Name: visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

J.O.B. and A.M.R. were supported by predoctoral fellowships from the National Science Foundation.

NOT: Bu protokol için, N. epidermis stromule frekansı tahlil odaklanmıştır benthamiana yaprak. FNRtp: EGFP 13 ve NRIP1: 6 Cerulean çeşitli stabil transjenik 35S PRO dahil olmak üzere bu amaçla kullanılabileceğini oluşturulmuştur. Bu hatların her ikisi de, geniş bir şartlar aralığında altında yetiştirilen yaprak kloroplast stromada florofor sağlam ekspresyonunu göstermektedir. Seçenek olarak ise, bir kloroplast-hedefli flüoroforlar geçici N olarak ifade edilebilir benthamiana kullanarak Agrobacterium 13 dönüşümler. Agrobacterium infiltrasyon N. bazı bazal savunma yanıtları neden çünkü bu, transgenik çizgiler daha az ideal Agrobacterium ile benthamiana ve etkileşimler, potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike, yaprak 14 stromule frekans değiştirebilir. Son olarak, in vitro stromule oluşumunu görselleştirmek için,aşağıda Bölüm 5&#39;te tarif edildiği gibi kloroplast, genetik olarak kodlanmış florofor ya da floresan boya kullanılarak, herhangi bir bitki türünden elde edilebilir olabilir. 9,15 Not:. Bitki yetiştirme için ayrıntılı yöntemler, daha önce tarif edilmiştir 16 Kısaca, N. büyümeye iyi drenaj sağlayan herhangi bir profesyonel toprak karışımı ile dolu 4 &quot;tencere benthamiana bitkileri.. çimlenme için nemli bir ortam sağlamak için 10-14 gün için bir şeffaf plastik kubbe ile fidan Kapak 14- üreticinin talimatlarına herhangi bir standart gübre karışımı ekleyin günlük eski bitkiler. ~ 100 ľmol fotonlar m -2 sn -1 ışık yoğunluğu kullanarak, beyaz ışık altında bitkiler yetiştirin. Su bitkileri düzenli. Görselleştirme için 1. Hazırlama Yaprak Örnekleri NOT: doku hazırlanması stromule görüntülenmesi hemen önce yapılmalıdır böylece Stromule dinamikleri, 8 kişi yaralandı etkilenirkonfokal floresan mikroskop ile s. İdeal olarak, örnek bir tesisi çıkarıldıktan sonra 15 dakika ile görselleştirilmiştir edilmelidir. <ol><li> çok keskin bir jilet kullanarak yaprak küçük bir bölümünü kesti. Her zaman tutarlılık için yaprak aynı bölgesini kullanın ve tüm deneylerde (adaxial veya eksen dışı) aynı yüzey görselleştirmek için emin olun. </li><li> Hemen yaprak bölümünü kestikten sonra, su dolu bir 5 ml iğnesiz şırınga yaprak bölümünü batığın, şırınga havayı çıkarmak ve bir parmak ile şırınga deliği kapsayan ve pistonu çekerek bir vakum uygulanır. <ol><li> Yaprak bölümü zarar görmesini önlemek için pistonu hafifçe bırakın. Bu iki ya da üç kez tekrarlayın, veya havanın en kaldırıldı ve kadar yaprak derin yeşil olarak görünmektedir. NOT: Bu adım stromules doğru görselleştirme engelleyebilir yaprak havayı temizler. </li></ol></li><li> Bir slayta bir damla su ekleyin ve bu damla yaprak bölümüne yerleştirin. Sonra, başka bir dr eklemekyaprak üstüne su op ve yaprak üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcığı varsa onlar kaldırılana kadar, yavaşça kapak kayma dokunun. slayt şimdi mikroskopi için hazırdır ve hemen görüntülenmiştir edilmelidir. </li></ol> Konfokal Floresan Mikroskopi ile 2. Görselleştirme Stromules <ol><li> iletilen ışık, (uzak jilet hasar hücrelerden) yaprak bölümünün merkezine yakın bir görüş alanında odaklanmak. Birçok kloroplast eş zamanlı olarak görüntülenebilir ve böylece bir 20x objektif kullanarak. gerektiğinde hücre tipleri daha sonra ayırt edilebilir, böylece iletilen ışık bir görüntü kaydedin. </li><li> fluorofor kullanılmak üzere uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile bir lazer ışık kaynağı geçin. Örneğin, bir 488 nm lazer ile GFP tahrik 500 nm ve 525 nm arasında emisyon toplar. <ol><li> mikroskop yazılımı kullanarak, GFP kanalı seçmek ve iğne deliği diyafram Ai 1 ayarlamak için tıklayınry birimi. , Lazer