Name: visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
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J.O.B. and A.M.R. were supported by predoctoral fellowships from the National Science Foundation.

NOTA: Para este protocolo, se han centrado en el ensayo de la frecuencia stromule en la epidermis de N. deja benthamiana. Varias líneas transgénicas estables que se han generado que se puede utilizar para este propósito, incluyendo 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 y NRIP1: Cerulean 6. Ambas líneas muestran la expresión robusta de fluoróforos en el estroma del cloroplasto de hojas cultivadas en una amplia gama de condiciones. Alternativamente, fluoróforos cloroplasto orientada se pueden expresar de forma transitoria en N. benthamiana utilizando Agrobacterium Transformaciones 13. Esto es menos ideal que las líneas transgénicas, ya que las infiltraciones de Agrobacterium inducen unas respuestas de defensa basal en N. benthamiana y las interacciones con Agrobacterium pueden alterar la frecuencia stromule en la hoja 14, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Por último, para visualizar la formación de stromule in vitro,cloroplastos pueden ser extraídos de cualquier especie vegetal, ya sea utilizando fluoróforos genéticamente codificados o un colorante fluorescente, tal como se describe en la sección 5 a continuación. 9,15 NOTA:. Métodos detallados de cultivo de plantas se han descrito previamente 16 Brevemente, crecer N. benthamiana plantas en macetas de 4 &quot;con cualquier mezcla de tierra profesional que ofrece un buen drenaje. Cubra plántulas con una cúpula de plástico transparente para los primeros 10-14 días para proporcionar un ambiente húmedo para la germinación. añadir cualquier mezcla de fertilizante estándar siguiendo las instrucciones del fabricante para 14- plantas días de edad. cultivar plantas bajo luz blanca, utilizando ~ 100 mmol fotones m-2 s-1 de intensidad de luz. Las plantas de agua con regularidad. 1. Preparación de muestras de hojas para la visualización NOTA: la dinámica Stromule se ven afectados por hiriendo a 8, por lo que la preparación del tejido debe llevarse a cabo inmediatamente antes de visualizar stromules por microscopía de fluorescencia confocal. Idealmente, una muestra debe ser visualizado con 15 min después de la eliminación de la planta. <ol><li> Cortar una pequeña sección de la hoja usando una hoja de afeitar muy agudo. Utilice siempre la misma región de la hoja de coherencia, y estar seguro de visualizar la misma superficie (adaxial o abaxial) en todos los experimentos. </li><li> Inmediatamente después de cortar la sección de hoja, sumergir la sección de hoja en un 5 ml jeringa sin aguja llena de agua, eliminar el aire de la jeringa, y aplicar un vacío al cubrir el orificio de la jeringa con un dedo y tirando del émbolo. <ol><li> Liberar el émbolo suavemente para evitar daños en la sección de la hoja. Repita esto dos o tres veces, o hasta que la mayor parte del aire se ha eliminado y la hoja parece ser de color verde oscuro. NOTA: Este paso elimina el aire de la hoja que puede interferir con la visualización precisa de stromules. </li></ol></li><li> Añadir una gota de agua a un portaobjetos y colocar la hoja en la sección de esta caída. A continuación, añadir otro drop de agua a la parte superior de la hoja, y colocar un cubreobjetos sobre la hoja. Si hay burbujas de aire, golpee suavemente la hoja de la cubierta hasta que se eliminan. El portaobjetos ahora está listo para la microscopía, y debe ser visualizado inmediatamente. </li></ol> 2. Visualizar Stromules con confocal de microscopía de fluorescencia <ol><li> Con luz transmitida, se centran en un campo de visión cerca del centro de la sección de la hoja (lejos de las células dañadas por la cuchilla de afeitar). Utilice un objetivo 20X de modo que muchos cloroplastos pueden ser visualizadas simultáneamente. Guardar una imagen con luz transmitida de modo que los tipos de células se pueden distinguir después, si es necesario. </li><li> Cambiar la fuente de iluminación a un láser con filtros de