Name: visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

J.O.B. and A.M.R. were supported by predoctoral fellowships from the National Science Foundation.

HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir auf Testen Stromulus Frequenz in der Epidermis von N. fokussiert benthamiana verlässt. Mehrere stabile transgene Linien erzeugt worden , die für diesen Zweck verwendet werden können, einschließlich 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 und NRIP1: Cerulean 6. Beide Linien zeigen robuste Expression von Fluorophoren in den Chloroplasten Stroma der Blätter unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen. Alternativ Chloroplasten-bezogene Fluorophore transient in N. ausgedrückt werden kann benthamiana unter Verwendung von Agrobacterium - Transformationen 13. Dies ist weniger ideal als die transgenen Linien, da einige basalen Abwehrreaktionen in N. induzieren Agrobacterium Infiltrationen benthamiana und Wechselwirkungen mit Agrobacterium kann Stromulus Frequenz in dem Blatt 14, die möglicherweise zu verkomplizieren Interpretation der Ergebnisse zu ändern. Schließlich Stromulus Bildung in vitro zu visualisieren,Chloroplasten können aus jeder beliebigen Pflanzenspezies, entweder genetisch codierten Fluorophore oder einen fluoreszierenden Farbstoff extrahiert werden, wie in Kapitel 5 unten. 9,15 HINWEIS:. Detaillierte Beschreibung der Methoden für Pflanzenanbau wurden bereits beschrieben 16 Kurz gesagt, wachsen N. benthamiana Pflanzen in 4 &quot;Töpfe mit jeder professionellen Bodenmischung gefüllt , die eine gute Drainage zur Verfügung stellt. Decken Sie Sämlinge mit einem durchsichtigen Kunststoff - Kuppel in den ersten 10 bis 14 Tage , um eine feuchte Umgebung für die Keimung zur Verfügung zu stellen. In jedem Standard - Dünger - Mix Anweisungen folgen Herstellers zu 14- Tage alten Pflanzen. wachsen Pflanzen unter weißem Licht, mit ~ 100 &amp; mgr; mol Photonen m -2 s -1 Lichtintensität. Wasserpflanzen regelmäßig. 1. Vorbereiten Blattproben für Visualisierung HINWEIS: Stromulus Dynamik durch Verwundung 8 betroffen, so sollten Gewebepräparation sofort durchgeführt werden , bevor Stromulus Visualisierungs durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Idealerweise sollte eine Probe mit 15 min nach Entnahme aus der Anlage visualisiert werden. <ol><li> Schneiden Sie einen kleinen Abschnitt des Blattes eine sehr scharfe Rasierklinge. Verwenden Sie immer den gleichen Bereich des Blattes für Konsistenz, und sicher sein, die gleiche Oberfläche (adaxial oder abaxial) in allen Versuchen zu visualisieren. </li><li> Unmittelbar nach dem Blattschneidabschnitt, die Blattabschnitt in einem 5 ml nadellose Spritze mit Wasser gefüllt unterzutauchen Entfernen von Luft aus der Spritze und ein Vakuum anzuwenden, indem die Spritzenöffnung mit einem Finger abdecken und den Kolben zu ziehen. <ol><li> Lassen Sie den Kolben sanft zu vermeiden, dass die Blattabschnitt zu beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- oder dreimal, oder bis die meisten der Luft entfernt worden ist und das Blatt erscheint tiefgrün sein. Hinweis: Dieser Schritt Luft in dem Blatt entfernt, die genaue Visualisierung von stromules stören können. </li></ol></li><li> Fügen Sie einen Tropfen Wasser zu einer Folie und legen Sie den Blattabschnitt auf diesen Rückgang. Dann fügen Sie eine weitere drop Wasser an die Spitze des Blattes, und legen Sie eine Deckglas über das Blatt. Wenn es irgendwelche Luftblasen sind, vorsichtig das Deckglas klopfen, bis sie entfernt werden. Der Schlitten ist nun bereit für die Mikroskopie und sollten sofort sichtbar gemacht werden. </li></ol> 2. Visualizing Stromules mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Mit durchgehendem Licht, konzentrieren sich auf ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Blattes Abschnitt (weg von den durch die Rasierklinge geschädigte Zellen). Verwenden Sie ein 20x-Objektiv, so dass viele Chloroplasten gleichzeitig sichtbar gemacht werden kann. Speichern eines Bildes mit Durchlicht, so dass Zelltypen später unterschieden werden kann, falls erforderlich. </li><li> Schalten Sie die Beleuchtungsquelle einen Laser mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern für das Fluorophor verwendet wird. Beispielsweise GFP mit einem 488 nm Laser erregt und Emissionen zwischen 500 nm und 525 nm erhalten. <ol><li> Mit Hilfe der Software des Mikroskops, wählen Sie die GFP-Kanal und klicken Sie auf die Lochblende auf 1 Ai einzustellenry Einheit. Wählen Sie Laserscanning, starten die Probe zu visualisieren, und klicken Sie dann auf das GFP-Kanal, um die Laserintensität einzustellen und die Detektorverstärkung der Laserleistung zu minimieren, während immer noch deutlich stromules zu visualisieren. Sobald diese Einstellungen festgelegt worden sind, halten sie so konsequent wie möglich in allen Experimenten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine z -stack Experiment , das eine Reihe von Bildern durch die Blattepidermis im Sichtfeld sammeln. <ol><li> Für die z -stack, umfassen alle epidermalen Chloroplasten in dem Sichtfeld Verzerrungen zu vermeiden (zum Beispiel, wenn die Chloroplasten in der Nähe der Blattoberfläche mehr stromules unter Bedingungen getestet haben). </li><li> Nehmen Bilder mit der maximalen Intervall möglich , dass alle stromules beinhalten wird , aber minimiert die Zeit für eine z -stack erforderlich. Wenn zum Beispiel 1 Airy Einheit entspricht einem fokussierten konfokalen Abschnitt, der 2 &amp; mgr; m tief ist, um ein Bild nehmen alle 2 &amp; mgr; m wahrscheinlich ideal ist. HINWEIS: Das Blatt epidermis ist eine unebene Oberfläche, so dass die Gesamttiefe der z -stack auf der Probe abhängig variieren; die meisten z -stacks werden 10-20 Bilder erfordern, kann aber mehr beinhalten. </li><li> Passen Scangeschwindigkeit und Bildauflösung als notwendig , um sicherzustellen , dass die z -stack schnell gesammelt wird ( in der Regel innerhalb von 5-10 min, wenn möglich). Speichern Sie die z -stack für eine spätere Analyse. </li></ol></li></ol> 3. Bildverarbeitung <ol><li> Bestimmen Sie Stromulus Frequenz unter Verwendung eines beliebigen Bildanalyse-Software. Für dieses Protokoll, empfehlen wir die Verwendung ImageJ, die von der National Institutes of Health öffentlich zugänglich ist (http://imagej.nih.gov/ij/) oder dem beliebten Upgrade von ImageJ, Fidschi (http://fiji.sc / Fidschi). </li><li> Zusammenführen der z -stack in einem einzigen Bild die maximale Intensitätsprojektion in der Software. </li><li> Identifizieren und von Hand alle Chloroplasten im Bild zu zählen. </li><li> Für jede Chloroplasten bestimmen visuell, ob ein oder mehrere stromulessind zu sehen in der fusionierten z -stack Bild von den Chloroplasten erstreckt. Beispiele siehe Abbildung 1. Hinweis: Da die biologischen Funktionen von stromules nicht bekannt sind, jede dünne, Stroma gefüllten, röhrenförmige Verlängerung aus dem Chloroplast kann ein &quot;Stromulus&quot; angesehen werden, unabhängig von der Länge. Als allgemeine Regel wird ein Stroma gefüllte Verlängerung von der Chloroplast ist ein Stromulus wenn es weniger als etwa 1 um im Durchmesser über den grßten Teil seiner Länge 7 ist. Stellen Sie sicher, dass eine Person alle Bilder Analysen zur subjektiven Unterschiede zur Kontrolle bei der Bestimmung, ob ein Chloroplasten ein Stromulus hat. Ein zweiter Forscher sollten die Stromulus Frequenzen unabhängig überprüfen zu weiteren subjektive Vorurteile reduzieren. </li></ol> 4. Experimentelles Design und Sampling HINWEIS: Stromulus Frequenz ist sehr variabel zwischen Blättern, aber mehrere Berichte deuten darauf hin, daß es wenig Variation in Stromulus Frequenz innerhalb eines indiviDoppelblatt 9,17. <ol><li> Berechne die Blatt Stromulus Frequenz von einem einzigen Sichtfeld eines Blattes. Nehmen Sie das Blatt, und betrachten dies eine unabhängige Probe. Achten Sie nicht auf separaten Sichtfelder von einem Blatt als unabhängige Stichproben. HINWEIS: Es gibt keinen Konsens darüber, wie man am besten messen Veränderungen in Stromulus Aktivität, und bis die Funktion von stromules mehr klar definiert, Forscher sollten weiterhin bei der Quantifizierung Stromulus Dynamik, kreativ zu sein. Zum Vergleich: in der Literatur sollten jedoch gemeinsame Standards für die Berichterstattung zusätzlich zu mehr kreative Ansätze verwendet werden. Bei einem Minimum, können immer die Frequenz von Chloroplasten, die eine oder mehrere stromules