tarama seçin örnek görselleştirmek başlamak için, ve sonra lazer yoğunluğu ve hala net stromules görüntülenmesi sırasında lazer gücü en aza indirmek için dedektör kazancını ayarlamak için GFP kanalı tıklatın. Bu ayarlar belirlendikten sonra, onları tüm deneyler boyunca mümkün olduğunca tutarlı tutmak. </li></ol></li><li> Görüş alanı içinde yaprak epidermis yoluyla görüntüleri bir dizi toplayacak bir z -stack deney hazırlayın. <ol><li> Z -stack için (yaprak yüzeyine yakın kloroplast test koşullar altında daha stromules varsa, örneğin) önyargı önlemek için bakış alanı tüm epidermal kloroplast içerir. </li><li> Z -stack için gerekli zamanı tüm stromules dahil ancak minimize edecek maksimum aralık mümkün görüntüleri çekin. Örneğin, 1 Airy birim her 2 mikron muhtemel ideal bir görüntü alarak, 2 mikron derin bir in-odak konfokal bölümüne eşdeğerdir. NOT: Yaprak epidermis düzgün olmayan bir yüzey, yani örnek olarak değişecektir -stack z toplam derinliği; En z -stacks 10-20 görüntüleri gerektirir, ama daha fazlasını içerebilir. </li><li> (Mümkünse, genellikle 5-10 dakika içinde) z -stack hızla toplanan emin olmak için tarama hızı ve gerektiğinde görüntü çözünürlüğünü ayarlayın. Daha sonra analiz için z -stack kaydedin. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü İşleme <ol><li> herhangi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak stromule sıklığını belirlemek. Bu protokol için, Ulusal Sağlık Enstitüleri (http://imagej.nih.gov/ij/), ya da ImageJ, Fiji popüler yükseltme kamuya açık ImageJ, (http://fiji.sc kullanmanızı öneririz / Fiji). </li><li> Yazılımda maksimum yoğunluğu projeksiyon kullanılarak tek bir görüntü içine z -stack Birleştirme. </li><li> Belirleyin ve manuel olarak görüntüdeki tüm kloroplast saymak. </li><li> Her bir kloroplast için, görsel olarak ister bir veya daha fazla stromules belirlenmesiBirleştirilen z -stack görüntüde kloroplast uzanan görülür. Örnekler için, bakınız Şekil 1. Not: stromules biyolojik fonksiyonları bilinen olmadığından, kloroplast gelen her hangi ince, stroma dolgulu, boru şekilli uzantı uzunluğundan bağımsız olarak, bir &quot;stromule&quot; olarak kabul edilebilir. Yaklaşık 1 um, uzunluğu 7 büyük kısmı boyunca çap olarak daha az ise, genel bir kural olarak, kloroplast bir stroma doldurulmuş uzantısı stromule olup. bir kişi bir kloroplast bir stromule olup olmadığını belirlemede sübjektif farklılıkları kontrol etmek için tüm görüntüleri analiz emin olun. İkinci araştırmacı bağımsız daha sübjektif önyargıları azaltmak için stromule frekansları doğrulamak gerekir. </li></ol> 4. Deney Tasarımı ve Örnekleme NOT: Stromule frekans yaprakları arasında oldukça değişkendir, ancak birçok rapor stromule frekansta küçük varyasyon bir Indivi içinde olduğunu ortaya koymaktadırÇift yaprak 9,17. <ol><li> bir yaprak görünümünde tek bir alandan yaprak stromule frekansını hesaplayın. yaprak atın ve bu bağımsız örnek düşünün. bağımsız örneklem olarak bir yapraktan görüş ayrı alanlar düşünmüyoruz. NOT: stromules işlevi daha net tanımlanmış stromule aktivitede ve kadar en iyi nasıl önlem değişiklikleri, araştırmacılar stromule dinamiklerini miktarının yaratıcı olmaya devam etmelidir üzerinde güçlü bir fikir birliği yoktur. Literatürde arasında karşılaştırma, ancak raporlama ortak standartlar daha yaratıcı yaklaşımların yanısıra kullanılmalıdır. En azından, her zaman bir ya da daha fazla stromules sahip kloroplast sıklığını bildirmektedir. </li><li> bir görüş alanı içinde stromules sahip kloroplastlar sıklığını belirler. bir görüş alanındaki tüm kloroplast belirlemek için ImageJ kullanın. Daha sonra, her kloroplast için, kloroplast, en az bir stromule oluşturulmuş olup olmadığını belirlemek. Percenta olarak bildirin stromule frekansıBir stromule ile kloroplast ge. NOT: Bazı araştırmacılar stromule