excitación y emisión apropiados para ser usado fluoróforo. Por ejemplo, excitar GFP con un láser de 488 nm y recoger las emisiones entre 500 nm y 525 nm. <ol><li> El uso de software del microscopio, seleccionar el canal GFP y haga clic para ajustar la apertura del agujero de alfiler de 1 Airy unidad. Seleccionar escaneo láser, para iniciar la visualización de la muestra, y luego haga clic en el canal de GFP para ajustar la intensidad del láser y la ganancia del detector para minimizar la potencia del láser al mismo tiempo visualizar claramente stromules. Una vez que se han determinado estos valores, los mantenga lo más constante posible a lo largo de todos los experimentos. </li></ol></li><li> Preparar un experimento -stack z que recogerá una serie de imágenes a través de la epidermis de la hoja en el campo de visión. <ol><li> Para el -stack z, incluir todos los cloroplastos epidérmicas en el campo de visión para evitar el sesgo (por ejemplo, si los cloroplastos cerca de la superficie de las hojas tienen más stromules en condiciones ensayadas). </li><li> Tomar imágenes en el intervalo máximo posible, que incluirá todos los stromules sino reducir al mínimo el tiempo necesario para que una -stack z. Por ejemplo, si 1 unidad de Airy es equivalente a una sección confocal de enfoque que es 2 m de profundidad, teniendo una imagen cada 2 micras es probable ideal. NOTA: La hoja epidermis es una superficie irregular, por lo que la profundidad total de la z -stack variará dependiendo de la muestra; la mayoría de -stacks z requerirán 10-20 imágenes, pero pueden incluir más. </li><li> Ajustar la velocidad de exploración y la resolución de la imagen si es necesario para asegurarse de que el -stack z es recogida rápidamente (normalmente dentro de 5-10 minutos, si es posible). Guarde el -stack z para su posterior análisis. </li></ol></li></ol> Procesamiento 3. Imagen <ol><li> Determinar la frecuencia stromule usando cualquier software de análisis de imágenes. Para este protocolo, se recomienda utilizar ImageJ, que está disponible públicamente de los Institutos Nacionales de Salud (http://imagej.nih.gov/ij/), o la actualización popular de ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji). </li><li> Combinar la -stack z en una sola imagen con la proyección de intensidad máxima en el software. </li><li> Identificar y contar manualmente todos los cloroplastos en la imagen. </li><li> Para cada cloroplasto, determinar visualmente si una o más stromulesson vistas que se extiende desde el cloroplasto en la imagen de la z fusionada -stack. Para ejemplos, véase la figura 1. NOTA: Dado que no se conocen las funciones biológicas de stromules, ninguna, estroma llenas, extensión tubular delgada del cloroplasto puede ser considerado un &quot;stromule&quot;, independientemente de la longitud. Como regla general, una extensión de estroma llenas desde el cloroplasto es un stromule si es menos de aproximadamente 1 m de diámetro a lo largo de la mayor parte de su longitud 7. Asegúrese de que una persona se analizan todas las imágenes para controlar las diferencias subjetivas en la determinación de si o no un cloroplasto tiene una stromule. Un segundo investigador debe verificar de forma independiente las frecuencias stromule para reducir aún más los sesgos subjetivos. </li></ol> 4. Diseño Experimental y Toma de Muestras NOTA: Stromule frecuencia es muy variable entre las hojas, pero varios informes sugieren que hay poca variación en la frecuencia stromule dentro de un indivi9,17 hoja dual. <ol><li> Calcular la frecuencia hoja stromule de un solo campo de visión de una hoja. Desechar la hoja, y considerar esta una muestra independiente. No considere campos separados de vista de una hoja como muestras independientes. NOTA: No hay un fuerte consenso sobre la forma de mejores miden los cambios en la actividad stromule, y hasta que la función de stromules se define más claramente, los investigadores deben seguir siendo creativa en la cuantificación de la dinámica stromule. Para la comparación a través de la literatura, sin embargo, las normas comunes de presentación de informes se deben utilizar, además de los enfoques más creativos. Como mínimo, siempre informar de la frecuencia de cloroplastos que tienen uno o más stromules. </li><li> Determinar la frecuencia de cloroplastos que tienen stromules en un campo de visión. Utilice ImageJ para identificar todos los cloroplastos en un campo de visión. Entonces, para cada cloroplasto, determinar si el cloroplasto se ha formado al menos un stromule. Informe de frecuencia stromule como el Percentage de los cloroplastos con una stromule. NOTA: Algunos investigadores transforman el porcentaje, por ejemplo, con la transformación arcoseno, antes de informar de frecuencias stromule; mientras que esta es una opción para el análisis estadístico, el arco seno de la frecuencia stromule no es un valor intuitivo, y no necesita ser informado en el texto principal o cifras de un estudio. <ol><li> Como un enfoque alternativo, contar el número total de stromules, y se divide por el número total de los cloroplastos. NOTA: En circunstancias normales, esto va a producir resultados similares de acercarse a 4,2; puede sobreestimar la frecuencia stromule, sin embargo, si un solo cloroplasto ha formado muchos stromules. En el ejemplo mostrado en virtud de los resultados representativos, por ejemplo, varios cloroplastos tienen dos o más stromules, elevando el número de stromules por cloroplasto a 40/87 (en comparación con una frecuencia stromule de 33/87). </li><li> Como alternativa, determinar la longitud stromule lugar de la frecuencia stromule. La longitud se puede mediren ImageJ trazando el stromule con la herramienta de línea a mano alzada. NOTA: Como el papel biológico de stromules sigue siendo desconocida, no está claro que la longitud stromule afecta a su función. Reportar diferencias significativas en la duración stromule si se observan, sino también informar de las frecuencias stromule (como se describe en el apartado 4.2). NOTA: frecuencia Stromule puede ser muy variable entre diferentes hojas en las mismas condiciones de crecimiento. Por lo tanto, aunque la determinación de la frecuencia stromule puede llevar mucho tiempo, los experimentos deben ser cuidadosamente diseñadas para incluir muestras de gran tamaño. El uso de conjuntos de datos de nuestro laboratorio, se determinó que un tamaño de muestra de al menos 16 plantas para cada tratamiento es por lo general suficientemente potente para determinar si hay una diferencia estadísticamente significativa de al menos un cambio de 1,5 veces en la frecuencia stromule entre dos condiciones (con la norma α = 0,05 y β = 0,80). </li></ol></li><li> El análisis estadístico de los resultados. <ol><li> Para comparar el youn stromule frecuencias de dos tratamientos, use la prueba t de Welch (también conocida como la prueba de la prueba t o t heterocedástico suponiendo una varianza desigual). NOTA: Esta prueba no es tan poderoso como prueba de la t de Student convencional, pero la prueba t de Welch es ventajoso porque no asume que la variación en la distribución de frecuencias stromule es similar entre los tratamientos. NOTA: Dado que la frecuencia stromule es una &quot;proporción&quot;, su distribución muestral se prevé que sea binomial en lugar de lo normal, que podrían análisis estadístico teóricamente sesgo si los tamaños de las muestras son muy bajos o si la frecuencia stromule es muy bajo (cerca del 0%) o muy alta (cerca de 100%). Algunos informes han utilizado transformaciones arcoseno antes del análisis estadístico, que está destinado a transformar una distribución binomial a una distribución normal, y así satisfacer los requisitos de la norma de prueba de la t de Student o ANOVA. En la práctica, sin embargo, unarcsine transformaciones tienen poco o ningún efecto sobre el análisis estadístico, y por lo tanto no se recomiendan. En su lugar, repetir los experimentos para aumentar el tamaño de la muestra, lo que aumentará la potencia estadística y reducir los errores en la interpretación de los datos. </li><li> Cualquiera sea el enfoque estadístico se utiliza, asegúrese de informar cuidadosamente la estrategia de muestreo, tamaño de la muestra, prueba estadística, y el valor de p para cada experimento. NOTA: Al igual que con otros campos de la biología, un valor de p inferior a 0,05 se puede considerar &quot;estadísticamente significativa&quot;, aunque los investigadores deben informar sin duda el valor p obtenido precisa. Si p es ligeramente por encima de 0,05, el aumento de tamaño de la muestra con dos o tres experimentos puede ayudar a clarificar si o no la diferencia observada es reproducible y estadísticamente significativa. </li></ol></li></ol> 5. La extracción de cloroplastos intactos para visualizar Stromule Dinámica NOTA: Existen varios métodosse han utilizado para aislar los cloroplastos de las hojas, incluyendo un protocolo ligeramente diferente en un estudio reciente sobre la formación de stromule in vitro 15. El protocolo se detalla a continuación utiliza un método relativamente simple que no dió muestras cloroplasto bioquímicamente puros, pero en lugar aislar una gran cantidad de cloroplastos, sanos intactos 9,18. <ol><li> Preparar tampón de extracción frío: NaOH Hepes 50 mM, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, 1,0 mM MgCl 2, y MnCl 1,0 mM 2. Ajustar el pH a 6,9 con NaOH y HCl, y refrigerar antes de su uso. NOTA: Aunque no es necesario, utilizando tampones fríos y conservación en hielo cuando sea posible dará lugar a una mayor proporción de cloroplastos intactos. </li><li> Preparar tampón de aislamiento: NaOH Hepes 50 mM, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, 1,0 mM MnCl 2, mM MgCl 2 mM, KCl 10, y 1,0 NaCl 1,0 mM. Ajustar el pH a 7,6 con NaOH y HCl y refrigerar antes de su uso. </li><li> Si las hojas no sonexpresar un fluoróforo estromal codificado genéticamente, preparar diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) solución: CFDA 50 mM solución madre en dimetil sulfóxido (DMSO) (2,3 mg CFDA por 1,0 ml DMSO). NOTA: La concentración exacta no es crítica. Mantenga CFDA de valores en la oscuridad en todo momento. Almacenar pequeñas alícuotas de CFDA 50 mM a -20 ° C. </li><li> Para el aislamiento de cloroplastos, retire ~ 5-10 g de hojas de varias plantas y enjuagar brevemente en agua fría. transferir inmediatamente a 50 ml de tampón de extracción en frío. Moler las hojas utilizando una licuadora con varios pulsos cortos. Filtrar a través de dos o tres capas de gasa para eliminar los desechos de la hoja, dividir los cloroplastos extraídos en dos tubos de 50 ml de centrífuga y centrifugar durante 1 min a 750 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender los cloroplastos verdes en tampón de aislamiento 10 ml. Centrifugar de nuevo durante 1 min a 750 xg, desechar el sobrenadante, y los cloroplastos resuspender en tampón de aislamiento para llevar el volumen final a 5 ml. </li><li> Transferencia 201; l de los cloroplastos a una diapositiva, cubrir con un cubreobjetos, y comenzar la microscopía. NOTA: Los cloroplastos de las plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes plastid orientada ahora están listos para la visualización por microscopía de fluorescencia confocal. </li><li> Manchar los cloroplastos de las plantas que no están expresando proteínas fluorescentes plastid orientada para visualizar stromules. <ol><li> Añadir 5 l de 50 mM CFDA a los 5 ml cloroplastos a suspender en tampón de aislamiento. Llevar la concentración final a 50 mM. </li><li> Permitir a los cloroplastos incubar durante 5 minutos, y luego transferir una pequeña alícuota (~ 50 l) a una diapositiva, cubren con un cubreobjetos, y comienzan microscopía. </li><li> Use un filtro para FITC o GFP. Utilice un objetivo de 20X para visualizar muchos cloroplastos de forma simultánea, o un objetivo superior para visualizar un solo cloroplasto aislado. NOTA: CFDA será fluorescente en el interior del estroma de los cloroplastos intactos. </li><li> Si hay una fuerte fluorescencia de fondo, lavar el Chloroplasts de nuevo en 10 ml de tampón de aislamiento después de la 5 min de incubación con CFDA, centrifugar durante 1 min a 750 xg, desechar el sobrenadante, y resuspender en 5 ml de tampón de aislamiento. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Al investigar stromules, tres factores importantes deben ser considerados a lo largo de: (i) la manipulación del tejido de la planta deben mantenerse a un mínimo absoluto, (ii) el sistema experimental debe mantenerse constante, y (iii) las estrategias de muestreo debe ser planeada cuidadosamente para asegurar robusta, se analizan los datos reproducibles. Stromules son muy dinámicas: se pueden extender y retraer rápidamente ante los ojos de un observador bajo el microscopio. Por otra parte, la frecuencia stromule varía significativamente en respuesta a una amplia gama de tratamientos, incluyendo estímulos que no se pueden evitar con el fin de visualizar stromules (tales como heridas hoja). La principal solución a este problema, que se dirige a los protocolos descritos aquí, es llevar a cabo experimentos bien controlados, manteniendo todas las variables consistente. Esto incluye, por ejemplo, la preparación de cada muestra para la visualización inmediatamente antes de llevarlo al microscopio; las plantas no deben ser dañadoshasta inmediatamente antes de su visualización. La segunda solución a este problema es reducir al mínimo la complejidad de los protocolos: idealmente, los tratamientos deben ser aplicados directamente a la planta sin la eliminación de la hoja o causar ningún daño. Stromules se han estudiado en una increíble variedad de especies y tipos de células, incluyendo los pelos radiculares de trigo, frutos de tomate, y las plántulas de tabaco ahiladas 8,19. Estos estudios pioneros avanzaron la comprensión de la dinámica stromule durante el desarrollo de la planta y exploraron la gama de actividades stromule. Dibujo comparaciones de estos diversos sistemas experimentales, sin embargo, puede conducir a errores de interpretación, ya que diferentes tipos de plástidos están involucrados en considerablemente diferentes procesos biológicos. Por ejemplo, los cloroplastos hacen stromules en respuesta al estrés oxidativo causado por la cadena fotosintética de electrones, pero desde leucoplastos carecen de la maquinaria fotosintética, que no son sensibles a la9 mismos estímulos. Cualquier sistema experimental se puede utilizar para investigar stromules, pero el sistema experimental se debe mantener constante durante todo el estudio si las comparaciones son para ser dibujado. Los factores a considerar incluyen la especie, tipo de célula, la etapa de desarrollo o edad de la planta, y el método de tinción stromules (ya sea a través de la expresión estable del transgén, la expresión transgénica transitoria, o un fluoróforo externo); incluso ligeras variaciones de estos factores pueden confundir la interpretación posterior de resultados. Por último, cualquier estudio de la biología stromule debe utilizar un sistema robusto, fiable estrategia de muestreo para asegurar que los resultados son reproducibles y biológicamente relevante. El muestreo en varias ocasiones a partir de una sola planta, por ejemplo, tomando imágenes de varias regiones de una hoja, al parecer, va a mejorar la potencia estadística, pero puede ser engañoso. Como se muestra en los datos representativos por encima de, la frecuencia stromule de una sola hoja puede variar drásticamente de la frecuencia media stromulea través de muchas hojas: en que las hojas, que se visualiza durante el día, 37,9% de los cloroplastos hizo stromules, aunque la frecuencia stromule Medio en todos hojas durante el día fue casi la mitad que, sólo el 20,8%. Por otra parte, teniendo en cuenta lo poco que se sabe acerca de la dinámica stromule en este momento, ningún experimento debe ser replicado por completo al menos tres veces, y más si es posible, para asegurar que las variables imprevistas no son responsables de cualquier cambio en la actividad stromule que se observan. Por encima de todo, ya que el campo de la biología stromule está empezando a despegar, los investigadores deben documentar detalladamente e informar de todos los aspectos del diseño experimental, incluyendo desviaciones creativas de lo simple protocolo descrito aquí.

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast7.
The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles6. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.
Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts10. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Model: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&amp;nbsp;</td><td>Model: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Open-source software for analyzing biological images</td></tr></tbody></table>

visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Este protocolo se utiliza para visualizar la frecuencia stromule en el día y por la noche en los cotiledones de joven N. plántulas benthamiana. Rebanadas de una pila z se fusionaron en una sola imagen (Figura 1A). Para los propósitos visuales, que la imagen fue entonces desaturado y se invierte de manera que el estroma aparece en negro (Figura 1B). Los cloroplastos se marcaron o bien como no tener stromules (asterisco verde) o que tiene al menos un stromule (asterisco magenta). De los 87 cloroplastos epidérmicas visualizados, 33 tienen stromules. Por lo tanto, la frecuencia stromule en esta hoja es 37,9%. El uso de este análisis, el protocolo se repitió durante otros 21 plantas (una hoja por planta) durante el día y un total de 24 plantas en la noche. En el día, la frecuencia media stromule fue 20,8 ± 1,8%; en la noche, la frecuencia media fue de 12,8 ± stromule 0,9% (Figura2). Frecuencia Stromule fue significativamente mayor durante el día, según lo determinado por la prueba t de Welch (n ≥ 22, p &lt;0,0005). Tenga en cuenta que si bien se observaron más de 23.000 cloroplastos y varios cientos de células, el tamaño de la muestra, n, se reporta como 22, el número de plantas independientes examinó. Utilizando el protocolo descrito aquí, no se observaron stromules cloroplasto in vitro tras el aislamiento a partir de hojas de N. benthamiana que expresan GFP plastid orientada (Figura 3A), o después de usar CFDA para teñir los cloroplastos aislados de N. benthamiana (Figura 3B) o Spinacia oleracea (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig1.jpg" /> Figura 1. Cuantificación de frecuencia stromule en N. benthhojas amiana. (A) A z -stack de un campo de vista parcial de la epidermis de N. benthamiana que expresan GFP estromal se fusionó para mostrar todos los cloroplastos epidérmicas y stromules en una sola imagen. (B) La imagen se convirtió en blanco y negro y se invierte para los propósitos visuales. Los cloroplastos con stromules se indican con un asterisco magenta; cloroplastos sin stromules se indican con un asterisco verde. Las barras de escala representan 10 micras. Modificado de Brunkard et al. 9 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de la frecuencia stromule a través de condiciones. Se utilizó este protocolo para determinar el stromule frecuencia de 22 plantas en el día y 24 plantas por la noche. Stromule frecuencia fue significativamente mayor durante el día que durante la noche (prueba de la t de Welch, n ≥ 22, p &lt;0,0005). Las barras de error indican el error estándar. Modificado de Brunkard et al. 9 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización stromules después de extraer los cloroplastos de las hojas intactas. (A) Los cloroplastos de N. transgénico benthamiana deja GFP expresada (verde) dirigida al cloroplasto se aislaron utilizando los protocolos descritos aquí. (B) Los cloroplastos se aislaron de tipo salvaje de N. benthamiana hojas y se tiñó con CFDA, que fluoresces sólo dentro de los cloroplastos intactos, viables (que se muestran en amarillo). (C) Los cloroplastos también se pueden aislar de otras especies de plantas, tales como la espinaca (S. oleracea) y, a continuación, se tiñeron con CFDA (amarillo). autofluorescencia la clorofila se muestra en rojo. Modificado de Brunkard et al. 9

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Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.0K vistas.  USDA. Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Video: Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Investigación

Genética

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Bioingeniería

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Inmunología e Infección

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Bioquímica

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biología

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluorescencia-lapse de imágenes de la completa<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo de Vida El uso de un dispositivo de microfluidos

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Resumen

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