haben. </li><li> Bestimmen Sie die Häufigkeit der Chloroplasten, die stromules in einem Sichtfeld haben. Verwenden ImageJ um alle Chloroplasten identifizieren, in einem Sichtfeld. Dann wird für jede Chloroplasten, bestimmen, ob die Chloroplasten mindestens eine Stromulus gebildet hat. Bericht Stromulus Frequenz wie die Percentage von Chloroplasten mit einem Stromulus. ANMERKUNG: Manche Forscher Transformations den Prozentsatz, beispielsweise mit dem Arcussinus-Transformation vor Stromulus Frequenzen Berichterstattung; Während dies eine Option für die statistische Analyse, ist die Arkussinus Stromulus Frequenz nicht ein intuitives Wert und muss nicht im Haupttext oder Zahlen einer Studie berichtet werden. <ol><li> Als alternativer Ansatz, die Gesamtzahl der stromules zählen und teilen sie durch die Gesamtzahl der Chloroplasten. HINWEIS: In den meisten Fällen diese ähnliche Ergebnisse liefern wird 4.2 zu nähern; es kann die Stromulus Frequenz, aber überschätzen, wenn ein einzelner Chloroplasten viele stromules gebildet hat. Im Beispiel unter repräsentativen Ergebnisse gezeigt, haben beispielsweise mehrere Chloroplasten zwei oder mehr stromules, die Anzahl der pro stromules Chloroplasten zu 40/87 Anhebung (im Vergleich zu einer Stromulus Frequenz von 33/87). </li><li> Alternativ bestimmen die Stromulus Länge anstelle von Stromulus Frequenz. Länge gemessen werdenin ImageJ durch die Stromulus mit dem freihändig Zeilen-Tool zu verfolgen. HINWEIS: Da die biologische Rolle von stromules unbekannt bleibt, ist es nicht klar, dass Stromulus Länge ihrer Funktion beeinträchtigt. Bericht erhebliche Unterschiede in Stromulus Länge, wenn sie beobachtet werden, sondern auch die Stromulus Frequenzen aus (wie in 4.2 beschrieben). HINWEIS: Stromulus Frequenz kann zwischen verschiedenen Blättern unter den gleichen Wachstumsbedingungen stark variieren. Daher wird, obwohl Stromulus frequenzbestimmendes kann sollten sorgfältig große Probengrößen enthalten ausgelegt werden zeitraubend, Experimente sein. Mit Datensätze aus unserem Labor haben wir festgestellt, dass eine Stichprobengröße von mindestens 16 Pflanzen für jede Behandlung in der Regel stark genug ist, um zu bestimmen, ob es einen statistisch signifikanten Unterschied von mindestens einem 1,5-fache Veränderung der Stromulus Frequenz zwischen zwei Zuständen ist (mit Standard α = 0,05 und β = 0,80). </li></ol></li><li> Die statistische Analyse der Ergebnisse. <ol><li> Zum Vergleich der mirein Stromulus Frequenzen von zwei Behandlungen, verwenden Sie die t - Test Welch (auch als heteroscedastic t - Test oder t - Test unter der Annahme , ungleiche Varianz bekannt). HINWEIS: Dieser Test ist nicht so mächtig wie die t - Test herkömmlichen Student, aber Welch t - Test ist vorteilhaft , da sie nicht davon ausgehen , dass die Varianz in Stromulus Häufigkeitsverteilung zwischen den Behandlungen ähnlich ist. HINWEIS: Da Stromulus Frequenz ein &quot;Verhältnis&quot;, wird seine Stichprobenverteilung vorhergesagt binomischen zu sein, anstatt normal, die Skew statistische Analyse theoretisch könnte, wenn Probengrößen sehr niedrig sind oder wenn Stromulus Frequenz ist sehr gering (nahe 0%) oder sehr hoch (nahezu 100%). Einige Berichte haben verwendet Arkussinus Transformationen vor der statistischen Analyse, die dazu bestimmt ist binomialverteilt zu einer Normalverteilung zu transformieren und damit die Standardanforderungen eines Studenten-t - Test oder ANOVA erfüllen. In der Praxis wird jedoch einrcsine Transformationen haben wenig oder keine Wirkung auf die statistische Analyse, und werden daher nicht empfohlen. Stattdessen wiederholen Experimente Probengröße zu erhöhen, was die statistische Aussagekraft zu erhöhen und reduzieren Fehler bei der Interpretation der Daten. </li><li> Was auch immer statistischer Ansatz verwendet wird, sollten Sie sorgfältig zu berichten über die Strategie der Probenahme, Probengröße, statistischen Test, und p - Wert für jedes Experiment. Hinweis: Wie bei anderen Bereichen der Biologie, einen p - Wert von weniger als 0,05 betrachtet werden kann &quot;statistisch signifikant&quot;, obwohl Forscher sicherlich die genaue p - Wert erhalten berichten. Wenn p etwas über 0,05 ist, kann die Stichprobengröße mit zwei oder drei Versuchen zu erhöhen helfen , zu klären , ob der beobachtete Unterschied ist reproduzierbar und statistisch signifikant. </li></ol></li></ol> 5. Extrahieren von Intact Chloroplasten Stromulus Dynamics zu visualisieren HINWEIS: Mehrere Methodeneinem etwas anderes Protokoll zu isolieren Chloroplasten von Blättern verwendet werden, einschließlich in einer aktuellen Studie über Stromulus Bildung in vitro 15 wurden. Das Protokoll detailliert unten verwendet eine relativ einfache Methode , die nicht biochemisch reinen Chloroplasten Proben nicht fließt, sondern hat stattdessen eine große Menge an intakten, gesunden Chloroplasten 9,18 isolieren. <ol><li> Bereiten kalten Extraktionspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl 2 und 1,0 mM MnCl 2. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit NaOH und HCl, und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch. HINWEIS: Obwohl es nicht notwendig, kalte Puffern und Proben auf Eis zu halten, wenn möglich, einen höheren Anteil an intakten Chloroplasten ergibt. </li><li> Bereiten Sie Isolationspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbit, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl 2, 1,0 mM MgCl 2, 10 mM KCl und 1,0 mM NaCl. Der pH-Wert auf 7,6 mit NaOH und HCl und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch. </li><li> Wenn die Blätter sind nichteine genetisch kodierte Stromatumoren Fluorophore, bereiten Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) Lösung zum Ausdruck: 50 mM CFDA-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) (2,3 mg CFDA pro 1,0 ml DMSO). HINWEIS: Die genaue Konzentration ist nicht kritisch. Halten Sie CFDA Lager im Dunkeln zu allen Zeiten. Speichern von kleinen Aliquots von 50 mM CFDA bei -20 ° C. </li><li> Zur Isolierung Chloroplasten, entfernen ~ 5-10 g Blätter von verschiedenen Pflanzen und spülen Sie kurz in kaltem Wasser. Ab sofort übertragen zu 50 ml kaltem Extraktionspuffer. Grind Blätter einen Mixer mit mehreren kurzen Impulsen. Man filtriert durch zwei oder drei Schichten Seihtuch Blattreste zu entfernen, unterteilen die extrahierte Chloroplasten in zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren für 1 min bei 750 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren die grünen Chloroplasten in 10 ml Isolationspuffer. Zentrifuge erneut für 1 min bei 750 xg, Überstand verwerfen und Resuspension Chloroplasten in Isolationspuffer Endvolumen auf 5 ml zu bringen. </li><li> Transfer 201; l der Chloroplasten zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie. HINWEIS: Chloroplasten aus transgenen Pflanzen plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, sind nun bereit für die Visualisierung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Stain Chloroplasten von Pflanzen, die nicht plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine ​​exprimieren stromules zu visualisieren. <ol><li> In 5 ul 50 mM CFDA Lager zu den 5 ml in Isolationspuffer-Chloroplasten suspendiert. Bringen Sie die Endkonzentration auf 50 &amp; mgr; M. </li><li> Lassen Sie Chloroplasten für 5 min inkubiert und dann übertragen Sie eine kleine Teilmenge (~ 50 &amp; mgr; l) zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie. </li><li> Verwenden Sie ein FITC oder GFP-Filtersatz. Verwenden Sie ein 20X Ziel vieler Chloroplasten gleichzeitig sichtbar zu machen, oder ein höheres Ziel, einen einzelnen isolierten Chloroplasten zu visualisieren. HINWEIS: CFDA innerhalb des Stroma von intakten Chloroplasten fluoresziert. </li><li> Wenn es eine starke Hintergrundfluoreszenz, waschen Sie die chloroplasts wieder in 10 ml Isolationspuffer nach der 5 min Inkubation mit CFDA, Zentrifuge für 1 min bei 750 · g, Überstand verwerfen und Resuspension in 5 ml Isolationspuffer. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Koussevitzky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+chloroplasts+converge+to+regulate+nuclear+gene+expression.">Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression.</a> Science. 316 (5825), 715-719 (2007).</li><li>Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNAS+Plus:+Organelle-nucleus+cross-talk+regulates+plant+intercellular+communication+via+plasmodesmata.">PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).</li><li>Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+states+of+plastids+and+mitochondria+differentially+regulate+intercellular+transport+via+plasmodesmata.">Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata.</a> Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).</li><li>Nomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast-mediated+activation+of+plant+immune+signalling+in+Arabidopsis.">Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis.</a> Nat. Commun. 3, 926 (2012).</li><li>Avenda&#241;o-V&#225;zquez, A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncharacterized+apocarotenoid-derived+signal+generated+in+&#950;-carotene+desaturase+mutants+regulates+leaf+development+and+the+expression+of+chloroplast+and+nuclear+genes+in+Arabidopsis.">An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in &#950;-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).</li><li>Caplan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+stromules+runction+during+innate+immunity.">Chloroplast stromules runction during innate immunity.</a> Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).</li><li>Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromules:+recent+insights+into+a+long+neglected+feature+of+plastid+morphology+and+function.">Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).</li><li>Gray, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+stromules+are+induced+by+stress+treatments+acting+through+abscisic+acid.">Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid.</a> Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).</li><li>Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplasts+extend+stromules+independently+and+in+response+to+internal+redox+signals.">Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).</li><li>Dupree, P., Pwee, K. -. H., Gray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+photosynthesis+gene-promoter+fusions+in+leaf+epidermal+cells+of+transgenic+tobacco+plants.">Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants.</a> Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).</li><li>Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+and+loss+of+photosynthetic+membranes+during+plastid+differentiation+in+the+shoot+apex+of+Arabidopsis.">Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).</li><li>Chiang, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+GATA+transcription+factors+GNC+and+CGA1+reveals+their+key+role+in+chloroplast+development,+growth,+and+division+in+Arabidopsis.">Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).</li><li>Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Kl&#246;sgen, R. B., Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+stromule+branching+coincides+with+contiguous+endoplasmic+reticulum+dynamics.">Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).</li><li>Erickson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-derived+cytokinin+influences+plastid+morphology+and+starch+accumulation+in+Nicotiana+benthamiana+during+transient+assays.">Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).</li><li>Ho, J., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+stromules+in+vitro+from+chloroplasts+isolated+from+Nicotiana+benthamiana.">The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana.</a> PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).</li><li>Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+plasmodesmata+genetics+with+virus-induced+gene+silencing+and+an+Agrobacterium-mediated+GFP+movement+assay.">Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay.</a> Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).</li><li>Schattat, M. H., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stromule+formation+by+extracellular+sucrose+and+glucose+in+epidermal+leaf+tissue+of+Arabidopsis+thaliana.">Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).</li><li>Joly, D., Carpentier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+intact+chloroplasts+from+spinach+leaves.">Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves.</a> Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).</li><li>Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromule+formation+is+dependent+upon+plastid+size,+plastid+differentiation+status+and+the+density+of+plastids+within+the+cell.">Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell.</a> Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wenn stromules untersuchen, drei wichtige Faktoren müssen in allen in Betracht gezogen werden: (i) Manipulation des Pflanzengewebes muss auf ein absolutes Minimum beschränkt werden, (ii) das experimentelle System muss konsistent gehalten werden, und (iii) Probenahmestrategien sorgfältig geplant werden müssen, um sicherzustellen, robust, sind reproduzierbare Daten analysiert. Stromules sind bemerkenswert dynamisch: sie, bevor ein Beobachter die Augen unter dem Mikroskop schnell ein- und ausfahren kann. Zudem variiert Stromulus Frequenz signifikant in Reaktion auf eine Vielzahl von Behandlungen, einschließlich der Stimuli, die nicht vermieden werden kann, um stromules (wie Blatt Verwundung) visualisieren. Die primäre Lösung für dieses Problem, das mit den hier beschriebenen Protokolle adressiert wird, ist gut kontrollierte Experimente durchzuführen, wobei alle Variablen konsistent. Dazu gehören beispielsweise jede Probe zur Visualisierung Vorbereitung unmittelbar bevor es dem Mikroskop zu bringen; Pflanzen nicht beschädigt werden,bis unmittelbar vor Visualisierung. Die zweite Lösung für dieses Problem ist die Komplexität der Protokolle zu minimieren: Im Idealfall werden alle Behandlungen sollten ohne Entfernen des Blattes oder verursacht Schaden direkt auf die Pflanze aufgebracht werden. Stromules wurden in einer verwirrenden Vielzahl von Arten und Zelltypen, einschließlich Weizenwurzelhaare, Tomatenfrüchten und etiolated Tabak Setzlinge 8,19 sucht. Diese Pionierarbeiten voran das Verständnis der Stromulus Dynamik der Pflanzenentwicklung und erforscht den Bereich der Stromulus Aktivität. Zeichnung Vergleiche von diesen verschiedenen experimentellen Systemen können jedoch zu Fehlinterpretationen führen, da verschiedene Arten von Plastiden in deutlich verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind. Beispielsweise Chloroplasten machen stromules in Reaktion auf oxidativen Stress, der durch die photosynthetischen Elektronenkette verursacht, aber da Leukoplasten photo Maschinen fehlt, sind sie auf die nicht empfindlichgleiche Reize 9. Jede Versuchssystem verwendet werden stromules zu untersuchen, aber die Versuchssystem muss während der gesamten Studie konsistent gehalten werden, wenn irgendwelche Vergleiche gezogen werden. Faktoren zu berücksichtigen Spezies, Zelltyp, Entwicklungsstadium oder dem Alter der Pflanze und ein Verfahren zur Färbung stromules (entweder durch stabile Transgen-Expression, vorübergehende Transgen-Expression oder eine externe Fluorophore) umfassen; sogar leichte Variationen dieser Faktoren kann später die Interpretation der Ergebnisse durcheinander bringen. Schließlich muss jede Studie von Stromulus Biologie eine robuste, zuverlässige Probenahmestrategie verwenden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse sind reproduzierbar und biologisch relevant. Sampling wiederholt aus einer einzigen Anlage, beispielsweise Aufnahme von Bildern aus verschiedenen Regionen eines Blattes, wird offenbar statistische Aussagekraft zu verbessern, kann aber irreführend sein. Wie oben in den repräsentativen Daten gezeigt, kann die Stromulus Frequenz eines einzelnen Blattes dramatisch von der mittleren Frequenz variieren Stromulusüber viele Blätter: in diesem Blatt, das während des Tages, 37,9% der Chloroplasten aus stromules, obwohl die mittlere Frequenz über Stromulus Blätter während des Tages fast die Hälfte, nur 20,8% betrug visualisiert wurde. Darüber hinaus gegeben, wie wenig über Stromulus Dynamik zu diesem Zeitpunkt bekannt ist, sollte jeder Versuch völlig mindestens dreimal wiederholt werden, und wenn möglich, um sicherzustellen, dass unvorhergesehene Variablen für alle Änderungen in Stromulus Aktivität verantwortlich sind, die beobachtet werden. Vor allem, da nur die Stromulus Biologie Feld zu starten beginnt, sollten die Forscher sorgfältig dokumentieren und alle Aspekte des experimentellen Designs berichten, einschließlich kreative Abweichungen von dem einfachen Protokoll hier beschrieben.

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast7.
The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles6. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.
Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts10. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Model: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&amp;nbsp;</td><td>Model: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Open-source software for analyzing biological images</td></tr></tbody></table>

visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Dieses Protokoll wurde verwendet , Stromulus Frequenz am Tag sichtbar zu machen und in der Nacht in den Kotyledonen der jungen N. benthamiana Sämlinge. Scheiben von einem z- Stapel wurden in einem einzigen Bild (Abbildung 1A) verschmolzen. Zur visuellen Zwecken wurde das Bild dann entsättigt und invertiert , so daß Stroma erscheint schwarz (1B). Die Chloroplasten wurden beschriftet entweder als keine stromules mit (grüner Stern) oder mit mindestens einem Stromulus (Magenta Stern). Von den 87 epidermalen Chloroplasten sichtbar gemacht, haben 33 stromules. Somit ist die Frequenz in diesem Stromulus Blatt 37,9%. Mit dieser Analyse wurde das Protokoll für weitere 21 Pflanzen wiederholt (ein Blatt pro Pflanze) während des Tages und insgesamt 24 Pflanzen in der Nacht. An dem Tag war der durchschnittliche Stromulus Frequenz 20,8 ± 1,8%; in der Nacht, war die durchschnittliche Stromulus Frequenz von 12,8 ± 0,9% (Abbildung2). Stromulus Frequenz war während des Tages deutlich höher, wie der t - Test bestimmt Welch (n ≥ 22, p &lt;0,0005). Beachten Sie, dass , obwohl mehr als 23.000 Chloroplasten und mehrere hundert Zellen beobachtet wurden, die Stichprobengröße, n, wird als 22 berichtet, untersucht die Anzahl der unabhängigen Pflanzen. Nach der Isolierung aus Blättern von N. Mit dem Protokoll hier beschriebenen Chloroplasten stromules wurden in vitro beobachtet benthamiana plastidenspezifische gezielte GFP (3A) exprimieren, oder nach CFDA mit Chloroplasten von N. isoliert zu färben benthamiana (3B) oder Spinacia oleracea (3C). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig1.jpg" /> Abbildung 1. Quantifizieren Stromulus Frequenz in N. benthamiana Blätter. (A) A z -stack aus einem Teilsichtfeld der Epidermis von N. benthamiana exprimierenden Stromatumoren GFP wurde fusionierte alle epidermalen Chloroplasten und stromules in einem einzigen Bild zu zeigen. (B) Dieses Bild wurde umgewandelt in Schwarzweiß und für visuelle Zwecke invertiert. Chloroplasten mit stromules werden durch einen Magenta * gekennzeichnet; Chloroplasten ohne stromules sind mit einem grünen Sternchen gekennzeichnet. Maßstabsbalken repräsentieren 10 &amp; mgr; m. Geändert von Brunkard et al. 9 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleicht man Stromulus Frequenz über Bedingungen. Dieses Protokoll wurde verwendet , um die str zu bestimmenOmule Frequenz in 22 Anlagen in den Tag und 24 Pflanzen in der Nacht. Stromulus Frequenz war im Laufe des Tages deutlich höher als in der Nacht (Welch-t - Test, n ≥ 22, p &lt;0,0005). Fehlerbalken zeigen Standardfehler. Geändert von Brunkard et al. 9 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54692/54692fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54692/54692fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualizing stromules nach intakten Chloroplasten aus den Blättern extrahiert wird . (A) Chloroplasten aus transgenen N. benthamiana Blätter ausgedrückt GFP (grün) auf den Chloroplasten gezielt wurden unter Verwendung der beschriebenen Protokolle hier isoliert. (B) Chloroplasten wurden aus Wildtyp N. isoliert benthamiana Blätter und gefärbt mit CFDA, die Fluoresces nur innerhalb intakten, lebensfähigen Chloroplasten (gelb dargestellt). (C) Chloroplasten können auch aus anderen Pflanzenarten, wie Spinat (S. oleracea) isoliert werden und dann mit CFDA (gelb) gefärbt. Chlorophyll ist die Autofluoreszenz in rot dargestellt. Geändert von Brunkard et al. 9

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

visualizing-stromule-frequency-with-fluorescence-microscopy

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.0K Aufrufe.  USDA. Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Serie: Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Forschung

Genetik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Biotechnik

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Immunologie und Infektion

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Biochemie

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologie

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung des kompletten<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle Mikrofluidikvorrichtung Verwendung

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video