frekansları bildirmeden önce, arksinüs dönüşümü ile, örneğin yüzde dönüşümü; Bu istatistiki analiz için bir seçenek ise, stromule frekans Ark sezgisel bir değer değildir ve bir çalışma ana metin veya şekillerde rapor edilmesi gerekmez. <ol><li> alternatif bir yaklaşım olarak, stromules toplam sayısını saymak ve kloroplast toplam sayısına bölün. NOT: Çoğu durumda, bu 4.2 yaklaşım benzer sonuçlar verecektir; Tek bir kloroplast birçok stromules kurdu eğer, ancak, stromule frekansını tahmin edebilir. Örnek sonuçlar gösterilmiştir örnekte, örneğin birkaç kloroplastlar (33/87 bir stromule frekansa karşı) 40/87 almak amacıyla kloroplast başına stromules sayısı artırılarak, iki veya daha fazla stromules sahiptir. </li><li> Seçenek olarak ise, bunun yerine stromule frekans stromule uzunluğunu belirler. Uzunluk ölçülebilirserbest çizgi aracı ile stromule takip ederek ImageJ. NOT: stromules biyolojik rolü bilinmemektedir yana, stromule uzunluğu işlevini etkileyen açık değildir. bunlar gözlenirse stromule uzunluğunda önemli farklılıklar rapor ama (4.2 de tarif edildiği gibi), aynı zamanda stromule frekansları rapor etmektedir. Not: Stromule frekansı aynı büyüme koşulları altında, farklı yaprak arasında oldukça değişken olabilir. Bu nedenle, zaman alıcı olabilir stromule frekansını belirlemek rağmen, deneyler dikkatle büyük örnek boyutları içerecek şekilde dizayn edilmelidir. Bizim laboratuarından veri setlerini kullanarak, standart ile (her bir tedavi için en az 16 bitki örneklem büyüklüğü iki durum arasında stromule frekansta en az 1.5 kat değişim istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirlemek için genellikle yeterince güçlü olduğunu belirledi α = 0.05 ve β = 0.80). </li></ol></li><li> Sonuçların istatistiksel analizi. <ol><li> Bana karşılaştırmak içinİki tedavilerin stromule frekansları, (aynı zamanda eşitsiz varyans varsayarak heteroskedastik t testi veya t testi olarak da bilinir) Welch t testi kullanın. NOT: Bu test, geleneksel Student t testi kadar güçlü değil, ama stromule frekans dağılımındaki Varyans tedaviler arasında benzer olduğunu kabul etmez, çünkü Welch t testi avantajlıdır. NOT: stromule frekans bir &quot;oran&quot; olduğundan, örnekleme dağılımı teorik olarak çarpık istatistiksel analiz numunesi boyutları çok düşükse ya da stromule frekans (kapat% 0) ya da çok çok düşükse hangi, binom ziyade normal olarak tahmin edilmektedir yüksek (% 100&#39;e yakın). Bazı raporlar normal dağılıma binom dağılımına dönüşümü ve böylece Student t testi ve ANOVA standart gereksinimlerini karşılamak için tasarlanmıştır istatistiksel analiz, daha önce arksinüs dönüşümleri kullandık. Ancak uygulamada, birrcsine dönüşümler istatistiksel analiz üzerinde çok az veya hiç etkisi yoktur ve bu nedenle tavsiye edilmez. Bunun yerine, istatistiksel gücünü artırmak ve verilerin yorumlanması hataları azaltacaktır örnek büyüklüğünü artırmak için deneyler tekrarlayın. </li><li> Kullanılan istatistiksel ne olursa olsun yaklaşımı dikkatle her bir deney için numune alma stratejisi, örnek boyutunu, istatistiksel test ve p değeri rapor emin olun. NOT: biyolojinin diğer alanlarında olduğu gibi, bir p değeri 0.05&#39;ten &quot;istatistiksel olarak anlamlı&quot; kabul edilebilir, araştırmacılar kesinlikle elde kesin p değeri rapor gerektiği halde. P iki ya da üç deneyler ile örnek sayısının artırılması, biraz 0.05 üzerinde ise gözlenen fark, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını netleştirmek için yardımcı olabilir. </li></ol></li></ol> 5. Stromule Dynamics Visualize&#39;a Bozulmamış kloroplastlar ayıklanıyor NOT: Çeşitli yöntemlerin vitro 15 stromule oluşumu üzerinde bir çalışmada biraz farklı bir protokol içeren, yapraklardan kloroplast izole etmek için kullanılmıştır. Aşağıda ayrıntılı protokol biyokimyasal saf kloroplast örnekleri verim değildir nispeten basit bir yöntem kullanır, ancak bunun yerine sağlam, sağlıklı kloroplast 9,18 büyük miktarda izole etmez. <ol><li> Soğuk ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 50 mM Hepes, NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1.0 mM MgCl2 ve 1.0 mM MnCI2. Kullanmadan önce NaOH ve HCl ve soğutmak ile 6.9 pH ayarlayın. NOT: Her ne kadar gerekli değildir, soğuk tamponlar kullanılarak ve sağlam kloroplastların yüksek oranda verecektir mümkün buz örnekleri tutmak. </li><li> Yalıtım tamponu hazırlayın: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1.0 mM MnCl2, 1.0 mM MgCI2, 10 mM KCI ve 1.0 mM NaCI. Kullanmadan önce NaOH ve HCI ve soğutmak 7.6 pH ayarlayın. </li><li> Yaprakları değilsenizdimetil sülfoksit içinde 50 mM stok çözelti CFDA (DMSO) (1.0 mL DMSO 2.3 mg CFDA) genetik olarak kodlanmış stromal fluorofor ifade carboxyfluorescein diasetat (CFDA) çözeltisi hazırlayın. Not: tam konsantrasyonu kritik değildir. her zaman karanlıkta CFDA stok tutmak. -20 ° C&#39;de, 50 mM CFDA az miktar saklayın. </li><li> kloroplast izole etmek için, çeşitli bitkilerden ~ 5-10 g yaprakları kaldırmak ve kısaca soğuk suyla durulayın. Hemen 50 ml soğuk ekstraksiyon tamponu transfer. birçok kısa darbelerle bir karıştırıcı ile ezme bırakır. iki adet 50 ml&#39;lik santrifüj tüplerine ekstre kloroplast bölünmesi, yaprak tozu gidermek için tülbent iki ya da üç kat üzerinden filtre ve 750 x g&#39;de 1 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Süpernatant atın ve 10 ml izolasyon tamponunda yeşil kloroplast tekrar süspansiyon. Tekrar santrifüj 750 xg&#39;de 1 dakika için, supernatant atmak ve izolasyon tamponunda tekrar süspansiyon kloroplastlar, 5 ml nihai hacmi getirmek için. </li><li> transferi 201, bir slayt kloroplastların l, bir lamel ile kaplayın ve mikroskopi başlar. Not: plastid hedefli floresan proteinleri eksprese eden transjenik bitkilerden Kloroplastlar artık konfokal floresan mikroskobu ile görselleştirme için hazırdır. </li><li> stromules görselleştirmek için plastid hedefli floresan proteinleri ifade değildir bitkilerden kloroplast Leke. <ol><li> izolasyon tamponunda kloroplastlar askıya 5 ml 50 mM CFDA stokunun 5 ul ekleyin. 50 uM nihai konsantrasyon getirin. </li><li> kloroplastlar 5 dakika inkübe ve sonra bir slayt küçük bir kısım (~ 50 ul) aktarmak, bir lamel ile kaplayın ve mikroskopi emmesine izin verin. </li><li> bir FITC veya GFP filtre seti kullanın. tek bir izole kloroplast görselleştirmek için aynı anda çok sayıda kloroplast görselleştirmek için bir 20x objektif veya daha yüksek bir amacı kullanın. NOT: CFDA bozulmamış kloroplast stroma içinde floresan olacaktır. </li><li> Güçlü arka plan flüoresan ise, Chlo yıkamaYine CFDA, 750 x g&#39;de 1 dakika boyunca santrifüj ile 5 dakika inkübasyondan sonra, 10 ml izolasyon tamponunda roplasts, 5 mi yalıtım tamponu içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Koussevitzky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+chloroplasts+converge+to+regulate+nuclear+gene+expression.">Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression.</a> Science. 316 (5825), 715-719 (2007).</li><li>Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNAS+Plus:+Organelle-nucleus+cross-talk+regulates+plant+intercellular+communication+via+plasmodesmata.">PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).</li><li>Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+states+of+plastids+and+mitochondria+differentially+regulate+intercellular+transport+via+plasmodesmata.">Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata.</a> Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).</li><li>Nomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast-mediated+activation+of+plant+immune+signalling+in+Arabidopsis.">Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis.</a> Nat. Commun. 3, 926 (2012).</li><li>Avenda&#241;o-V&#225;zquez, A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncharacterized+apocarotenoid-derived+signal+generated+in+&#950;-carotene+desaturase+mutants+regulates+leaf+development+and+the+expression+of+chloroplast+and+nuclear+genes+in+Arabidopsis.">An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in &#950;-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).</li><li>Caplan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+stromules+runction+during+innate+immunity.">Chloroplast stromules runction during innate immunity.</a> Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).</li><li>Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromules:+recent+insights+into+a+long+neglected+feature+of+plastid+morphology+and+function.">Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).</li><li>Gray, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+stromules+are+induced+by+stress+treatments+acting+through+abscisic+acid.">Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid.</a> Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).</li><li>Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplasts+extend+stromules+independently+and+in+response+to+internal+redox+signals.">Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).</li><li>Dupree, P., Pwee, K. -. H., Gray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+photosynthesis+gene-promoter+fusions+in+leaf+epidermal+cells+of+transgenic+tobacco+plants.">Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants.</a> Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).</li><li>Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+and+loss+of+photosynthetic+membranes+during+plastid+differentiation+in+the+shoot+apex+of+Arabidopsis.">Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).</li><li>Chiang, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+GATA+transcription+factors+GNC+and+CGA1+reveals+their+key+role+in+chloroplast+development,+growth,+and+division+in+Arabidopsis.">Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).</li><li>Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Kl&#246;sgen, R. B., Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+stromule+branching+coincides+with+contiguous+endoplasmic+reticulum+dynamics.">Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).</li><li>Erickson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-derived+cytokinin+influences+plastid+morphology+and+starch+accumulation+in+Nicotiana+benthamiana+during+transient+assays.">Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).</li><li>Ho, J., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+stromules+in+vitro+from+chloroplasts+isolated+from+Nicotiana+benthamiana.">The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana.</a> PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).</li><li>Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+plasmodesmata+genetics+with+virus-induced+gene+silencing+and+an+Agrobacterium-mediated+GFP+movement+assay.">Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay.</a> Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).</li><li>Schattat, M. H., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stromule+formation+by+extracellular+sucrose+and+glucose+in+epidermal+leaf+tissue+of+Arabidopsis+thaliana.">Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).</li><li>Joly, D., Carpentier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+intact+chloroplasts+from+spinach+leaves.">Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves.</a> Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).</li><li>Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromule+formation+is+dependent+upon+plastid+size,+plastid+differentiation+status+and+the+density+of+plastids+within+the+cell.">Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell.</a> Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

stromules araştırırken, üç önemli faktör boyunca dikkate alınmalıdır: mutlak minimumda tutulmalıdır bitki dokusunun (i) manipülasyon, (ii) deneysel sistem tutarlı tutulmalıdır, ve (iii) örnekleme stratejileri dikkatle planlanan olmalıdır sağlam sağlamak, tekrarlanabilir veriler analiz edilmiştir. Stromules oldukça dinamik: bunlar uzatmak ve mikroskop altında bir gözlemcinin gözleri önünde hızla geri çekebilirsiniz. Ayrıca, stromule frekansı (yaprak yaralanma gibi) stromules görselleştirmek için önlenemez uyaranlara dahil bir geniş, yanıt olarak büyük ölçüde farklılık göstermektedir. Burada anlatılan protokoller ile ele alınmaktadır bu soruna, birincil çözüm, tutarlı tüm değişkenleri tutmak, iyi kontrollü deneyler yapmaktır. Bu, hemen mikroskop getirmeden önce görünüm için her bir örnek hazırlanması, örneğin aşağıdakileri içerir:; bitkiler zarar olmamalıdırgörselleştirme hemen önce. yaprak kaldırma veya herhangi bir zarar vermeden, ideal bir tedavi, doğrudan bitkiye uygulanır: Bu sorunun ikinci çözelti protokolleri karmaşıklığını azaltmaktır. Stromules buğday kök tüyleri, domates meyveleri ve solmuş tütün fidelerinden 8,19 dahil türler ve hücre tipleri, baş döndürücü bir dizi çalışma yapılmıştır. Bu öncü çalışmalar bitki gelişimi sırasında stromule dinamiklerinin anlaşılmasını ileri ve stromule aktivite yelpazesini araştırdı. plastidlerin farklı ölçüde farklı biyolojik proseslerde yer alan bir yana, bu çeşitli deneysel sistemleri ile karşılaştırmalar Çizim Ancak, yanlış yorumlar yol açabilir. Örneğin, kloroplast Fotosentetik elektron zinciri kaynaklanan oksidatif strese yanıt olarak stromules olmak ancak leucoplastlar fotosentezmekanizmasına olmadığından, bunlar duyarlı değildiruyarılara 9. Herhangi bir deneysel sistem stromules araştırmak için kullanılabilir, ancak, bir karşılaştırma çizilmesi durumunda deneysel sistem çalışma boyunca istikrarlı tutulmalıdır. Faktörler türler, hücre tipi, gelişim aşamasını veya bitkinin yaşı ve (istikrarlı transgen ifadesi, geçici transgen ifadesi, ya da harici bir fluorofor yoluyla olsun) boyama stromules yöntemini içerir dikkate almak; Bu faktörlerin bile küçük farklılıklar sonuçların daha sonra yorumunu karıştırabilir. Son olarak, stromule biyoloji herhangi çalışma sonuçları tekrarlanabilir ve biyolojik ilgili olmasını sağlamak için sağlam, güvenilir bir örnekleme stratejisi kullanmanız gerekir. Örnekleme defalarca bir yaprak çeşitli bölgelerinde görüntüleri alarak tek bir bitki, örneğin, gelen, görünüşe göre istatistiksel gücü artıracak, ancak yanıltıcı olabilir. Yukarıdaki Örnek verilerde görüldüğü gibi, tek bir yaprak stromule frekansı, ortalama stromule frekansından önemli ölçüde değişebilirBirçok yaprakları arasında: gündüzleri yaprakların arasında ortalama stromule frekans neredeyse yarısı, sadece% 20.8 olmasına rağmen gündüz görüntülendi o yaprak, içinde, kloroplast% 37,9, stromules yaptı. Üstelik şu anda stromule dinamikleri hakkında bilinen ne kadar az verilen, herhangi bir deney tamamen o beklenmedik değişkenler gözlenir stromule aktivitede herhangi bir değişiklikten sorumlu değildir emin olmak için, en az üç kez yinelenmiş ve mümkünse daha fazla olmalıdır. stromule biyoloji alanı sadece kapalı almaya başlıyor çünkü her şeyden önce, araştırmacılar dikkatli belgelemek gerekir ve burada özetlenen basit bir protokol yaratıcı sapmalar da dahil olmak üzere, deneysel tasarım tüm yönleriyle rapor.

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast7.
The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles6. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.
Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts10. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Model: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&amp;nbsp;</td><td>Model: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Open-source software for analyzing biological images</td></tr></tbody></table>

visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Bu protokol, genç N. kotiledonlardaki gün ve geceleri stromule frekansı görselleştirmek için kullanılan benthamiana fidanları. Bir z yığından Dilimler tek bir görüntü (Şekil 1A) birleştirilmiştir. Görsel amaçlı, o görüntü daha sonra desaturated ve stroma siyah (Şekil 1B) görünecek şekilde ters oldu. kloroplastlar ya hiç stromules (yeşil yıldız) sahip ya da en az bir stromule (eflatun yıldız) sahip olarak işaretlendi. görüntülenmiştir 87 epidermal kloroplast, 33 stromules var. Bu durumda, bu yaprağın stromule frekansı 37.9% &#39;dir. Bu analizi kullanarak, protokol gün ve gece 24 bitkilerin toplam olarak bir 21 bitki (bitkide bir yaprak) tekrar edilmiştir. günde, ortalama stromule frekansı 20.8 ± 1.8% idi; Geceleri, ortalama stromule frekansı 12.8 ± 0.9% idi (Şekil2). Welch t testi ile belirlenen Stromule frekans, gündüzleri anlamlı derecede yüksek bulundu (n ≥ 22, p &lt;0.0005). Her ne kadar 23.000&#39;in üzerinde kloroplastlar ve birkaç yüz hücreleri, örneklem büyüklüğü gözlendi n, 22 olarak rapor edildiğini unutmayın, bağımsız bitkilerin sayısı incelendi. Burada tarif edilen protokol kullanılarak, kloroplast stromules N yapraklarından izole edildikten sonra in vitro olarak tespit edilmiştir plastid hedefli GFP (Şekil 3A) ifade benthamiana, veya N izole kloroplast leke CFDA kullandıktan sonra benthamiana (Şekil 3B) veya Spinacia oleracea (Şekil 3C). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig1.jpg" /> Şekil 1. N. stromule frekansı miktarının Benthamiana yaprakları. (A) aZ -stack N. epidermisin görünümünde kısmi alandan benthamiana ifade stromal GFP tek bir görüntüdeki tüm epidermal kloroplast ve stromules göstermek için birleştirilmiştir. (B) Bu görüntü, siyah ve beyaz dönüştürülür ve görsel amaçlı ters edildi. stromules ile Kloroplastlar bir kırmızı yıldız işareti ile belirtilmiştir; stromules olmadan kloroplastlar yeşil yıldız işareti ile belirtilmiştir. Ölçek çubukları 10 um temsil etmektedir. Brunkard ark modifiye. 9 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig2.jpg" /> Koşulda stromule frekans karşılaştırılması Şekil 2.. Bu protokol str belirlemek için kullanılmıştırgünde 22 bitki ve gece 24 bitkilerde omule sıklığı. Stromule frekans geceleri daha gündüzleri anlamlı derecede yüksek bulundu (Welch t testi, n ≥ 22, p &lt;0.0005). Hata çubukları standart hata gösterir. Brunkard ark modifiye. 9 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54692/54692fig3.jpg" /> Şekil 3. yapraklarından bozulmamış kloroplast ayıkladıktan sonra stromules görselleştirme. (A) transgenik N. gelen Kloroplastlar benthamiana burada açıklanan protokoller kullanılarak izole edildi kloroplasta hedeflenir GFP (yeşil) bırakır. (B) Kloroplastlar, doğal tipte N. izole edilmiştir benthamiana ve CFDA, Fluo boyanan yapraklar(Sarı gösterilir) Sadece sağlam, canlı kloroplastların içinde resces. (C) Kloroplastlar da ıspanak gibi diğer bitki türlerinden izole edilebilir (G. oleracea), ve sonra, (sarı) CFDA ile boyanmıştır. Klorofil otofloresansı kırmızı gösterilir. Brunkard ark modifiye. 9

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

visualizing-stromule-frequency-with-fluorescence-microscopy

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.0K Görüntüleme.  USDA. Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Video: Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Genetik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Biyomühendislik

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Biyokimya

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme<em&gt; S. venezuelae</emBir mikroakışkan Cihaz Kullanımı&gt; Yaşam Döngüsü

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler