazmid Mlul kısıtlama enzimi ile linearize. Bu konstrukt, tübülin mahaline (döşeme) ve PARP-dizileri (PARP) içine, homolog rekombinasyon ile entegre PTS2eYFP yapısal ekspresyonunu ve RNA işleme. B için gerekli dizileri) PTS2eYFP alma tahrik promoterini içerir. PTS2eYFP bu glycosomes raportör protein teslim çözünebilir reseptörünü, PEX7 olarak bağlanan sitoplazmada sentezlenir. Glycosome membran teslim sonra protein, ithal edilmektedir. Fonksiyonel ithal makine içermeyen olanlar loş kalırken ithalat makine ithalat PTS2eYFP ve floresan içeren Olgun organeller. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Glükoz bağımlı glycosome terkip. PCF hücreleri SDM79 (+ GLC) ya da SDM80 (GLC) gece boyunca yetiştirilmiştir edildi veakış sitometrisi ile analiz edilmiştir. 10.000 olayların histogramlar. SDM79 yetiştirilen hücreler A) Analizi sürekli iki tepe ortaya koymaktadır. Floresan hücreler daha olgun glycosomes sahip yüksek floresan yoğunlukları hücreleri olgun ve olgunlaşmamış organellerin bir karışımını barındırır. SDM79 olarak, protein, mislocalization glycosome öldürücü ve glycosome protein ekspresyonu ve ithalat sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bu ara madde, floresan yoğunlukları b.) SDM80 In hücrelerin yokluğunda yansıyan glycosome proteinlerin mislocalization bimodal nüfus dağılımı kaybolur, ve ara floresan hücreleri gözlenir, iyi tolere edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Glycosome yeniden modellenmesi. Glycosomes yeniden modellenmesi, taze ortam içine geçirme ile tetiklenir. <stbaşlangıç ​​kültüründe 10000 olay (Rong&gt; A) histogram 4 x 10 6 / ml). B) sol kapının C giren olgunlaşmamış glycosomes loş hücrelerin oranında bir artış taze SDM79 içine seyreltildikten sonra 3 saat 24 saat sonra seyreltilmiş kültür) Histogram. Olgunlaşmamış glycosomes şimdi floresan proteini almak için gerekli peroksisom proteinleri içeren olarak 24 saat sonra, nüfus dağılımı, normale döndü.

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Görüntüleme.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Video: Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

Lenfosit Silahların Yayılmasının Önlenmesi Monitör Carboxyfluorescein diasetat Succinimidyl Ester (KAKE) Kullanımı

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Kullanımı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Biyoloji

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH için pHluorin2 Tabanlı Sensörün Geliştirilmesi

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Yazar Spotlight: pHluorin2 Biyosensörü Kullanılarak Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH İzlemedeki Gelişmeler

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Lenfosit Silahların Yayılmasının Önlenmesi Monitör Carboxyfluorescein diasetat Succinimidyl Ester (KAKE) Kullanımı

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Kullanımı

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain'ler Görselleştirme

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi